m6A甲基轉移酶KIAA1429轉染對結腸癌細胞增殖的影響及機制探討

摘要：目的 觀察m6A甲基轉移酶KIAA1429轉染對結腸癌細胞增殖的影響，并探討其機制。方法 通過慢病毒轉染的方法在人結腸癌細胞RKO中構建穩定敲低KIAA1429的對照組和實驗組細胞系，將其分別命名為sh-NC組、shKIAA1429組，在人結腸癌細胞LS180中構建穩定過表達KIAA1429的對照組和實驗組細胞系，將其分別命名為OE-NC組、OE-KIAA1429組。采用Western blotting法檢測KIAA1429蛋白來驗證轉染效率，采用CCK-8實驗和平板克隆實驗檢測KIAA1429轉染對結腸癌細胞增殖的影響，通過差異基因的富集分析預測KIAA1429轉染對結腸癌細胞增殖的影響機制，采用流式細胞術檢測KIAA1429轉染對細胞周期的影響，采用Western blotting法觀察OE-NC組和OE-KIAA1429組細胞內E2F1、CyclinB1、p21蛋白變化。結果 sh-NC組、sh-KIAA1429組KIAA1429蛋白相對表達量分別為0.979±0.028、0.299±0.138，兩組比較P=0.002；OE-NC組、OE-KIAA1429組KIAA1429蛋白相對表達量分別為0.446±0.104、0.899±0.153，兩組比較P=0.026。CCK-8實驗和平板克隆實驗結果顯示，KIAA1429顯著促進了結腸癌細胞的增殖（P均lt;0.05）。KEGG富集分析提示差異基因主要于細胞周期相關的信號通路得到富集，GO富集分析提示差異基因的功能與遺傳物質的復制及細胞周期相關。流式細胞術結果顯示，RKO細胞中sh-NC組和sh-KIAA1429組的G0/G1期所占百分比分別為52.07%±1.00%、58.57%±0.98%，兩組相比P=0.003；LS180細胞中OE-NC組和OE-KIAA1429組的G0/G1期所占百分比分別為68.37%±0.82%、62.40%±1.34%，兩組相比P=0.006。OE-NC組CyclinB1、E2F1、p21蛋白相對表達量分別為0.491±0.116、0.661±0.132、1.007±0.058，OE-KIAA1429組分別為1.254±0.169、1.125±0.135、0.725±0.110，兩組相比P均lt;0.05。結論 m6A甲基轉移酶KIAA1429通過調控細胞周期信號通路進而促進結腸癌細胞增殖。

關鍵詞：m6A甲基轉移酶；KIAA1429；病毒轉染；細胞增殖；細胞周期；結腸癌

doi：10.3969/j.issn.2096-9058.2023.02.004

中圖分類號：R735.3" " "文獻標志碼：A" " "文章編號：2096-9058（2023）02-0019-06

Effect and mechanism of m6A methyltransferase KIAA1429 transfection on the proliferation of colon cancer cells

YE Chunshui1， SHANG Liang1，2， LIU Yuan1， MA Chenghao1， CHONG Wei2， CHEN Hao3， LI Leping1，2

1 Shandong University， Jinan 250021， China；2 Department of Gastrointestinal Surgery， Shandong Provincial Hospital， Jinan 250021， China；3 Clinical Research Center of Shandong University， Clinical Epidemiology Unit， Qilu Hospital of Shandong University， Jinan 250021， China

