趨化因子用于結(jié)核病診斷的研究進展

馬子淳 尚媛媛 逄宇 李姍姍

結(jié)核病的診斷亟需更加高效、便捷的新方法和新技術(shù)。結(jié)核病的診斷方式多樣，痰涂片檢出率低；作為病原學(xué)診斷金標準的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培養(yǎng)耗時長；結(jié)核菌素皮膚試驗特異度不高，存在一定的風險[1]。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、線性探針分析、GeneXpert MTB/RIF和全基因組測序等新型分子診斷方法已被用于結(jié)核病的診斷。但是具有高敏感度、用時短，以及成本低的生物標志物仍有待挖掘[2]。趨化因子是一個龐大的分泌蛋白家族，通過細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)出信號[3]，趨化細胞遷移。研究表明，趨化因子對結(jié)核病導(dǎo)致的肉芽腫形成和維持，以及從外圍募集淋巴細胞定位于肉芽腫中起著關(guān)鍵作用[4]。趨化因子及其受體在結(jié)核病診斷中的相關(guān)研究正逐漸成為熱點。

一、趨化因子概述

1.趨化因子的結(jié)構(gòu)及其分類：趨化因子是一類高度保守的蛋白家族(相對分子質(zhì)量8000～12 000)，參與許多生物過程，包括趨化細胞遷移、免疫細胞脫顆粒、造血和血管生成[5]。趨化因子通常根據(jù)其高度保守的半胱氨酸殘基的順序定位被分為3個亞家族，分別是CC模體(C-C motif，CC)趨化因子、CXC模體(C-X-C motif，CXC)趨化因子、C-X3-C模體(C-X3-C motif，CX3C)。在CC亞家族中，前2個半胱氨酸是相鄰的。在CXC亞家族中，前2個半胱氨酸被1個氨基酸殘基分離。而CX3C趨化因子在前2個半胱氨酸殘基之間有3個氨基酸。C趨化因子亞家族是一個例外，只有1個N端半胱氨酸殘基，缺少這些半胱氨酸的第1個和第3個殘基。這些特殊的分子結(jié)構(gòu)與其作為趨化因子的功能密切相關(guān)[3]。

2.趨化因子的生物學(xué)功能：趨化因子大多被歸類為炎性因子。它們在炎性反應(yīng)中控制免疫細胞募集過程中起著關(guān)鍵作用，即趨化因子在組織免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用[6]。趨化因子在人體內(nèi)與自身相對應(yīng)的靶細胞上的受體結(jié)合，通過誘導(dǎo)G蛋白的β、γ亞基解離的方式激活相應(yīng)的信號通路，發(fā)揮其生物學(xué)功能[7]。不同類型的趨化因子其分工也各不相同，CC趨化因子主要趨化單核細胞，CXC趨化因子主要趨化中性粒細胞，C趨化因子可對淋巴細胞起趨化作用，CX3C亞家族主要參與巨噬細胞和淋巴細胞的遷移和活化[8]。除此之外，趨化因子還在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著其他功能。如CCL25-CCR9軸，它在胸腺T細胞發(fā)育中起著重要作用[6]。

3.趨化因子在MTB感染過程中發(fā)揮的作用：趨化因子對于招募和協(xié)調(diào)免疫細胞進入MTB感染的肺部這一過程至關(guān)重要。單核細胞募集和定位可以有效控制細菌的增長，防止其發(fā)展為彌漫性的粒細胞炎癥[9]。如干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10/CXCL10)可以通過與靶細胞的受體結(jié)合來介導(dǎo)人體內(nèi)免疫細胞的遷移和活化，在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要的作用[10]。但同時，某些趨化因子和細胞因子則加劇感染的擴散及組織的破壞，他們對于抗MTB感染過程的作用是雙重的，在特定條件下，趨化因子也會導(dǎo)致不呈比例的炎癥和肺損傷，從而加速肺部疾病和空洞化的進展[11]。因此，通過對特定的趨化因子的定量檢測，有可能對患者的病情發(fā)展進程及預(yù)后情況進行評估[12]。

