功能化氧化石墨烯攜帶PD-L1 siRNA抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為

李志偉 單麗紅 劉曦冉 閔洋 丁小鳳 李立民

摘 要：程序性死亡受體1（PD-1）/程序性死亡配體1（PD-L1）信號(hào)通路主要參與免疫負(fù)調(diào)控作用，且在許多類型的腫瘤的惡性發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。PD-L1的高表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌（HCC）的侵襲，提高腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，PD-L1常作為免疫檢查點(diǎn)的阻斷靶點(diǎn)，主要通過單抗將其中和，引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，PD-L1是HCC免疫治療中極具潛力的靶點(diǎn)之一。本文主要探究納米級(jí)功能化氧化石墨烯（GO-PEI-PEG）攜帶PD-L1 siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。研究結(jié)果顯示，將GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA轉(zhuǎn)染至MHCC97H細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖和遷移均被抑制，細(xì)胞周期阻滯在G1期，且細(xì)胞凋亡的數(shù)目增多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA對(duì)MHCC97H細(xì)胞的抑制作用是通過阻礙AKT信號(hào)通路激活實(shí)現(xiàn)的。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，GO-PEI-PEG具備優(yōu)秀的遞送性能，攜帶PD-L1 siRNA可有效干擾PD-L1表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，這為治療HCC提供了更安全、有效的遞送新策略。

關(guān)鍵詞：氧化石墨烯；PD-L1；siRNA遞送；肝癌；AKT信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R735.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.007

Functionalized Graphene Oxide Carrying PD-L1 siRNA Inhibits the Malignant Biological Behaviors of Liver Cancer Cells

LI Zhiweia， SHAN Lihonga， LIU Xirana， MIN Yanga， DING Xiaofenga， LI Liminb*

（Hunan Normal University a. Gene Function & Regulation Laboratory， College of Life Science; b. College of Engineering and Design， Changsha 410081， China）

Abstract： The programmed cell death protein 1 （PD-1）/ programmed cell death 1 ligand 1 （PD-L1） signaling pathway is mainly involved in negative immune regulation and plays a crucial role in the malignant development of many types of tumors. High expression of PD-L1 promotes HCC invasion and increases the risk of tumor recurrence. In addition， PD-L1 is often used as an immune checkpoint blockade target， mainly neutralized by monoclonal antibodies to trigger an anti-tumor immune response. Therefore， PD-L1 is one of the potential targets in HCC immunotherapy. This study mainly uses nano-scale functionalized graphene oxide （GO-PEI-PEG） to carry PD-L1 siRNA to explore the malignant biological effects on liver cancer cells. The results showed that after transfection of GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA into MHCC97H cells， the proliferation and migration of cells were inhibited， the cell cycle was arrested in the G1 phase， and the number of apoptotic cells increased. It was further found that the inhibitory effect of GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA on MHCC97H cells was achieved by blocking the activation of the AKT signaling pathway. These experimental results show that GO-PEI-PEG has excellent delivery performance， carries PD-L1 siRNA to effectively interfere with PD-L1 expression， and then inhibits the malignant biological behavior of liver cancer cells， which provides a safer and more effective delivery strategy for the treatment of HCC.

Key words： graphene oxide; PD-L1; delivery of siRNA; liver cancer; AKT signaling pathway