Corresponding Author：LI Leping （E-mail： lileping@medmail.com.cn）

Abstract： Objective To observe the effect of m6A methyltransferase KIAA1429 transfection on the proliferation of colon cancer cells and to investigate its mechanism. Methods The control group and experimental group cell lines stably knockdown of KIAA1429 were constructed in human colon cancer cell RKO by lentivirus transfection， which were named sh-NC group and shKIAA1429 group respectively. The control and experimental group cell lines with stable overexpression of KIAA1429 were constructed in human colon cancer cell LS180， which were named OE-NC group and OE-KIAA1429 group respectively. Transfection efficiency was detected by Western blotting. The effect of KIAA1429 transfection on cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay and plate cloning experiment. The potential mechanism of the effect of KIAA1429 transfection on the proliferation of colon cancer cells was predicted by enrichment analysis of differential genes. The effect of KIAA1429 transfection on cell cycle was detected by flow cytometry. Changes of the expression of E2F1， CyclinB1 and p21 in OE-NC group and OE-KIAA1429 group were detected by Western blotting. Results The relative expression of KIAA1429 protein in sh-NC group and sh-KIAA1429 group were 0.979 ± 0.028 and 0.299 ± 0.138， respectively， P=0.002. The relative expression of KIAA1429 protein in OE-NC group and OE-KIAA1429 group were 0.446 ± 0.104 and 0.899 ± 0.153， respectively， P=0.026. The results of CCK-8 assay and plate cloning experiment showed that KIAA1429 significantly promoted the proliferation of colon cancer cells （all Plt;0.05）. KEGG enrichment analysis showed that the differential genes were mainly enriched in the signal pathway related to cell cycle， and GO enrichment analysis showed that the function of differential genes was mainly related to the replication of genetic material and cell cycle. The results of flow cytometry showed that the percentages of G0/G1 phase in sh-NC group and sh-KIAA1429 group were 52.07% ± 1.00% and 58.57% ± 0.98%， respectively， P=0.003. The percentages of G0/G1 phase in OE-NC group and OE-KIAA1429 group were 68.37% ± 0.82% and 62.40% ± 1.34%， respectively， P=0.006. The relative expression levels of cyclinB1， E2F1 and p21 protein in OE-NC group were 0.491 ± 0.116， 0.661 ± 0.132 and 1.007 ± 0.058， the proteins in OE-KIAA1429 group were 1.254 ± 0.169， 1.125 ± 0.135 and 0.725 ± 0.110 respectively， there were statistically significant between the two groups （all Plt;0.05）. Conclusion The m6A methyltransferase KIAA1429 can promote the proliferation of colon cancer cells by regulating cell cycle signal pathway.

Key words： m6A methyltransferase； KIAA1429； lentiviral transfection； cell proliferation； cell cycle； colon cancer

最新的全國癌癥統計報告顯示，結直腸癌已位于中國癌癥發病譜第2位［1］。老年人為結直腸癌的高發人群，且結腸癌發生和死亡風險有高于直腸癌的趨勢［2］，是老年醫學最大的挑戰之一。由于結腸癌在早期階段通常缺乏典型的癥狀，多數患者初診時已處于進展期［3-4］，早期發現是預防及改善結腸癌患者預后的關鍵，因此，研究分子標志物在結腸癌的診斷、治療方法選擇、預后評估及預測復發轉移風險等方面的價值具有重要的意義。RNA修飾能夠導致基因表達變化，從而影響結腸癌的發生和發展［5］。N6腺苷的甲基化（m6A）是真核生物最普遍的RNA修飾類型之一，其是由甲基轉移酶復合物、去甲基化酶和效應蛋白調節并可逆的動態過程，在多種生理病理過程中發揮重要作用［6］。甲基轉移酶KIAA1429作為m6A相關酶的關鍵成員，對RNA的m6A甲基化至關重要。先前的研究表明，KIAA1429可能在多種腫瘤發生中發揮重要作用，例如，KIAA1429通過GATA3的N6-甲基腺苷依賴性轉錄后修飾促進肝癌進展［7］；KIAA1429能夠直接靶向胃癌中的c-Jun信使RNA來調節胃癌細胞增殖［8］。已有研究人員發現，KIAA1429在結直腸癌腫瘤組織內高表達，并與患者生存預后相關，促進了腫瘤的惡性進展［9］。然而其在結腸癌發生發展中的作用機制尚不完全明確。因此，本研究通過轉染慢病毒使KIAA1429基因在結腸癌細胞中敲低或過表達，觀察KIAA1429轉染對結腸癌細胞增殖的影響并進一步探討其機制。

1" 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人結腸癌細胞系RKO、LS180購于廣州賽業生物科技有限公司，均帶有原始譜系追蹤及STR（ShortTandemRepeat，短串聯重復序列）鑒定報告，細胞系基因分型均正確，支原體檢測均為陰性；RPMI1640、DMEM（高糖）培養基、PBS、0.25%胰酶、青—鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購于德國PAN公司，嘌呤霉素購于美國MedChemExpress公司，慢病毒購于上海吉凱基因醫學科技股份有限公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于日本Dojindo公司，細胞周期檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術股份有限公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、4×上樣緩沖液均購于北京Solarbio公司，蛋白預染Marker購于美國Thermo Fisher Scientific公司，兔源二抗、β-Actin抗體、KIAA1429抗體購于美國Proteintech公司，CyclinB1抗體、E2F1抗體以及p21抗體均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細胞培養、分組及轉染 RKO細胞培養使用添加了10%胎牛血清和1%青—鏈霉素雙抗的DMEM培養基，LS180細胞使用添加了10%胎牛血清和1%青—鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基，所有細胞在飽和濕度、恒溫37 ℃、95%空氣和5% CO2的孵箱中培養。

