結核分枝桿菌潛伏感染與活動性結核病的鑒別診斷

夏輝 王瑞白 趙雁林

我國既是結核病高負擔國家，也是結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)高負擔國家。2021年，估算我國有78萬例(66.5萬例～90.5萬例)結核病患者[1]。2013年我國5歲及以上人群結核分枝桿菌潛伏感染率為18.08%，15歲及以上人群潛伏感染率為20.34%，呈現隨年齡增長而增高的趨勢[2]。普遍認為，約5%～10%未經治療的LTBI者在一生中會進展為結核病，但很多研究支持大多數LTBI者中位潛伏期為數月至2年，只有小部分人是2年后患結核病。因此，鑒定出近期進展為活動性結核病甚至是已經處于活動性結核病早期的患者非常重要。目前，活動性結核病確診主要依靠病原學檢查，但即使經過多方面努力，尤其是大力推廣結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)核酸分子生物學檢測技術，2021年我國結核病患者病原學確診的比例也僅達到58%[1]，即約40%的患者為臨床診斷疑似病例。因此，活動性結核病的診斷除了繼續改善病原學檢測技術外，基于免疫學或其他生物標志物的檢測方法也成為另一熱點和方向，以彌補疾病早期階段菌量極低或由于感染部位不同而不排菌的病原學陰性患者的診斷。

一、現有免疫學檢測技術的局限性

目前應用最多的基于宿主免疫反應的技術主要有結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)和γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)。這兩類方法檢測的是個體之前是否暴露過MTB，但對預測將來何時發展活動性結核病或鑒別現在是否為活動性結核病效果并不理想。因為人體暴露于MTB后，大多數MTB免疫反應性個體清除了感染，但同時保留了對它的免疫記憶[3]。IGRA更新產品Quantiferon-Gold Plus額外增加了用于刺激MTB特異性CD8+T細胞和CD4+T細胞的抗原，以期實現不同感染階段的識別，但基于既往的研究并沒有顯示出其有明確的有效鑒別LTBI和活動性結核病的能力[4-5]。除了傳統的 TST 之外，基于重組早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)抗原的新型皮膚試驗如C-TST(安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司)可以解決因卡介苗接種和非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)感染出現的TST假陽性問題，但因與IGRA使用類似的抗原進行刺激，因此，其用于鑒別LTBI和活動性結核病的能力預計與IGRA類似。盡管我國肺結核診斷標準中這些技術可以作為活動性結核病的輔助診斷方法，但是世界衛生組織明確IGRA和TST這兩類方法不能在中低收入國家用于診斷結核病及肺外結核，包括合并HIV者，因這兩種方法的敏感度和特異度及證據質量均很低。IGRA在疑似結核病患者中檢測活動性結核病的敏感度為73%～83%，特異度為49%～58%，意味著50%的陽性結果用于診斷活動性結核病時是假陽性。另外，沒有證據表明IGRA在診斷活動性結核病方面比傳統的微生物檢測更有價值[6]。

二、鑒別LTBI和活動性結核病生物標志物研究進展

LTBI至發生活動性結核病是一系列具有特定微生物學和免疫學特征的異質性過程[7]。基于此，可以推測潛伏感染部位像活動性結核病病灶一樣包含不同狀態的細菌群體，既有易于被抗結核藥物控制的活躍復制的MTB[8]，也有耐受藥物的代謝靜止的MTB。MTB感染后處于何種狀態是宿主-微生物相互作用的結果。每個階段宿主遭受的損傷程度可能有所不同。因此，目前關于LTBI和活動性結核病鑒別診斷研究的挑戰可以理解為確定從哪個閾值開始相對靜止的感染轉變為活動性，即早期疾病發生。這種閾值的確定對于免疫功能正常的宿主與免疫抑制或缺陷的宿主可能并不相同[9]。因此，開發更好的可以區分LTBI和活動性結核病的診斷技術需要更多了解MTB及其宿主反應。