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（4）： 345-352）

肝癌（liver cancer）是全球第六大常見癌癥和第四大致死癌癥，目前中國原發(fā)肝癌新發(fā)病例為36.5萬，死亡病例為31.9萬［1］。肝癌因診斷發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，且治愈率低，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的危害。根治性肝切除術(shù)仍然是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的首要治療手段，但是大約70%的患者在根治性治療后存在復(fù)發(fā)的情況，導(dǎo)致5年生存率僅為40.0% ～71.9%［2-3］。除了傳統(tǒng)治療方式外，免疫治療也成為肝癌的治療方法之一。免疫治療是通過激發(fā)人體的免疫功能來發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的［4］，主要分為過繼免疫治療和免疫檢查點(diǎn)阻斷治療［5］。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）和程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）是常見的免疫檢查點(diǎn)，它們主要在免疫調(diào)控中維持機(jī)體內(nèi)的免疫平衡，起到免疫負(fù)調(diào)控作用。但是，在惡性腫瘤中，免疫負(fù)調(diào)控的功能被腫瘤細(xì)胞“利用”，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸［6］。研究表明，PD-L1的表達(dá)與許多類型腫瘤的惡性進(jìn)展存在相關(guān)性， PD-L1的高表達(dá)可促進(jìn)HCC的侵襲性增加，提高根治性切除術(shù)后患者肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［7-9］。另外，與原發(fā)性HCC相比，復(fù)發(fā)性的HCC表現(xiàn)出更高的PD-L1表達(dá)，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性HCC細(xì)胞的逃避能力增強(qiáng)［8］。

目前，以新型生物材料為載體攜帶核酸或化療藥物的靶向治療被廣泛研究及應(yīng)用。常見遞送核酸的載體分為病毒載體和非病毒載體［10］。病毒載體以其高轉(zhuǎn)染效率和強(qiáng)穩(wěn)定性備受關(guān)注，然而，它突變風(fēng)險(xiǎn)高且具有免疫原性，極易引發(fā)炎癥，存在巨大的安全隱患［9］。非病毒載體包括陽離子脂質(zhì)體、陽離子多聚復(fù)合物、多肽蛋白類遞送載體以及多種基于陽離子高分子修飾的無機(jī)納米顆粒［11］。這類載體不會(huì)引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，且具有靈活的修飾性［12］。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）作為一種新型碳納米材料，具有極佳的親水性和生物相容性，并且經(jīng)修飾和功能化后的衍生物常用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［13］。另外，在生物傳感、成像、抗菌、免疫增強(qiáng)劑等領(lǐng)域中，GO也成為備受關(guān)注的對(duì)象［14］。

本研究以PD-L1作為肝癌的治療靶點(diǎn)，制備納米級(jí)功能化氧化石墨烯（graphene oxide - polyethylenimine - polyethyleneglycol，GO-PEI-PEG）作為PD-L1 siRNA的遞送載體，在體外探究GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞系 MHCC97H（已通過STR鑒定）購自American Type Culture Collection （ATCC），于本實(shí)驗(yàn)室凍存。

主要試劑：石墨粉末、H2SO4、KMnO4、30%過氧化氫均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；六臂胺端聚乙二醇（6-arm-PEG-NH2）購于上海芃碩生物科技有限公司（貨號(hào)PS6-N-10K）；25 kD支化聚乙烯亞胺（polyethylenimine，Branched）來自Sigma-Aldrich公司（貨號(hào)9002-98-6）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號(hào)FCS500）來自Excell bio公司，DMEM（Dulbeccos modified Eagle medium）培養(yǎng)基（貨號(hào)2252351）購自Vivacell公司，Opti-MEM培養(yǎng)基（貨號(hào)31985070）購自Gibco公司，青霉素、鏈霉素（貨號(hào)E607011-0100）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、氯化鈉、甘氨酸、亞甲雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、蛋白抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白Marker（貨號(hào)PM901）購自北京金沙生物科技有限公司。細(xì)胞周期試劑盒（貨號(hào)F10797）來自賽默飛世爾科技公司，細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號(hào)640914）來自Biolengd公司。NC siRNA、PD-L1 siRNA和PD-L1 siRNA-FAM購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；NC siRNA序列為sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；antisense：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。PD-L1 siRNA和PD-L1 siRNA-FAM序列均為sense：5'-GUGGCAUCCAAGAUACAAATT-3'；antisense：5'-UUUGUAUCUUGGAUGCCACTT-3'。