選取RKO細胞用于KIAA1429敲低實驗，LS180細胞用于KIAA1429過表達實驗。將RKO、LS180細胞使用胰酶消化、離心、重懸，接種至6孔板。將RKO細胞分別標記為sh-KIAA1429組、sh-NC組，LS180細胞分別標記為OE-KIAA1429組、OE-NC組，待孔板中細胞生長狀態良好、密度約30%時進行慢病毒轉染，按照轉染手冊將KIAA1429敲低慢病毒及其陰性對照慢病毒分別加入到sh-KIAA1429組、sh-NC組的培養上清液中，將過表達病毒及其陰性對照慢病毒分別加入到OE-KIAA1429組、OE-NC組細胞的培養上清液中。細胞轉染24 h后，更換新鮮完全培養基，繼續培養觀察細胞狀態，中途可更換新的培養基，待細胞密度達到80%以上后，可進行傳代，傳代2～3次后向培養基中加入適量濃度的嘌呤霉素進行藥篩。藥篩成功后，繼續培養、傳代、凍存留種，進行下一步實驗。

1.3 慢病毒轉染效率檢測 采用Western blotting法。按照試劑盒說明書使用RIPA裂解液提取1.2中4組細胞的蛋白，BCA定量試劑盒檢測后將蛋白水平調成一致，加入4×上樣緩沖液后置于100 ℃條件下金屬浴加熱10 min使蛋白變性。將上述4組細胞以每種樣本上樣30 μg蛋白進行電泳，恒壓條件（120 V）下直至上樣緩沖液接近膠板的底端處時停止電泳。使用濕轉發以恒流條件（220 mA）將蛋白轉移至PVDF膜，然后向孵育盒內加入5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，回收牛奶后加入TBST以100 r/min的轉速洗膜5 min，共3次，然后分別加入相應兔源一抗β-Actin（稀釋倍數為1∶2 000）、KIAA1429（稀釋倍數為1∶1 000）在4 ℃的環境中以60 r/min的轉速緩慢搖蕩孵育過夜，TBST漂洗3遍后加入適量的兔源二抗（稀釋倍數為1∶5 000），在室溫的環境中以60 r/min的轉速緩慢搖蕩孵育1 h，TBST漂洗3遍，應用化學發光儀進行檢測、拍照。使用ImageJ軟件分析各個條帶的灰度將其量化。

1.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8實驗。將1.2中的4組細胞用胰酶消化，細胞懸液計數，調整到密度為4×104/mL，每組12孔，每孔100 μL細胞懸液接種到96孔板中。接種后24、48、72、96 h，分別吸出各組3孔的舊培養基，按照1∶10比例加入CCK8溶液及基礎培養基共110 μL，并在37 ℃條件中孵育2 h，應用酶標儀測定各孔在450 nm處光密度值（OD值）。增殖率為每個實驗孔的OD值與對應24 h時的平均OD值的比值，以此評價KIAA1429對結腸癌細胞增殖的影響。

1.5 細胞集落數計算 采用平板克隆實驗。將1.2中的4組細胞用胰酶消化，計數，調整密度后以每孔200個細胞的密度接種細胞于6孔板中。將平板置于孵箱中培養15 d，每3 d更換1次新鮮培養基。15 d后，吸棄培養基，用PBS洗滌2次，多聚甲醛試劑固定20 min，用PBS洗滌2次，結晶紫試劑染色30 min。最后，PBS洗滌殘留的染料溶液，晾干后拍照，并統計細胞集落個數。

1.6 細胞轉錄組測序差異基因的GO和KEGG富集分析 采用生物信息學分析。選取轉染效率較好且穩定的sh-KIAA1429組和sh-NC組細胞進行轉錄組測序。測序完成后采用R語言clusterProfiler包（v3.6.0）對測序得到的差異基因集進行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，KEGG分析用于基因通路的預測，GO分析用于預測蛋白質的功能，使用R語言ggplot2包繪制氣泡圖將結果可視化。