二、CCL(C-C motif)及其受體

1.CCL1：CCL1是CC趨化因子家族中的趨化因子，其受體為CCR8。它由活化的T細胞分泌，吸引其他免疫細胞包括單核細胞、自然殺傷(NK)細胞和樹突細胞到感染部位[13]，作為T細胞激活標記物的CCL1的大量表達反映了控制MTB的持續(xù)免疫反應(yīng)。研究表明，趨化因子CCL1在肺結(jié)核患者的血漿中的濃度明顯增高[4]。同時，CCL1和抗炎細胞因子白細胞介素-2Ra(interleukin-2Ra，IL-2Ra；CD20)在結(jié)核病患者中的表達濃度高于潛伏感染個體，并且在組間鑒別診斷方面具有很強的潛力。在區(qū)分未感染HIV個體是活動性結(jié)核病還是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)狀態(tài)時，CCL1被列入前20個最精準的診斷標志物組合，由RANTES、CCL1、CRP和MIP-1α組成的四聯(lián)生物診斷指標可在無論是否感染HIV的前提下區(qū)分活動性結(jié)核病和LTBI[14]。

2.CCL2(MCP-1)：CCL2是一種強大的炎性趨化因子，屬于C-C家族，其受體為CCR2。CCL2可協(xié)助單核細胞和活化T細胞趨化募集到MTB感染的部位，使其發(fā)揮抑菌功能，并可促進肉芽腫的形成，與結(jié)核病的發(fā)展有著密切的聯(lián)系[15]。有報道稱，CCL2對MTB具有保護作用，在激活巨噬細胞的同時被腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激[16]。CCL2與Th1細胞因子如γ-干擾素和TNF-α呈正相關(guān)，因此，對于Th1細胞對結(jié)核病的適當應(yīng)答至關(guān)重要，其表達量的高低會影響結(jié)核病的易感性[17]。相關(guān)研究表明，CCL2的表達量與肺結(jié)核患者預(yù)后效果差的風險性相關(guān)，其有望成為評估肺結(jié)核患者預(yù)后情況的免疫學(xué)指標[18]。

3.CCL3(MIP-1α)和CCL4(MIP-1β)：CCL3和CCL4有68%的氨基酸是同源的。人CCL3和CCL4在大多數(shù)成熟造血細胞中誘導(dǎo)表達，CCL4已被確定為結(jié)核病易感基因[19]。CCL4的唯一受體是CCR5。CCL4是NK細胞、單核細胞和其他免疫細胞對感染部位的趨化劑。它誘導(dǎo)其他細胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α從成纖維細胞和巨噬細胞的合成和釋放。CCL4先前已被證明可以在唾液和血清中區(qū)分結(jié)核病和其他肺部疾病[20]。但也有研究表明，CCL4在使用橫向流動分析法測定其在胸腔積液和全血中的水平以診斷結(jié)核病的實驗中特異度不高，有待進一步研究[21]。通過新一代QuantiFERON(QFT)檢測方法，研究人員發(fā)現(xiàn)CCL4在活動性結(jié)核病患者中的表達要遠高于LTBI者[22]。一項研究通過對結(jié)核病患者血漿中的趨化因子進行單變量和多變量條件回歸分析，發(fā)現(xiàn)基線血漿CCL3和CCL4的濃度與不良治療結(jié)果的增加率相關(guān)：并且發(fā)現(xiàn)血漿CCL4在診斷肺結(jié)核時的敏感度和特異度較低，但相反，CCL3具有85%的敏感度和85%的特異度，表明CCL3更有希望作為預(yù)測結(jié)核病預(yù)后情況的生物學(xué)指標[18]。