抗體：α-tubulin抗體（貨號(hào)T6199）購于Sigma公司，1：5 000稀釋使用；BCl2抗體（貨號(hào)sc-7382）購于Santa Cruz公司，1：1 000稀釋使用；p-AKT（Ser473）（貨號(hào)#9271）、p-CREB（貨號(hào)#9198）和CREB抗體（貨號(hào)#9197）購于Cell Signaling Technology公司，這兩種抗體均1：1 000稀釋使用；β-catenin（貨號(hào)66379-1-Ig）購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，1：1 000稀釋使用；PD-L1抗體（貨號(hào)A1645）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司公司，1：500稀釋使用；AKT抗體（貨號(hào)D151600）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，1：600稀釋使用；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔（貨號(hào)074-1506）、羊抗鼠（貨號(hào)04-18-06）二抗為KPL品牌，1：5 000稀釋使用。

1.2GO的制備

GO的制備方法是根據(jù)傳統(tǒng)的Hummers方法［15］進(jìn)行改進(jìn)的，簡單步驟如下：在冰浴條件下，將70 mL H2SO4緩慢倒入圓底燒瓶中，緩慢攪拌。稱取3.0 g石墨粉末少量多次倒入H2SO4中；待石墨粉末分散后，稱取9.0 g KMnO4緩慢倒入體系中，此過程嚴(yán)格保證溫度不高于20℃；待體系完全攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至40℃的油浴鍋中，劇烈攪拌30 min；隨后，緩慢加入150 mL去離子水，升溫至95℃，反應(yīng)15 min；結(jié)束后，將體系倒入含0.5 L去離子水的燒瓶中，并逐滴滴加15 mL 30%的雙氧水。用去離子水離心洗滌產(chǎn)物至中性，用真空冷凍干燥儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行干燥。

1.3 GO-PEI-PEG的制備

制備羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）的具體操作為：稱取100 mg GO加入到10 mL去離子水中，超聲得到分散液；往分散液中添加2.4 g NaOH和2.0 g C2H3ClO2，隨后劇烈攪拌3 h；之后離心獲得固體殘余物，用去離子水充分洗滌至中性，即為GO-COOH。

對(duì)GO-COOH進(jìn)行功能化修飾：將10 mg PEG和10 mg EDC加入超聲分散后的GO-COOH（0.5 mg/mL，20 mL）中；反應(yīng)5 min后室溫下攪拌30 min；加入50 mL PEI（1 mg/mL）和15 mg EDC，超聲處理5 min，然后室溫下攪拌過夜；用去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)物至中性，獲得GO-PEI-PEG溶液。

1.4 表征檢測(cè)

傅里葉紅外光譜：將少量的GO、GO-COOH、GO-PEI和GO-PEI-PEG分別加入至干燥的溴化鉀中，研磨均勻后，使用模具和壓片機(jī)制備成溴化鉀壓片。放置于傅里葉紅外光譜儀（NEXUS670）上檢測(cè)樣品光譜，波譜掃描范圍為400～4 000 cm-1 。

動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）：首先，加1 mL去離子水至比色皿中，放入動(dòng)態(tài)光散射儀（Nano ZS90）中掃描獲取背景數(shù)據(jù)；之后，按照同樣參數(shù)分別對(duì)GO、GO-PEI和GO-PEI-PEG分散液（1 mL，0.1 mg/mL）進(jìn)行掃描，獲取Zeta電位。

透射電子顯微鏡：將質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的分散液（GO、GO-PEI和GO-PEI-PEG）滴加在銅網(wǎng)中，使用濾紙吸取多余的液體，過夜干燥。使用日本JEOL公司（JEOL2100）的透射電子顯微鏡拍攝樣品的形貌圖片。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞，并放置在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 GO-PEI-PEG/siPD-L1轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

