安羅替尼對肺癌細胞A549增殖、凋亡的影響及對PI3K/AKT通路的調控

鄧雙年 李娟 李輝

摘 要：基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路探究安羅替尼對A549細胞增殖、凋亡的影響。將A549細胞分為對照組、各劑量試驗組、安羅替尼組、陽性藥物組、抑制劑組和激活劑組。干預24 h后檢測A549細胞活力、細胞形態、增殖率、凋亡情況及相關蛋白的表達水平。結果顯示：20 μmol/L安羅替尼處理后，A549細胞活力降低；安羅替尼組和陽性藥物組較對照組A549細胞生長受到抑制，細胞增殖率、細胞周期素D1（Cyclin D1）及p-PI3K、p-AKT的表達水平降低，細胞凋亡數量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達水平升高。抑制劑增強了上述各指標的變化，而激活劑則具有與抑制劑相反的趨勢。該研究結果說明，安羅替尼可顯著抑制人肺癌A549細胞的增殖并促進其凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT通路的信號轉導相關。該研究結果進一步說明了安羅替尼作為抗肺癌藥物的潛在價值，為抗肺癌藥物的研發提供了新的理論基礎。

關鍵詞：安羅替尼；肺癌；激酶信號通路；增殖；凋亡

中圖分類號：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.009

Effect of Anlotinib on Proliferation and Apoptosis of Lung Cancer cell A549 and Regulation of PI3K/AKT Pathway

DENG Shuangniana*， LI Juanb， LI Huic

（Linfen Peoples Hospital ?a. Department of Oncology; b. Department of Gastroenterology; c. Department of Thoracic Surgery， Linfen 041000， China）

Abstract： To investigate the effects of anlotinib on proliferation and apoptosis of A549 cells based on phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/serine-threonine protein kinase （AKT） signaling pathway. A549 cells were divided into the control group， the experimental groups with different doses， the anlotinib group， the positive drug group， the inhibitor group and the activator group. The intervention time was 24 hours. The cell viability， cell morphology， the rate of proliferation， apoptosis and related protein expression levels were detected. The results showed that cell viability decreased after treatment with 20 μmol/L anlotinib. Compared with the control group， the cell growth of anlotinib group and positive drug group was inhibited， the cell proliferation rate， cysteinyl aspartate specific proteinase D1 （Cyclin D1） ?and the expression levels of p-PI3K and p-AKT decreased， and the number of apoptosis cells and the expression of cysteine aspartic protease-3 （Caspase-3） increased. The inhibitor enhanced these changes， while the activator had the opposite trend to the inhibitor. These results of this study indicate that anlotinib can significantly inhibit the proliferation and promote apoptosis of A549 cells， and its mechanism might be related to the inhibition of PI3K/AKT pathway signal transduction. The results of this study further illustrate the potential value of antilung cancer drugs and provide a new theoretical basis for the research and development of anti-lung cancer drugs.

Key words： anlotinib; lung cancer; kinase signaling pathway; proliferation; apoptosis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（4）： 360-367）

肺癌（lung cancer）為常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在我國居于首位［1］。早中期肺癌因臨床癥狀不明顯易誤診、漏診，往往發現時已為晚期，因其放、化療效果不盡如人意，通常采用手術切除，然而手術切除預后較差，極易復發［2］，故尋找新的有效治療肺癌的方法和靶點具有重要意義。安羅替尼（anlotinib）是一種多激酶的抑制劑，由我國正大天晴藥業集團自主研發，在2018年首次被批準用于非小細胞肺癌的三線治療用藥，在晚期非小細胞肺癌患者中已展示出較好的療效。研究表明，安羅替尼可能逆轉吉非替尼耐藥［3］。除此之外，安羅替尼可有效抑制成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）和血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）等激酶［4-5］，還可以通過抑制與癌細胞增殖和轉移相關的信號通路，進而實現對癌細胞的直接抑制作用［6-7］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（seronine protein kinase，AKT）信號通路可參與介導多種腫瘤細胞惡性生物學行為，同時也能夠調控非小細胞肺癌的發生發展，從而抑制PI3K/AKT信號通路，增強對腫瘤治療的效果，提高化療的敏感性［8-9］。關于安羅替尼介導PI3K/AKT信號通路對肺癌的作用研究鮮有報道，因此，本研究旨在探究安羅替尼通過PI3K/AKT信號通路對A549細胞增殖、凋亡的調控作用，為肺癌的臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞株A549細胞（上海富衡生物科技有限公司-富衡細胞庫）；安羅替尼（正大天晴藥業集團），順鉑、PI3K/AKT抑制劑（LY294002）、PI3K/AKT激活劑（SC79）（源葉，中國），胎牛血清（成都，維克奇），F-12K培養基、RIPA裂解液（碧云天公司），活細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（菲恩生物公司），Hoechst 33258染色試劑盒（百奧萊博公司），EdU細胞增殖檢測試劑盒（銳博生物公司），鼠抗人［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic protease-3，Caspase-3）、細胞周期素D1（cysteinyl aspartate specific proteinase D1，Cyclin D1）、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT及β-actin一抗］、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）（艾柏森公司）；DXS_3型倒置熒光顯微鏡（上海締倫光學儀器有限公司）；3H16RI型智能高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；Victor X3型全自動酶標儀（Perkin Elmer公司）；OI 1000型凝膠成像系統（廣州光儀生物科技有限公司）等。