4.CCL5(Rantes)：CCL5是趨化因子家族中十分重要的一員。它主要參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，發(fā)揮招募、激活和共同刺激T細胞和單核細胞的作用，可抑制MTB的生長[23]。CCL5的主要受體為CCR5，其通過與CCR5的相互作用，可以募集CD4+T細胞等相關(guān)免疫細胞進入受MTB侵害的部位，在結(jié)核免疫應(yīng)答中發(fā)揮十分重要的作用[10]。此外，研究表明，編碼CCL5的rs2107538基因和rs2280788基因的多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)[24]，因此，有可能通過測定特定CCL5的基因?qū)θ巳哼M行早期篩查，以早期診斷和預(yù)防。此外，CCL5也可用于結(jié)核性胸腔積液的診斷。研究表明，結(jié)核性胸腔積液患者血漿CCL5水平明顯高于惡性胸腔積液患者[25]。綜上，CCL5在MTB感染免疫過程中發(fā)揮重要作用，且在基因表達上與MTB感染存在相關(guān)性，有望在未來成為結(jié)核病診斷的生物標志物。

三、CXCL(C-X-C motif，CXC)及其受體

1.CXCL1和CXCL2：CXCL1是一種由巨噬細胞、中性粒細胞和上皮細胞表達的C-X-C基序趨化因子，通過趨化因子受體CXCR2發(fā)揮作用。CXCL1 在創(chuàng)面愈合過程中由生血管部位的角質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞表達。CXCL2同樣屬于趨化因子家族的一員，其與CXCL1的同源性達90%。CXCL1介導(dǎo)心臟等多種器官的急性和慢性反應(yīng)，其表達與其纖維化密切有關(guān)[26]。最新研究通過動物種群模型實驗的方法發(fā)現(xiàn)CXCL1診斷區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和LTBI者的效果顯著，其敏感度為94.5%，特異度為88.8%；區(qū)分結(jié)核病和非結(jié)核病患者的敏感度為90.9%，特異度為71.4%，其未來有希望成為快速診斷結(jié)核病的生物學(xué)靶點[27]。Kumar等[4]同樣發(fā)現(xiàn)CXCL1和CXCL2在肺結(jié)核患者的血漿中高度表達。其中，CXCL1的表達水平可以反映疾病的嚴重程度和范圍，CXCL1不但可以作為結(jié)核病病理診斷的候補標志物，還可以作為細菌負荷量及培養(yǎng)轉(zhuǎn)化情況的生物標志物。綜上，CXCL1和CXCL2有望作為疾病嚴重程度、細菌負擔和治療監(jiān)測的中等良好的生物標志物。

2.CXCL8(IL-8)：CXCL8是趨化因子家族中十分重要的一員，在人體內(nèi)主要發(fā)揮兩個功能，即：化學(xué)吸引和激活多種類型的免疫細胞。CXCL8在結(jié)核病的免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮十分重要的作用。其已被證實參與結(jié)核肉芽腫的形成并充當宿主抵御MTB感染的關(guān)鍵調(diào)控因子[28]；其通過將中性粒細胞募集到感染部位的方式使宿主具備抗結(jié)核的能力[29]。研究表明，在結(jié)核病患者的血漿中CXCL8的表達明顯上調(diào)，血漿含量從對照組的18.6 pg/ml提高到294.4 pg/ml[18]。并且，對CCL3、CXCL8和CXCL10進行混合受試者工作特征曲線分析發(fā)現(xiàn)，3種趨化因子組合后的曲線下面積(AUC)為0.937～0.969，敏感度為82%～96%，特異度為87%～92%，具有良好的診斷效能。因此，Kumar等[18]認為CXCL8是肺結(jié)核治療效果的高度預(yù)測性生物標志物。Yao等[30]也通過實驗證實了CXCL8在活動性結(jié)核病患者和LTBI者中存在差異性表達。綜上，CXCL8在對結(jié)核病的診斷及預(yù)后評估方面是一個十分有潛力的生物學(xué)標志物。