按GO-PEI-PEG與siRNA的N/P為0.5配制混合物，具體操作如下：在兩管含有100 ?L Opti-MEM的RNase free離心管中分別加入5.0 ?L PD-L1 siRNA（20 μmol/L）和7.5 ?L GO-PEI-PEG（0.1 mg/mL）進(jìn)行稀釋，室溫條件下靜置5 min。將兩者混合均勻，室溫條件下孵育30 min。PBS清洗細(xì)胞2次，加入1.8 mL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，滴加轉(zhuǎn)染混合物，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，PBS清洗2次后，更換正常細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。本文涉及的細(xì)胞表型試驗(yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)的分組均為空白組（Blank組）、對(duì)照組（Control組）和PD-L1 siRNA組。Blank組僅添加GO-PEI-PEG至細(xì)胞培養(yǎng)體系中；Control組將GO-PEI-PEG遞送NC序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；PD-L1 siRNA組將GO-PEI-PEG遞送PD-L1 siRNA序列轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

1.7 Transwell遷移試驗(yàn)

在24孔板中加入細(xì)胞培養(yǎng)基（每孔300 μL），將Transwell小室（Corning，貨號(hào)3413）放入孔板中，并添加100 μL無血清培養(yǎng)基；接種轉(zhuǎn)染處理后的MHCC97H細(xì)胞（1×104個(gè)），放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后，使用4%多聚甲醛固定，加入0.5%的結(jié)晶紫室溫染色，使用顯微鏡獲取圖片，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總量。

1.8 克隆形成試驗(yàn)

在6孔板中每孔加入500個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，加入2 mL完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每隔3天更換1次培養(yǎng)基。在顯微鏡下觀察到有細(xì)胞團(tuán)時(shí)，可使用多聚甲醛進(jìn)行固定，用結(jié)晶紫染色。等干燥后，用數(shù)碼相機(jī)拍照，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.9 細(xì)胞增殖檢測(cè)

以每孔5 000個(gè)的量將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中。分別在第1、2、3天每孔加入100 μL MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為 490 nm的吸光度。

1.10 細(xì)胞周期檢測(cè)與細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染處理48 h后的MHCC97H細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，并用預(yù)冷PBS清洗2次。加入500 ?L細(xì)胞周期檢測(cè)試劑，4℃避光染色15 min后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

按照細(xì)胞周期檢測(cè)方法處理細(xì)胞樣品，之后按照生產(chǎn)廠家說明書依次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin-V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色。染色完成后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.11 蛋白質(zhì)免疫印跡

對(duì)MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，并用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以20 μg蛋白總量上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育，最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）進(jìn)行顯影。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)來自至少3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)，采用Students t-test檢測(cè)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.00001。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO-PEI-PEG表征結(jié)果

在傅里葉紅外光譜分析中，羥基的特征峰在3 420 cm-1處，羰基的特征峰在1 729 cm-1處，酰胺基的特征峰在1 636 cm-1處，甲基的特征峰在2 927 cm-1處。在傅里葉紅外光譜圖中（圖1a），GO、GO-COOH、GO-PEI和GO-PEI-PEG在3 420 cm-1處存在羥基的特征峰。GO的峰譜在1 729 cm-1（羰基峰）和1 636 cm-1（酰胺鍵峰）兩處有峰，而GO-COOH、GO-PEI和GO-PEI-PEG的峰譜中未存在羰基的特征峰，而是存在酰胺鍵的特征峰。試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的GO具有典型的特征峰，經(jīng)過PEI和PEG修飾后，GO表面的含氧基團(tuán)與胺基形成了酰胺鍵，鑒定為GO-PEI-PEG。

利用DLS檢測(cè)表面Zeta電荷，可得GO的Zeta電位為-47.93 mA，GO-PEI為+45.37 mA，GO-PEI-PEG為+44.93 mA（圖1b）。用透射電子顯微鏡觀察GO和GO-PEI-PEG的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，制備的GO呈單層結(jié)構(gòu)，并且呈經(jīng)典的薄紗形態(tài)，其表面積大；GO-PEI-PEG的形態(tài)較GO無明顯改變，說明聚合物的接枝不會(huì)改變GO的物理性質(zhì)（圖1c）。