(一)免疫學檢測新型抗原

目前廣泛使用的抗原如ESAT-6和CFP-10是因為它們對MTB感染的高免疫原性和特異性，而不是因為它們預測LTBI進展為活動性結核病或鑒別活動性結核病的潛力。ESAT-6被認為是最具免疫原性的蛋白質之一，但它在整個潛伏期及感染的活動階段都會分泌，因此，使用其作為抗原無法進行良好的疾病階段特異性診斷[10]，基于這些抗原免疫反應的診斷技術(如新型TST和IGRA)區分LTBI和活動性結核病的能力也有限。因此，額外加入潛伏期階段特異性的抗原或使用替代抗原可以作為一種新思路來鑒定不同的MTB感染階段。

LTBI中T細胞對MTB的一組潛伏期[休眠期生存調節因子(dormancy survival regulon，DosR)]和復蘇促進相關抗原[復活促進因子(resuscitation promoting factor，Rpf)]的反應明顯高于活動性結核病。一項系統綜述顯示，已有300余種新型MTB抗原被關注和研究，其中，Rv2031c、Rv2029c、Ag85復合物抗原、Rv0475[肝素結合血凝素(heparin-binding adhesin，HBHA)編碼基因]、Rv2628、Rv1733c、Rv1737c、Rv0081、Rv2032、Rv0867c和Rv2389c成為研究熱點[11]。這些抗原中大多數屬于DosR的一部分，少部分(如Rv0867c和Rv2389c)屬于Rpf。Rv0081、Rv1733c、Rv1737c、Rv2029c、Rv2031、Rv2628、HBHA等是研究最廣泛的抗原，且在不同的研究和地區中均顯示出很好的免疫原性。考慮到差異區域(region of difference，RD)抗原是MTB特異性的，為了在卡介苗接種地區也能獲得良好的鑒別能力，Gong和Wu[12]從MTB的133種RD相關抗原和124種潛伏期相關抗原中找出交集的21種潛伏期特定的RD相關抗原，包含Rv1736c、Rv1737c、Rv2031c、Rv2626c、Rv2653c、Rv2654c、Rv2656c、Rv2657c、Rv2658c、Rv2659c、Rv2660c、Rv1511、Rv1978、Rv1980c、Rv1981c、Rv3872、 Rv3873、 Rv3878、 Rv3879c、 Rv3425和Rv3429。這些LTBI階段特異性新抗原結合γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)或其他細胞因子的測量在LTBI者和活動性結核病患者中存在差異，進而可以用于提高LTBI和活動性結核病的鑒別能力。因此，針對這些潛伏感染階段特異性的抗原或許可以作為LTBI 的確定(rule in)方法，但在臨床隊列研究中的表現仍需要更多的證據支持。

(二)細胞因子或其他分析物

MTB暴露后引起的免疫反應并不限于INF-γ的釋放，通過測量響應MTB抗原產生的其他細胞因子和(或)趨化因子等可以提高鑒別活動性結核病和LTBI的能力。很多研究將干擾素誘導蛋白10(CXCL10/IP-10)作為IFN-γ的潛在替代生物標志物。IP-10響應IFN-γ信號由單核細胞、中性粒細胞和其他細胞大量產生，從而放大Th1 CD4+T細胞對抗原刺激的IFN-γ反應，參與將Th1細胞運輸到炎癥區域，在該區域與CXCR3(IP-10、Mig和I-TAC 共同受體)結合。活動性結核病患者在MTB抗原刺激后IP-10水平明顯升高，在區分活動性結核病和LTBI時具有較好的敏感度[13]，即使未經MTB特異性抗原刺激，在mRNA和蛋白水平上與LTBI相比，IP-10仍顯示出與活動性結核病很強的關聯性[14]。然而，并非所有研究都表明IP-10在鑒別活動性結核病和LTBI時的性能優于IFN-γ。

白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)主要由抗原激活的T細胞產生，但也由自然殺傷細胞和樹突細胞產生。IL-2是適應性免疫活性的主要成分。抗原與T細胞受體結合后刺激IL-2分泌和IL-2受體表達，IL-2受體連接激活JAK/STAT通路，致T細胞生長、增殖、分化為效應T細胞和記憶T細胞。雖然一些研究顯示單獨應用IL-2[15]或者IL-2聯合其他細胞因子(如IL-2/IFN-γ[15]和IL-2/VEGF/IFN-γ組合[16])可以作為活動性結核病和LTBI鑒別的標志物，但其確切價值尚存爭議。