3.CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC)及其受體CXCR3：CXCL9、CXCL10和CXCL11都通過CXCR3發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。從分子結(jié)構(gòu)角度來說，CXCL9、CXCL10和CXCL11都缺乏谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，彼此之間具有明顯的結(jié)構(gòu)同源性[31]。它們都和Th1細胞免疫功能息息相關(guān)，具有招募單核巨噬細胞、T細胞、NK細胞和嗜堿性粒細胞的功能。在結(jié)核病的免疫應(yīng)答過程中，這三者與CXCR3受體一起發(fā)揮著不可替代的作用。Shang等[32]最新研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9和CXCL10及它們的受體CXCR3在結(jié)核病變組織及外周血中高表達，揭示了其作為診斷標志物的可能性。CXCL10 作為如今結(jié)核病免疫診斷的核心標志物，與其相關(guān)的研究進展頗多。Kumar等[4]研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核化療結(jié)束時肺結(jié)核患者的趨化因子血漿CXCL10 水平明顯升高。此外，活動性結(jié)核病患者CXCL10水平較對照組明顯增高，且與病情嚴重程度呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，血清CXCL10在診斷活動性肺結(jié)核時的AUC值達0.848，且具有較平衡的敏感度(80%)和特異度(80%)，表明CXCL10可能用于預(yù)測MTB感染的活動性[21]。Korma等[33]通過RT-qPCR分析提出CXCL10可以將肺結(jié)核患者與LTBI者有效區(qū)分，其AUC為0.731；同時，將CXCL9和CXCL10聯(lián)合用于區(qū)分肺結(jié)核與肺外結(jié)核，其敏感度高達85.7%，特異度達73.9%，揭示了細胞因子和趨化因子的表達水平可能是區(qū)分MTB感染狀態(tài)的有效標志。Qiu等[34]通過匯總18項CXCL10的相關(guān)研究，納入2838例結(jié)核病患者，對CXCL10的診斷效能進行了全面評估，發(fā)現(xiàn)CXCL10檢測肺結(jié)核的敏感度為86%，特異度為88%，可有效區(qū)分結(jié)核病和非結(jié)核病患者，是一個有應(yīng)用價值的診斷標志物。結(jié)核性淋巴結(jié)炎的診斷具有挑戰(zhàn)性。研究表明，CXCL9和CXCL11作為CXCR3的配體，用于診斷結(jié)核性淋巴結(jié)炎的能力要優(yōu)于γ-干擾素釋放試驗，可作為結(jié)核病有效的診斷標志物[35]。魏蘭等[36]通過實驗同樣證實了CXCR3及其配體有助于活動性肺結(jié)核診斷，且CXCL11和CXCL9的評價作用更為突出。綜上，CXCR3及其配體可能是診斷結(jié)核病和臨床評估結(jié)核病患者嚴重程度的有效生物標志物[37]。

4.CXCL13(BCA-1)：CXCL13是C-X-C基序穩(wěn)態(tài)趨化因子中的一員，也被稱為B細胞趨化因子和B細胞趨化因子-1(BCA-1)，其對B-1和B-2亞群的B細胞具有選擇性趨化作用，通過與趨化因子受體CXCR5結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)作用。CXCL13可促進非淋巴器官異位淋巴樣結(jié)構(gòu)的新發(fā)生，已被證實在慢性炎癥疾病中發(fā)揮重要功能。研究表明，CXCL13可作為特發(fā)性肺纖維化的強大的預(yù)后進展標志物[38]。但其在肺結(jié)核的診斷及預(yù)后的預(yù)測方面的研究仍有待開展。研究表明，在感染MTB的小鼠模型中，CXCR5及其配體CXCL13的表達增高，進而發(fā)揮抗MTB感染免疫作用[39]。另一研究則發(fā)現(xiàn)在結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液的程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)陽性(PD-1+)和PD-1-黏膜相關(guān)恒定T細胞(MAIT細胞)中，CXCL13是差異表達最顯著的基因[40]。最新研究表明，檢測血清中IP-10 和BCA-1可實現(xiàn)對活動性結(jié)核病和LTBI的鑒別(AUC=0.83)[41]。因此，雖目前對CXCL13作為結(jié)核病診斷標志物的研究仍不夠深入，但其存在一定的研究價值。