2.2 GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移

在MHCC97H細(xì)胞中，第1、2和3天PD-L1 siRNA組的吸光度比Blank組、Control組顯著降低，說明GO-PEI-PEG可有效地遞送PD-L1 siRNA，并能夠抑制MHCC97H細(xì)胞的增殖（圖2a）。克隆形成試驗(yàn)結(jié)果也表明，MHCC97H細(xì)胞的克隆成團(tuán)能力也得到了抑制（圖2b）。這些試驗(yàn)結(jié)果提示了PD-L1的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)。

Transwell試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移能力結(jié)果顯示，PD-L1 siRNA組的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少，說明敲低PD-L1能夠影響肝癌細(xì)胞的遷移能力（圖2c）。

2.3 GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA使肝癌細(xì)胞阻滯在G1期

細(xì)胞周期分為間期（G1、S、G2）和分裂期（M）兩個(gè)階段。G1期又稱為合成前期，主要合成RNA和核糖體，為S期的DNA復(fù)制做準(zhǔn)備。滯留在G1期的細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂，進(jìn)而增殖受到抑制。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的周期，結(jié)果如圖3所示：在MHCC97H中，Blank組G1期的細(xì)胞有61.04%，S期的細(xì)胞有30.96%，G2/M期的細(xì)胞有8.00%；Control組G1期的細(xì)胞有60.58%，S期的細(xì)胞有31.42%，G2/M期的細(xì)胞有8.00%；PD-L1 siRNA組G1期的細(xì)胞有70.35%；S期的細(xì)胞有26.73%，G2/M期的細(xì)胞有2.92%。試驗(yàn)結(jié)果表明，敲低PD-L1使肝癌細(xì)胞周期滯留在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。

2.4 GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡

先將GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA轉(zhuǎn)染至MHCC97H中，24 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。圖4結(jié)果顯示，PD-L1 siRNA組凋亡總數(shù)（20.05%）比Blank組（10.09%）、Control組（9.67%）多，說明干擾PD-L1能夠促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡。

2.5 GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA抑制AKT信號(hào)

通路激活

有文獻(xiàn)報(bào)道，AKT信號(hào)通路參與腫瘤生長及發(fā)展，是腫瘤細(xì)胞增殖必不可少的信號(hào)通路［16］。蛋白免疫印跡的結(jié)果顯示（圖5）：干擾PD-L1后，MHCC97H細(xì)胞中AKT總蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，但磷酸化AKT（p-AKT Ser473）的表達(dá)下調(diào)。CREB是AKT信號(hào)通路的下游蛋白，p-AKT可以促進(jìn)CREB發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致磷酸化CREB入核，增強(qiáng)CREB的活性。干擾PD-L1后，在MHCC97H細(xì)胞中，CREB和磷酸化CREB都顯著下調(diào)；BCL2是癌基因，表達(dá)的蛋白稱為抗凋亡蛋白，是CREB的靶基因，而CREB可以促進(jìn)BCL2表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力。干擾PD-L1后，BCL2蛋白顯著下調(diào)。因此，干擾PD-L1表達(dá)可抑制AKT信號(hào)通路激活，BCL2表達(dá)受阻，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞抗凋亡能力。