除了IP-10和IL-2外，目前研究過的分析物超過百余種，包含白介素類(如IL-1α/β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等)、趨化因子(如CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α/β、MCP、RANTES、I-309等)及其他細胞因子(如TNF-α、VEGF、GM-CSF、G-CSF、MMP-9、TGF-β等)等[17]。雖然單一或者組合應用某種分析物可作為鑒別活動性結核病的標志物，但各研究間差異較大，結論并不統一，需要進一步的前瞻性研究來確定生物標志物的最佳選擇和組合，以提高在臨床實踐中的診斷能力。

(三)細胞亞型及功能

測量MTB特異性T細胞的表型和功能標志物，探索更加復雜的MTB特異性T細胞亞群的數目和比例可能區分不同的感染階段。一些研究比較了MTB特異性CD4+T細胞的分化(CD27和KLRG1)、活化(HLA-DR)、歸巢潛能(CCR4、CCR6、CXCR3 和 CD161)和細胞因子(IFN-γ、IL-2 和 TNF-α)的變化。與LTBI相比，CD4+T細胞亞群在活動性結核病患者中對MTB刺激發生重大變化，促進記憶成熟、活化升高和炎癥潛能增加。此外，MTB特異性CD4+T細胞的功能特征似乎與它們的分化程度有內在關聯，其中，MTB特異性IFN-γ+T細胞的HLA-DR和CD27表達水平均可以區分LTBI和活動性結核病，尤其是前者表現更好[18-21]。CD4+T細胞的CD38和Ki67[20-21]表達亦被認為可以鑒別活動性結核病與LTBI，但CCR4單獨作為標志物的鑒別作用則不明確[22]。而且，由多種細胞因子共表達定義的MTB特異性細胞比由一種細胞因子表達定義的MTB特異性細胞可能具有更好的區分活動性結核病患者和LTBI者的能力[23]，如MTB特異性CD38+CD27-TNF-α+CD4+T細胞亞群[24]、CD27-IFN-γ+TNF-α+CD4+T細胞亞群及CD27-CCR4+IFN-γ+CD4+T細胞亞群[22]均可有效區分活動性肺結核與LTBI。

此外，中性粒細胞[25]或循環單核細胞[26]的CD64表達、CD4+中央記憶型T細胞分布及其在MTB激活后的CD154表達[27]、單核細胞與淋巴細胞的比值[26]、效應記憶與中央記憶Th1細胞的比值[28]在活動性結核病與LTBI比較時均有明顯差異。除了MTB刺激相關特異性的生物標志物外，有研究發現非特異性功能CD4+T細胞、非特異性功能自然殺傷細胞和CFP-10斑點數的組合應用[29]、NKG2C+自然殺傷細胞[19]、多形核髓源性抑制細胞[30]也可作為區分活動性結核病和LTBI的生物標志物。

(四)基因表達與調控

1.基因表達：因MTB感染為動態進程，因此，依賴單一生物標志物來鑒別活動性結核病和LTBI可能無法獲得理想效果，而多個標志物組合可能帶來新的希望。如分析各種不同的血液轉錄特征及組合可用于結核病的診斷及鑒定。以往研究顯示，標志物組合數量大小不一，最多的一項研究多達393個基因[31]。Leong等[32]構建了基于印度人群RNA測序數據的預測模型，定量評估了已發表的編碼基因生物標志物鑒別活動性結核病和LTBI的能力。其發現來自Berry等[31]研究的393個生物標志物組合在所有8組[31,33-36]已知生物標志物組合中表現最好。Warsinske等[37]開展的前瞻性研究顯示，基于3個基因的mRNA表達評分模型[(GBP5+DUSP3)/2-KLF2]與LTBI進展為活動性結核病有較好相關性，且預測時間點比利用痰標本檢測到細菌早6個月。此模型已經商品化，稱為Xpert TB Host response，但其確切價值尚需更多研究。Petrilli等[38]發現評估的594個炎癥基因中有7個基因的表達水平能夠顯著區分活動性結核病和LTBI。總之，基于宿主的編碼基因組合可以提供識別活動性結核病患者的潛在能力，并有可能在病原學檢查陽性之前預測LTBI進展為活動性結核病的個體，但診斷組合中基因組合的數量和組成需要進一步摸索和優化，以提高診斷的準確性和可行性。

