環(huán)狀RNAs-000911對三陰性乳腺癌細(xì)胞株活性的影響

【摘要】" 目的" 探討環(huán)狀RNAs（circRNAs）-000911對三陰性乳腺癌細(xì)胞株活性的影響。方法" 培養(yǎng)80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，分為000911小干擾RNA組（circRNAs-000911組）和陰性對照組（si-NC組），各40株。將circRNAs-000911組和si-NC組分別轉(zhuǎn)染到對應(yīng)的MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測兩組細(xì)胞內(nèi)的circRNAs-000911表達水平，以細(xì)胞計數(shù)試劑盒檢測兩組細(xì)胞的活性，以EdU實驗檢測兩組細(xì)胞的增殖能力，以Transwell小室實驗對兩組細(xì)胞的遷移和侵襲能力進行檢測。結(jié)果" 經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，circRNAs-000911組內(nèi)的circRNAs-000911表達水平明顯低于si-NC組，細(xì)胞OD值、細(xì)胞陽性率明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；轉(zhuǎn)染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論" 抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞circRNAs-000911表達，能夠明顯增強MDA-MB-231細(xì)胞的活性和增殖能力，有效控制MDA-MB-231細(xì)胞遷徙和侵襲的能力。

【關(guān)鍵詞】" 環(huán)狀RNA-000911；三陰性乳腺癌；MDA-MB-231細(xì)胞株；細(xì)胞活性

中圖分類號" R737.9" " 文獻標(biāo)識碼" A" " 文章編號" 1671-0223（2023）12--04

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤，在全球女性腫瘤的發(fā)病率高居第1位，同時也是女性癌癥死因的第2位[1]。三陰性乳腺癌是孕激素受體、人類表皮生長因子受體2和雌激素受體均為陰性的乳腺癌，其惡性程度較高，容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2]。盡管臨床上對于乳腺癌的治療和診斷已經(jīng)取得了長足發(fā)展，但三陰性乳腺癌患者仍然存在較高的復(fù)發(fā)率，且在5年內(nèi)的死亡率也較高，因此對于三陰性乳腺癌的快速診斷和治療生物靶標(biāo)的研究是近些年的研究重點[3]。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）是一種存在體內(nèi)的非編碼RNA，有調(diào)節(jié)的功能，同時也是RNA異常剪切而生成的[4]。隨著臨床上對于遺傳學(xué)的研究加深，circRNAs也被逐步運用在腫瘤學(xué)的檢測當(dāng)中，且有越來越多的研究認(rèn)為circRNAs在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[5]。有關(guān)三陰性乳腺癌與circRNAs的關(guān)系目前鮮有研究[6]。本研究旨在探討circRNAs-000911對三陰性乳腺癌細(xì)胞株活性的影響，為三陰性乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物和靶標(biāo)提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑與儀器

80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購自美國ATCC公司的細(xì)胞庫。000911小干擾RNA和陰性對照購自于廣州瑞博奧生物科技有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及U6引物購自于上海吉至生化科技有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、Trizol試劑、青霉素鏈霉素雙抗、胎牛血清、RNA純化試劑盒、5-乙炔基-2脫氧尿嘧啶核苷以及DMEM培養(yǎng)基均購自于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。PrimeScript RTRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于日本Takara公司。Transwell小室購自于安捷倫科技（中國）有限公司。基質(zhì)膠購自于廈門模基生物科技有限公司。熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀和核酸蛋白測定儀購自于上海優(yōu)寧維生物科技股份。

1.2" 細(xì)胞培養(yǎng)

80株三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株分為000911小干擾RNA組（circRNAs-000911組）和陰性對照組（si-NC組），各40株。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，陰性si-NC組則運用MEBM培養(yǎng)基。兩種細(xì)胞都于37℃和5%CO2體積分?jǐn)?shù)下進行培養(yǎng)，每3天更換次培養(yǎng)基，細(xì)胞融合率大于80%時即進行細(xì)胞傳代從而進行后續(xù)實驗。