1.2 A549細胞培養

于液氮中取凍存A549細胞進行復蘇后，加入含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的F-12K培養基中，置于37℃、5% CO2條件下培養至對數期，用于試驗。

1.3 分組及給藥

將細胞分為對照組、各劑量試驗組、安羅替尼組、陽性藥物組、抑制劑組和激活劑組。對照組細胞不做干預，各劑量試驗組分別以5、10、20 μmol/L安羅替尼進行干預，安羅替尼組以20 μmol/L安羅替尼進行干預，陽性藥物組以20 μg/mL順鉑進行干預，抑制劑組以20 μmol/L安羅替尼和30 μmol/L PI3K/AKT通路抑制劑LY294002進行干預，激活劑組以20 μmol/L安羅替尼和10 μmol/L PI3K/AKT通路抑制劑SC79進行干預。每組設置3個復孔，干預24 h，置于37℃、5% CO2條件下培養。

1.4 CCK-8法測定A549細胞活力

將調整好密度（每毫升2×105個）的對數期細胞接種到96孔板中（每孔100 μL），試驗重復3次。各組干預24、48、72 h后加入10 μLCCK-8溶液孵育2 h，使用酶標儀測定各組光密度（optical density，OD）值（450 nm），每組檢測3次。細胞活力=（OD各劑量試驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.5 倒置顯微鏡觀察A549細胞的形態

在倒置顯微鏡下觀察各組干預24 h的A549細胞形態并拍照記錄。

1.6 EdU法測定A549細胞的增殖率

取各組干預24 h的細胞進行EdU處理，去除培養液，加入4%多聚甲醛0.5 mL（15 min），0.5 mL 3% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）洗滌3次；用0.5 mL 0.3% TritonX-100去除BSA，室溫10 min后洗滌3次；12孔板中每孔加200 μL Click反應液（現配現用），室溫避光孵育30 min，洗滌3次后去除Click反應液；加入Hoechst（10 min）；再洗滌3次后裝片，熒光顯微鏡拍照，再用ImageJ軟件處理圖片。細胞增殖率/%=EdU陽性染色細胞量（紅色）/總細胞量（藍色）×100%。

1.7 Hoechst 33258染色法測定A549細胞的凋亡情況

取各組干預24 h的細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞2次（每次5 min）后加入新鮮配置的4%多聚甲醛，4℃固定10 min。洗滌3次，Hoechst 33258染色液（5 mg/L）染色10 min后洗3次，封固，用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，拍照。細胞凋亡特征為核體積濃縮變小，染色不均勻且所發熒光較強，呈亮藍色。細胞凋亡率為凋亡細胞數在總細胞數中的所占的比例。

1.8 蛋白質印跡法檢測A549細胞中Caspase-3、Cyclin D1、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白的

表達水平

取各組干預24 h的細胞，提取蛋白并進行定量后上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；封閉2 h后，參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗（Caspase-3、Cyclin D1、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT及β-actin），4℃孵育過夜；次日進行洗滌后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗滌3次，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，蛋白相對表達量為目的蛋白占內參蛋白的比值。

1.9 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料平均值±標準差（x±s）均符合正態分布，多組間比較單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的安羅替尼處理對A549細胞活力的影響的比較

干預24 h后，與對照組相比，各劑量試驗組A549細胞的活力呈劑量依賴性降低，且20 μmol/L濃度的安羅替尼的A549細胞活力顯著降低，表明20 μmol/L濃度的安羅替尼對A549細胞活力有明顯的抑制作用，因此，本研究選擇20 μmol/L濃度的安羅替尼進行后續試驗（圖1）。

2.2 各處理組對A549細胞生長的影響

A549細胞處理24 h后，與對照組相比，安羅替尼組和陽性藥物組細胞的生長明顯受到抑制，細胞數量減少且細胞碎片增多。與安羅替尼組相比，抑制劑組細胞的生長進一步受到抑制，細胞大量減少且細胞碎片增多，而激活劑組細胞生長狀態得到恢復（圖2）。這些結果表明，安羅替尼可能通過調控PI3K/AKT信號通路抑制了細胞的生長。