1.7 細胞周期檢測 采用流式細胞術。將1.2中的4組細胞接種至6孔板中，待細胞密度達到80%后，使用胰酶將細胞消化重懸，用預冷的PBS洗滌后離心沉淀細胞（1×106），將其重懸于預冷的75%乙醇中，置于4 ℃環境中固定4 h。然后用預冷的PBS洗滌后離心、沉淀，加入PI（450 mL）和RNase A溶液（50 μL）重懸細胞，將細胞避光孵育30 min，于1 h內進行流式細胞術檢測，使用FlowJo軟件分析數據。

1.8 過表達KIAA1429后LS180細胞內CyclinB1、E2F1、p21蛋白檢測 采用Western blotting法。按照1.3中所述方法提取OE-KIAA1429組和OE-NC組細胞的蛋白，應用Western blotting法，以β-Actin蛋白為內參，測定兩組細胞中的CyclinB1、E2F1、p21（均為兔源一抗，稀釋倍數為1∶1 000）蛋白，使用ImageJ軟件分析各個條帶的灰度并將其量化。

1.9 統計學方法 使用Prism 8（GraphPad）和Excel統計軟件。計量資料用ˉx±s表示，組間比較采用重復測量方差分析或獨立樣本t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。測序差異基因的GO和KEGG富集分析使用超幾何分布檢驗。

2" 結果

2.1 KIAA1429轉染效率 sh-NC組、sh-KIAA1429組KIAA1429蛋白相對表達量分別為0.979±0.028、0.299±0.138，兩組比較P=0.002。OE-NC組、OE-KIAA1429組KIAA1429蛋白相對表達量分別為0.446±0.104、0.899±0.153，兩組比較P=0.026。穩轉細胞株構建成功。

2.2 KIAA1429病毒轉染對結腸癌增殖能力的影響 CCK-8實驗顯示，敲低KIAA1429可以抑制結腸癌細胞的增殖速度，結果見表1；過表達KIAA1429可以促進結腸癌細胞的增殖，結果見表2。

平板克隆實驗顯示，RKO細胞中sh-NC組、sh-KIAA1429組細胞集落數分別為（77.33±8.99）、（46.00±3.74）個，兩組相比P=0.010；LS180細胞中OE-NC組、OE-KIAA1429組細胞集落數分別為（158.00±15.25）、（212.00±6.68）個，兩組相比P=0.01。

2.3 結腸癌細胞RKO降表達KIAA1429后差異表達基因的功能富集分析結果 KEGG富集分析結果顯示，sh-NC組、sh-KIAA1429組RKO細胞內的差異基因主要富集在DNA復制、細胞周期等通路，結果見圖1。GO分析中差異表達的基因主要富集的生物學過程為細胞周期的調控，主要富集的細胞組分為核小體、核染色質、復制叉等，主要富集的分子功能為組蛋白綁定、DNA解旋酶的活動、鳥苷核苷酸交換因子活性、3'-5' DNA解旋酶活性等，結果見圖2。KIAA1429對結腸癌細胞的細胞周期具有明顯的影響。

2.4 KIAA1429對結腸癌細胞周期的影響 RKO細胞中sh-NC組和sh-KIAA1429組的G0/G1期所占百分比分別為52.07%±1.00%、58.57%±0.98%，兩組相比P=0.003；LS180細胞中OE-NC組和OE-KIAA1429組的G0/G1期所占百分比分別為68.37%±0.82%、62.40%±1.34%，兩組相比P=0.006。

2.5 KIAA1429對結腸腺癌細胞周期相關蛋白的影響 OE-NC組CyclinB1、E2F1、p21蛋白相對表達量分別為0.491±0.116、0.661±0.132、1.007±0.058，OE-KIAA1429組分別為1.254±0.169、1.125±0.135、0.725±0.110，兩組相比P均lt;0.05。