3 討論

PD-L1/ PD-1信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，主要在腫瘤微環(huán)境中通過影響淋巴細(xì)胞來抑制免疫反應(yīng)。在免疫功能失調(diào)的顱內(nèi)生殖細(xì)胞瘤患者中，其體內(nèi)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞表面的PD-1的表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxp3陽性、CD8陽性腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞因子分泌增多，這些腫瘤微環(huán)境的改變誘導(dǎo)CD4+TIL向Foxp3+TIL細(xì)胞分化，從而引起免疫耐受［17］。然而，阻斷PD-L1可以抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，例如，在胃癌中，阻斷PD-L1可降低T細(xì)胞的凋亡，保持T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力和殺傷作用［18-20］。對(duì)肝癌患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PD-1集中在免疫細(xì)胞浸潤區(qū)域，而PD-L1和PD-L2則主要分布在腫瘤組織中［20］。有研究指出，PD-L1的高表達(dá)可促進(jìn)肝癌的侵襲，提高術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［7］。在復(fù)發(fā)HCC中，PD-L1的表達(dá)出現(xiàn)更高的水平，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性肝癌細(xì)胞的免疫逃逸能力增強(qiáng)［8］。另外，不少研究證明，AKT信號(hào)通路與PD-L1的表達(dá)相關(guān)。Xu等［21］報(bào)道，環(huán)狀RNA hsa_circ_0003288可充當(dāng)miR-145的海綿，并通過PI3K/AKT信號(hào)通路上調(diào)PD-L1的表達(dá)來促進(jìn)EMT和侵襲。Gao等［22］報(bào)道，桃葉珊瑚苷通過抑制HCC細(xì)胞中的Akt/β-catenin信號(hào)通路顯著下調(diào)PD-L1 的表達(dá)。Wu等［23］報(bào)道，HCC中的WSX1抑制PD-L1的表達(dá)是通過抑制PI3Kδ/AKT信號(hào)通路失活實(shí)現(xiàn)的，此信號(hào)通路失活激活了GSK3β，進(jìn)而促進(jìn)PD-L1的降解。上述的研究中，PD-L1均被報(bào)道為AKT信號(hào)通路的下游蛋白，通過調(diào)控它的表達(dá)影響HCC的發(fā)展。本文發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)降低會(huì)影響β-catenin/AKT/CREB/BCL2信號(hào)軸，進(jìn)而促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，這說明，PD-L1也可以作為AKT信號(hào)通路的上游因子。這個(gè)結(jié)論在Dong等［24］的研究中也被提出，但是，他們發(fā)現(xiàn)，在肝內(nèi)膽管癌中干擾PD-L1會(huì)促進(jìn)AKT磷酸化，導(dǎo)致AKT信號(hào)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，與我們的結(jié)果不一致。這種情況的出現(xiàn)可能與不同類型的腫瘤細(xì)胞有關(guān)。總之，本文表明，GO-PEI-PEG遞送PD-L1 siRNA可干擾PD-L1的表達(dá)，抑制HCC細(xì)胞的增殖，這為全面了解PD-L1的作用提供了證據(jù)。

目前針對(duì)PD-L1開發(fā)了許多免疫檢查點(diǎn)抑制劑，主要是單克隆抗體，例如，納武單抗（Nivolumab）、帕姆單抗（Pembrolizumab）、Pidilizumab、AMP224。這些單克隆抗體對(duì)于實(shí)體瘤的治療作用尚未達(dá)到預(yù)期。因此，如何更有效地靶向PD-L1成為免疫治療的關(guān)注點(diǎn)之一。隨著對(duì)新型生物材料開發(fā)與應(yīng)用，越來越多的研究將其作為核酸或藥物遞送系統(tǒng)。GO具有極高的電、熱光傳導(dǎo)性，在電子以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［25］。它具有聚合物、膠體、薄膜以及兩性分子的特性，另外，還具備良好的親水性和生物相容性［13，26］。目前，有許多文獻(xiàn)報(bào)道，GO及其衍生物遞送核酸或者負(fù)載藥物可用于腫瘤治療，彌補(bǔ)藥物自身缺陷并增強(qiáng)靶向性［14，19］。在我們之前的報(bào)道中，GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA可通過增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷能力和促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡來增強(qiáng)抗腫瘤能力［27］。結(jié)合本文的結(jié)果，我們?nèi)骊U述了GO-PEI-PEG/PD-L1 siRNA對(duì)HCC的抑制作用，這為HCC的臨床治療提供了新思路。

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