2.表達調控：感染MTB后，除了某些編碼基因表達改變外，MTB與人類共同進化也有效地改變了宿主表觀基因組，通過激活或抑制對病原體產生免疫反應的基因表達而在免疫調節中發揮重要作用。近些年，表觀遺傳因素如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA作用在疾病發生和發展中的作用逐漸被重視。DNA甲基化已經作為腫瘤及其他疾病診斷的重要方法[39]，但在結核病領域研究尚少。Gauba等[40]總結了MTB感染后宿主中發生的表觀遺傳修飾及其靶點如核心組蛋白H3精氨酸(H3R42)非尾端的二甲基化、腺嘌呤甲基化形成 N6-甲基腺嘌呤、IFN-γ引發的組蛋白H3和H4乙酰化、組蛋白乙酰化和去乙酰化等，以及與臨床表型相關的結核病患者的表觀遺傳修飾如TLR2啟動子區域的異常甲基化、PARP9和miR505 低甲基化、RASGRP4高甲基化和RPTOR下調、CpG-15/-17 低甲基化和CpG18高甲基化、H3K14 低乙酰化、H3K27me3高甲基化等。但這些修飾對于鑒別LTBI和活動性結核病的價值并未進行更加深入的探索。Du等[41]利用甲基化芯片分析最終發展為活動性結核病的LTBI者和同等數量的仍保持健康的LTBI者的全基因組DNA甲基化水平，其中8個差異甲基化(dmCpG)位點被確定與活動性結核病發生相關。這些研究提示表觀遺傳調節在鑒別活動性結核病和LTBI的潛在價值。

microRNA(miRs)是一類長度約為22 nt的非編碼小分子RNA，通過調節mRNA的穩定性和翻譯從而對蛋白質的生物活性產生影響。基于miRs的差異表達，特定的miRs已被初步確定為潛在的鑒別LTBI和活動性結核病的生物標志物。Wang等[42]使用miRs芯片鑒定出17個差異表達miRs，其中12個在活動性結核病上調。但由于使用的芯片方法的局限性，可能導致一些未知的miRs被漏掉。Looney等[43]發現miRs和甲基化共同調節巨噬細胞反應過程，包括免疫細胞激活、巨噬細胞代謝和AMPK通路信號傳導。除miRs外，核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)及與Piwi蛋白相作用的RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)也可能作為MTB感染各個階段的生物標志物和發病因素。de Araujo等[44]測量了MTB感染不同階段患者血液樣本中4種主要類型的小非編碼RNA的表達變化，除了miRs(已知在活動性結核病患者的血細胞中表達上調)外，snoRNA和piRNA在活動性結核病和LTBI中的表達都發生了很大變化。

(五)抗體與補體

體液免疫對MTB感染的免疫保護作用仍不明晰。盡管我國在臨床上廣泛使用抗體作為活動性結核病輔助診斷方法，但世界衛生組織并不推薦使用。最近的一些研究表明，特定抗體和B細胞反應與不同的MTB感染階段有關，并且在活動性結核病和LTBI個體之間觀察到不同的抗體特征。如LTBI與獨特的抗體Fc片段功能特征、FcγRⅢ的選擇性結合和不同的抗體糖基化模式有關。IgG-Fc上發現的二半乳糖聚糖結構可將LTBI與活動性結核病鑒別開來。此外，MTB特異性IgG4在活動性結核病中升高，但在治療后明顯降低[45-46]。另一項多中心研究評估了57種MTB抗原的特異性抗體(單獨或聯合使用)用于診斷活動性結核病患者，但特異度均較差[47]。因此，開展更多的整合MTB特異性抗體的表型和功能的研究來改善此類檢測方法的診斷性能非常必要。Lubbers等[48]研究了補體成分C1q作為血清生物標志物檢測活動性結核病的價值。與4個國家的獨立隊列中的 LTBI 相比，活動性結核病患者的C1q水平明顯升高。

(六)循環細胞游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)