1.3" 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

獲取對數(shù)生長后的MDA-MB-231細(xì)胞，將其濃度調(diào)整為4×104/ml，并接種到6孔板內(nèi)，si-NC組和circRNAs-000911組各設(shè)置3個復(fù)孔。各組細(xì)胞貼壁度gt;70%后則根據(jù)說明書完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。si-NC的序列：正向引物：5'-AGGUUUACAUGUUCCAAUAUG-3'，反向引物5'-UAUUGGAACAUGUAAACCUGG-3'；circRNAs-000911：正向引物：5'-GGUUUGUUGUUG UUCUUAUU-3'；反向引物：5'-UUAAGAACAACAAC AAACCAA-3'。轉(zhuǎn)染完成后將兩組細(xì)胞繼續(xù)進行培養(yǎng)，持續(xù)轉(zhuǎn)染6h后更換為DMEM培養(yǎng)基，再次轉(zhuǎn)染48h后對細(xì)胞進行收集以進行后續(xù)的實驗。

1.4" circRNAs-000911表達水平檢測

轉(zhuǎn)染48h后收集兩組MDA-MB-231細(xì)胞到離心管內(nèi)，通過PBS清洗并高速離心去除上清液后，將其加入到Trizol試劑并放在冰上進行裂解，將200μl三氯甲烷加入各組樣品內(nèi)，萃取后在15000r/min下高速離心15min。獲得400μl上清液，通過異丙醇使水相內(nèi)RNA沉淀，再次進行15000r/min高速離心，連續(xù)離心10min，隨后以75%乙醇將RNA洗滌并沉淀，再次以7500r/min高速離心5min，舍棄上清液后。在室溫內(nèi)干燥，隨后加入DEPC水，保存于-80℃下。通過酶標(biāo)儀對RNA的濃度以及純度進行測定。按照說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在30℃下30min，在70℃下10min，在4℃下5min。實時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)的條件為：在95℃下反應(yīng)5min；在95℃下反應(yīng)25s，在60℃下反應(yīng)25s，在72℃下反應(yīng)5min，以上反復(fù)40個循環(huán)；在72℃下反應(yīng)5min。獲得溶解曲線，檢測目的基因為各組細(xì)胞內(nèi)熒光閾值，以2-△△Ct法進行計算，計算各組基因的相對表達量。

1.5" 細(xì)胞活性檢測

收集兩組轉(zhuǎn)染48h后的MDA-MB-231細(xì)胞，每孔400個細(xì)胞并接種在96個孔板內(nèi)，根據(jù)CCK-8試劑加入的時間分為4個亞組，各組均設(shè)置3個復(fù)孔。各組細(xì)胞都于37℃和5%CO2體積分?jǐn)?shù)下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)前以及培養(yǎng)后24、48、72h對96孔板的培養(yǎng)基進行吸取，各孔內(nèi)加入90μl的DMEM培養(yǎng)基和10μl的CCK-8試劑，試劑加入后再次孵育2h，通過酶標(biāo)儀對各組細(xì)胞的光密度值進行測定，其能夠反映出細(xì)胞的活性。

1.6" 細(xì)胞增殖能力檢測

收集兩組轉(zhuǎn)染48h后的MDA-MB-231細(xì)胞，每孔400個細(xì)胞并接種在96個孔板內(nèi)，以各孔5×103細(xì)胞將其接種到96孔板內(nèi)，各組3個復(fù)孔。各組細(xì)胞都于37℃和5%CO2體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)3h，根據(jù)EdU試劑盒說明書對MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力進行檢測。兩組細(xì)胞通過甲醛固定，隨后以PBS將甲醛洗去，隨后孵育20min。向各孔內(nèi)加入1ml細(xì)胞染色劑并在暗處孵育25min。通過PBS反復(fù)洗滌3次，將染色液洗出。隨后以熒光顯微鏡進行染色標(biāo)記細(xì)胞計數(shù)和拍照。染為紅色的則是陽性，也說明有更高的活性。