3" 討論

m6A甲基化是真核細胞中最常見的RNA修飾，越來越多的研究探討了m6A失調在老年疾病（尤其是癌癥）中的病理意義［6，10］。先前的研究表明，甲基轉移酶KIAA1429在多種實體腫瘤中促進腫瘤的發生發展，發揮了促癌因子的作用［7-8］，尤其在胃癌［11］、結直腸癌［12］等消化道腫瘤中KIAA1429基因表達升高，并且與患者的不良預后相關。此外有研究發現KIAA1429還參與腫瘤能量代謝，在結腸癌細胞中敲低KIAA1429抑制了有氧糖酵解進而影響腫瘤的進展［13］。因此探討KIAA1429在結腸癌發生發展中的作用機制具有重要價值。

本研究首先構建了KIAA1429基因穩定敲低或過表達的細胞系用于后續實驗。眾所周知，不受控制的細胞增殖是癌癥的標志之一［14］，本研究CCK-8和平板克隆實驗結果顯示KIAA1429可以顯著促進結腸癌細胞在體外增殖的能力。這與已有的研究相符，說明在結腸癌細胞中KIAA1429分子具有明顯的促癌能力［9］。

為探究KIAA1429影響結腸癌增殖能力的分子機制，本研究選取轉染效率更加穩定的敲低KIAA1429及其陰性對照兩組RKO細胞系進行轉錄組測序，KEGG富集分析發現差異基因主要富集在DNA復制、細胞周期等通路。GO富集分析主要預測差異基因對應蛋白的功能，差異基因富集到的生物學過程主要為細胞周期的調控，細胞組分主要為核染色質、復制叉等組分，分子功能主要為DNA解旋酶的活動等有關的功能。這些富集結果均提示，在結腸癌細胞內KIAA1429與遺傳物質的復制、細胞的增殖，尤其是細胞周期調控密切相關［15］。由于細胞周期的異常是腫瘤發生的基本機制之一，這使得細胞周期機制的調節因子成為理想的抗癌治療靶點［16］，因此，本研究進一步探究了KIAA1429與細胞周期的關系。通過流式細胞術進行細胞周期檢測，結果顯示KIAA1429能夠顯著加快結腸癌細胞的細胞周期。為驗證富集分析所預測的結果，本研究應用Western blotting法探討了KIAA1429過表達在結腸癌中對細胞周期通路相關蛋白的影響。CyclinB1、E2F1和p21是細胞周期通路關鍵蛋白。CyclinB1作為首個被發現的細胞周期蛋白［17］，已被證明可以調節細胞周期從G2期到M期［18］，CyclinB1表達增加會加速有絲分裂，并可能導致細胞過度增殖。E2F1是G1/S檢查點的最終效應物，通過控制下游靶點的轉錄而起致癌作用［19］。p21是一種常見的細胞周期抑制劑，可以通過分別抑制Cyclin-D和Cyclin-E來阻止G1/S和G2/M通道中的細胞周期進程［20］。在癌癥中，p21通過與DNA復制的增殖細胞核抗原結合，抑制DNA合成，進而將細胞周期停滯［21］。因此，深入研究參與細胞周期通路的蛋白質對于未來的癌癥診療具有重要價值。本研究Western blotting法結果顯示，在結腸癌細胞LS180內過表達KIAA1429后CyclinB1、E2F1蛋白表達升高，p21蛋白表達下降。另外，有研究表明，在結腸癌細胞中BP10A能夠下調CyclinB1以抑制結腸癌細胞的分裂［22］，上調E2F1的水平能夠增強瓦博格效應進而促進結腸癌的進展［23］，抑制p21能夠促進結直腸癌的生長［24］。結合前人研究結果發現，本研究中CyclinB1、E2F1和p21的表達變化加快了細胞的周期，這恰好與KIAA1429在結腸癌細胞中促癌的趨勢一致。

綜上可見，m6A甲基轉移酶KIAA1429在結腸癌細胞中能夠通過調控細胞周期信號通路以加快細胞周期，進而促進結腸癌的細胞增殖，可被視為結腸癌的潛在治療靶點及預后標志物。

利益聲明" 所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明" 葉春水：實驗設計及實施，論文撰寫；劉源，馬成昊：參與實驗實施；李樂平，種微：指導實驗設計；陳浩，商亮：指導并修訂論文

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（收稿日期：2022-12-09）

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（82103322，KIAA1429介導STING的m6A甲基化修飾促進結腸癌惡性進展及免疫逃逸的機制研究）。

通信作者：李樂平（E-mail： lileping@medmail.com.cn）