除了以上基于宿主的生物標志物外，基于病原的標志物如痕量cfDNA也可能作為一種候選。cfDNA指在血液和其他體液中的非細胞成分中發現的核酸片段。這些核酸被認為來源于瀕臨死亡的人類細胞和微生物，當它們分解時，這些細胞和微生物會將其內容物釋放到血液中。cfDNA比基因組DNA小得多，平均大小為170 bp。大多數研究聚焦于其作為診斷活動性結核病的效能[49]，有少數研究試圖探究其用于區分活動性結核病和LTBI的應用。一項研究將活動性結核病密切接觸者和經IGRA確認的LTBI作為對照組，發現其中大多數LTBI者的cfDNA顯示陰性，但其中2例與結核病患者接觸的LTBI者的IS6110 cfDNA檢測呈陽性(Ct cutoff值為38.2)，推測2例LTBI者在登記時可能處于極早期結核病階段[50]。這2例LTBI者接受了抗結核預防性治療。然而，他們在隨訪期間并沒有發展為活動性結核病。需要進一步的研究來評估LTBI狀態對MTB cfDNA檢測性能的影響；推測認為cfDNA陽性者的抗原呈遞細胞比cfDNA陰性者更加容易誘導MTB特異性適應性免疫反應，從而將cfDNA釋放到體液中。通過定量cfDNA的濃度變化可能檢測到目前無法用傳統微生物學方法識別的疾病，從細胞和組織水平評價宿主對感染的反應[51](假設用于cfDNA檢測技術有足夠高的敏感度)。

三、問題與展望

盡管TST和IGRA已經在學生及免疫抑制等特殊人群廣泛用于LTBI篩查，并在臨床用于活動性結核病的輔助診斷，但其在鑒別活動性結核病和LTBI方面價值有限。隨著對于MTB與人體免疫系統互相作用機制認識的不斷深入，基于MTB感染特異性的新型標志物成為改善鑒別診斷的潛在目標。但既往研究仍然存在著一些需要解決的問題。

首先，各研究之間的生物標志物選擇及效能重復性較差，主要源于研究設計的差異、不同的宿主遺傳背景、病原體譜系、感染時間、結核病的部位和持續時間，以及分析方法的技術差異等。因此，需要在代表現實世界的多樣化、異質性的感染者和獨立隊列，不同的地理環境(不同的宿主遺傳背景和循環病原體譜系)，不同免疫水平的人群中驗證目標生物標志物。

其次，以往用于探索鑒別LTBI和活動性結核病生物標志物的研究中，研究對象納入的是經TST 或IGRA判定的LTBI者及經培養等病原學方法確認的活動性結核病患者，但由于LTBI的診斷缺乏金標準，而基于現有敏感度有限的病原學方法的結核病確診患者也不能代表活動性疾病發展的早期階段，因此，基于這個前提對LTBI和活動性結核病生物標志物的研究也并不能完全解釋整個感染的疾病進程，尤其是在由LTBI向活動性結核病進展的最早期階段。評估陽性預測值的前瞻性縱向隊列研究是可能比較LTBI檢測性能的最佳方法。目前，我國LTBI的預防性治療尚處于起步階段，建議我國建立完整的大人群隨訪隊列，針對生物標志物尋找和驗證的研究可以整合入此隊列，探索并確立各個感染階段甚至是治療后的相關生物標志物。

再次，考慮到MTB與人類宿主之間相互作用的異質性，生物標志物需要在此動態變化中能夠定義特定位置或時段，因此，針對不同靶標，采用高通量技術可以更加全面地揭示宿主反應的不同方面，通過組合來自各個維度的標志物，獲得更深入的生物學解釋和更準確的鑒別診斷方法。當然，此類生物標志物的實用性還高度依賴于將科研轉化為臨床實踐可用的技術或平臺，以允許在真正需要鑒別診斷的患者就診環境中進行應用。

鑒于我國MTB流行菌株主要為L2家系，與歐美國家不同，因此，宿主產生的免疫反應也不會完全相同。我國相關科研、醫療機構及主管單位、學者、企業應共同參與研究和轉化，發揮各自所長和優勢，探索出適合我國應用的鑒別LTBI和活動性結核病的生物標志物和技術。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻夏輝：醞釀和設計實驗、起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導；王瑞白：對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費；趙雁林：分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費