四、CX3CL(C-X3-C motif)及其受體

CX3CL1(fractalkine)是一個由CX3C結(jié)構(gòu)域和黏蛋白柄組成的結(jié)構(gòu)獨特的趨化因子，是CX3C家族的唯一成員。CX3CL1與CXCR1結(jié)合發(fā)揮趨化因子作用，并具有黏附分子功能[42]，其在炎癥條件下激活靶細胞引起下游免疫應(yīng)答[43]。較早的研究發(fā)現(xiàn)，活動性肺結(jié)核患者唾液中CX3CL1濃度較高，其表達的差異性有可能利于結(jié)核病的檢出[20]。Estévez等[41]也通過實驗證實CX3CL1是區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和LTBI者的最佳單一標志物，且其與IL-12p40聯(lián)合診斷具有區(qū)分LTBI者與非LTBI者的良好性能。

五、總結(jié)與展望

1.亟待篩選結(jié)核抗原特異性的趨化因子組合：趨化因子及其受體在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中扮演十分重要的角色，其中，多種趨化因子具有作為結(jié)核病診斷的生物學(xué)標志物的潛力。但是，先前諸多針對結(jié)核病診斷的研究多基于前人成果進行相關(guān)經(jīng)驗的總結(jié)和理論的推測，選定單個或多個可能在宿主對抗MTB感染中發(fā)揮作用的趨化因子進行分析，而非通過對大量趨化因子篩查的基礎(chǔ)上獲得的具有鑒別診斷價值的趨化因子及其組合，未來研究可通過液相芯片及流式分析等新穎的研究方式，對結(jié)核病患者所表達的趨化因子及其受體進行高通量篩查，再對通過篩選后明確特異性表達的標志物進行實驗驗證，從而提高篩選組合對于結(jié)核病的特異性。此外，既往研究大多關(guān)注外周血靜息態(tài)的趨化因子狀態(tài)。然而，這種狀態(tài)容易受到患者共患疾病、免疫狀態(tài)及服用藥物的影響，篩選結(jié)核抗原特異性的趨化因子能夠有效排除上述干擾，提高檢測效能，同時，抗原刺激的過程亦是檢測信號放大的過程，有助于提升檢測的準確性。

2.與病原學(xué)診斷方法的組合診斷模式：前述研究發(fā)現(xiàn)趨化因子在抗結(jié)核中的重要作用，然而，對于患者外周血趨化因子的影響因素缺乏系統(tǒng)研究，其濃度與患者的免疫狀態(tài)、基礎(chǔ)性疾病和載菌量等因素的關(guān)聯(lián)尚不明晰。未來探索上述關(guān)系對于提高其診斷敏感度具有重要價值；特別是作為一種潛在的免疫學(xué)診斷方法，如何作為病原學(xué)診斷技術(shù)的重要補充，提高菌陰結(jié)核病患者的診斷效能，針對不同人群設(shè)定適宜的診斷界值以提高特殊人群的診斷效能至關(guān)重要。在篩選獲得特異性的趨化因子組合基礎(chǔ)上，開展與病原學(xué)診斷技術(shù)的聯(lián)合評估有望成為一種新型的結(jié)核病診斷策略。

綜上所述，目前臨床診斷結(jié)核病仍存在諸多困難，基層醫(yī)院缺乏對結(jié)核病和耐藥結(jié)核病進行早期、快速、簡便和準確的診斷方法，不利于對結(jié)核病患者的及早發(fā)現(xiàn)和治療及預(yù)防疾病在社區(qū)傳播。趨化因子作為新興的分子靶點，具有檢測便捷和耗時短的優(yōu)勢，近些年已成為結(jié)核病診斷研究方向的熱點；提高特異性的趨化因子篩選及相關(guān)影響因素的解析，將幫助我們?nèi)骈_發(fā)適宜菌陰結(jié)核病患者診斷技術(shù)的新方法，同時，也為探索趨化因子在宿主抗結(jié)核免疫應(yīng)答機制領(lǐng)域研究開拓新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻馬子淳和李姍姍：起草文章；尚媛媛：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；逄宇：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)/材料支持