2.3 各處理組對A549細胞增殖率的影響

A549細胞處理24 h后，與對照組相比，安羅替尼組和陽性藥物組細胞的增殖率降低。與安羅替尼組相比，抑制劑組細胞的增殖率進一步降低，而激活劑組細胞的增殖率升高（圖3）。這些結果表明，安羅替尼可能通過調控PI3K/AKT信號通路抑制A549細胞的增殖。

2.4 各處理組對A549細胞凋亡能力的影響

A549細胞處理24 h后，與對照組相比，安羅替尼組和陽性藥物組細胞的凋亡率升高。與安羅替尼組相比，抑制劑組細胞的凋亡率進一步升高，而激活劑組細胞的凋亡率降低（圖4）。以上結果表明，安羅替尼可能通過調控PI3K/AKT信號通路誘導A549細胞的凋亡。

2.5 各處理組對A549細胞中Caspase-3和Cyclin D1蛋白表達水平的影響

A549細胞處理24 h后，與對照組相比，安羅替尼組和陽性藥物組細胞中Caspase-3蛋白的表達水平升高，Cyclin D1蛋白的表達水平降低。與安羅替尼組相比，抑制劑組細胞中Caspase-3蛋白的表達水平進一步升高，Cyclin D1蛋白的表達水平進一步降低；而激活劑組細胞中Caspase-3蛋白的表達水平降低，Cyclin D1蛋白的表達水平升高（圖5）。這些結果表明，安羅替尼可能通過調控PI3K/AKT信號通路影響Caspase-3和Cyclin D1蛋白的表達水平。

2.6 各處理組對A549細胞中PI3K、AKT、p-PI3K及p-AKT蛋白表達水平的影響

A549細胞處理24 h后，與對照組相比，安羅替尼組和陽性藥物組細胞中PI3K和AKT蛋白表達水平的變化無統計學意義，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達水平降低。與安羅替尼組相比，抑制劑組細胞中PI3K和AKT蛋白表達水平的變化無統計學意義，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達水平進一步降低；激活劑組細胞中PI3K和AKT蛋白的表達水平的變化無統計學意義，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達水平升高（圖6）。這些結果表明，安羅替尼可能是通過阻遏PI3K/AKT信號通路影響A549細胞的增殖和凋亡能力的。

3 討論

肺癌是國內外臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在近些年的發病率呈現逐年上升的趨勢［10］。目前針對肺癌的診療方法雖然有諸多改進，但對于肺癌患者的存活率仍舊沒有明顯的提高，且預后效果差［11］。肺癌一般早期癥狀不明顯，因而極易出現漏診、誤診的情況，80%的患者在發現時就已經處于中晚期，故而只能進行放療、化療或者靶向治療［12-13］。因此，探索有效治療肺癌的藥物并明晰其相關作用機制對治療肺癌至關重要。安羅替尼具有全面、多靶點、高選擇性、強效抑制的特點。相關研究表明，安羅替尼可以通過抑制與癌細胞增殖和轉移相關的信號通路，進而直接抑制癌細胞［6，14-15］。本研究結果顯示，安羅替尼可以抑制肺癌細胞的增殖并誘導凋亡，與前人研究結果一致［16］。Cyclin D1可以調節細胞周期G1期。蘇俊玲等［17］的研究結果表明，Cyclin D1蛋白能夠通過對細胞周期的干擾繼而使癌細胞增殖失控。在本研究中，安羅替尼處理后Cyclin D1的表達水平呈下降趨勢，生長與增殖也同樣受到抑制。而Caspase-3作為一種半胱氨酸蛋白酶，在細胞的凋亡中發揮了核心作用。本研究中Caspase-3蛋白的表達水平增加，說明在誘導肺癌凋亡過程中，安羅替尼發揮了重要作用。以上結果均揭示了安羅替尼在肺癌增殖和凋亡過程中發揮了重要的作用。

PI3K/AKT信號通路與多種腫瘤細胞的增殖和凋亡有極高的相關性，在腫瘤發展中發揮重要作用，同時也與腫瘤細胞的治療和預后關系密切［18-19］。在鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤組織中，PI3K/AKT信號通路均呈現高表達［20］。另有研究顯示，安羅替尼能夠通過抑制PI3K/AKT信號通路降低宮頸癌HeLa細胞的增殖［21］。本研究發現，安羅替尼可以抑制肺癌細胞中PI3K/AKT信號通路的活性，在加入PI3K/AKT信號通路抑制劑后作用更加明顯，且加入激活劑后顯著扭轉了這一趨勢。這說明，安羅替尼通過介導PI3K/AKT信號通路調控肺癌細胞的增殖和凋亡。這些結果均表明，安羅替尼可以通過PI3K/AKT信號轉導通路抑制A549細胞增殖并誘導凋亡。

綜上所述，安羅替尼可能通過介導PI3K/AKT信號通路發揮抑制A549細胞增殖、促進凋亡的作用。本研究以期為進一步豐富安羅替尼介導PI3K/AKT信號通路抗腫瘤作用提供新的理論依據。

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