1.7" 細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測

采用有8mm孔徑小室的24孔板，同時將100μl基質(zhì)凝膠以DMEM培養(yǎng)基稀釋，各孔100μl加入至24孔板上室內(nèi)過夜。收集兩組轉(zhuǎn)染48h后的MDA-MB-231細(xì)胞，以各孔1×103細(xì)胞將其接種到24孔板上室，下室加入600μl的DEME培養(yǎng)基，各組均設(shè)置3個復(fù)孔。各組細(xì)胞都于37℃和5%CO2體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)24h，隨后以棉簽將上室沒有侵入的細(xì)胞擦拭掉，在室溫條件下固定細(xì)胞，隨后以結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察，并對侵襲細(xì)胞數(shù)目進行計算。

1.8" 數(shù)據(jù)處理方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以“±s”的形式表示，組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間率比較采用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" 兩組MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)circRNAs-000911表達水平比較

經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，circRNAs-000911組的circRNAs- 000911表達水平明顯低于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2" 兩組MDA-MB-231細(xì)胞活性比較

轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞在0、24和48h時OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.5）；在轉(zhuǎn)染后72h時，circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞OD值明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。見表2。

2.3" 兩組MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力比較

轉(zhuǎn)染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞陽性率明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表3。

2.4" 兩組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測

轉(zhuǎn)染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表4。

3" 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌中較特殊的一種，有高復(fù)發(fā)率和死亡率的特點。由于此類患者的孕激素受體、人類表皮生長因子受體2和雌激素受體均為陰性，導(dǎo)致其抗人類表皮生長因子受體2靶向藥和內(nèi)分泌藥物治療的效果較差，臨床上對其也主要以化療進行治療[7-8]。因此，對于三陰性乳腺癌的新型診斷和治療生物標(biāo)志物是近些年的研究重點，本研究為此而展開討論。

隨著RNA技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)的進步，ncRNA成員之一的circRNA也被逐步運用在多種癌癥的檢測當(dāng)中[9]。circRNA具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這也使其具有高穩(wěn)定性的特點，并且其主要分布在真核生物內(nèi)，具有組織和細(xì)胞的特異性[10-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在乳腺癌、肺癌、胃癌和肝癌等癌癥的發(fā)生中發(fā)揮著較高的作用[12]。胡夢婷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-0000231能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞的侵襲、遷移和增殖進行有效的抑制，同時還能夠促進腫瘤細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞的周期進行阻滯。circRNA-000911是circRNA的一種，能夠特異性海綿化miR-449a，并且釋放Notch1對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和分化進行抑制。本研究通過000911小干擾RNA轉(zhuǎn)染后，circRNAs-000911組的circRNAs-000911水平明顯低于si-NC組。對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后72h時，circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞OD值明顯高于si-NC組。提示，抑制circRNAs-000911的表達會明顯增強乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的活性，促進腫瘤的生長發(fā)育。MiR-449a能夠增強細(xì)胞活性以及乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而其能夠逆轉(zhuǎn)circRNAs-000911誘導(dǎo)腫瘤抑制的功能，可見circRNAs-000911能夠抑制miR-1449a活性，進而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞的作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞陽性率明顯高于si-NC組。提示，對circRNAs-000911表達進行抑制，能夠明顯提高乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力。同時進一步進行細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后circRNAs-000911組MDA-MB-231細(xì)胞遷移率和侵襲率均明顯高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這也進一步證實了circRNAs-000911在三陰性乳腺癌中的作用，對其進行抑制能夠明顯提高腫瘤細(xì)胞的遷移率和侵襲率。但本研究僅僅降低了三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的表達，并未進行高表達circRNAs-000911后，三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活性、增殖、遷移和侵襲功能的差異。

綜上所述，抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞circRNAs-000911表達，能夠明顯增強MDA-MB-231細(xì)胞的活性和增殖能力，有效控制MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲的能力。

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[2023-04-10收稿]