水產(chǎn)喹諾酮類藥物使用與檢測方法研究進展

黃欣桐，王李寶，黎慧，史文軍，陳孝煊，萬夕和

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070）

喹諾酮類藥物具有廣譜抗菌、殺菌效果好、成本低等優(yōu)點，常被用于防治水產(chǎn)動物細菌感染。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，喹諾酮類藥物的使用會導致藥物殘留，影響水產(chǎn)品質量[1]。中國、歐盟、美國和日本等，已將喹諾酮列為動物獸藥禁止使用藥物產(chǎn)品名單，并規(guī)定了最高殘留量。水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的殘留和控制，是該領域發(fā)展迫切需要解決的問題之一。在養(yǎng)殖過程中，一些養(yǎng)殖主體忽視用藥安全，濫用喹諾酮類藥物，導致藥物殘留超標。而食用殘留超標的水產(chǎn)品，可能導致生物腸道菌群失衡，甚至有潛在的致癌風險[2]。目前已有關于喹諾酮類藥物毒性[3]、殘留限值和殘留測定方法[4]方面的研究報道，為合理、科學使用喹諾酮類藥物，防止耐藥性的產(chǎn)生提供了參考依據(jù)。

現(xiàn)簡述喹諾酮類藥物的使用管理現(xiàn)狀、藥物殘留樣品前處理方法、最新檢測技術，擬為喹諾酮類藥物殘留檢測相關研究提供參考。

1 喹諾酮類藥

喹諾酮類藥物是一類常見的人畜共用的人工合成類抗菌藥，在國際上被譽為最重要的高效廣譜抗菌藥。因其結構中含有氟原子，稱之為氟喹諾酮類抗生素（FQs），目前已發(fā)展到第四代。抑菌機理為通過抑制DNA 螺旋酶而達到抑菌作用。目前使用最多的是第三代氟喹諾酮類抗生素，主要包括環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、洛美沙星（LOM）、恩諾沙星（ENR）等。此類抗生素因抗菌譜廣、抗菌性強、口服吸收好等優(yōu)勢，被廣泛應用于人類及動物疾病治療。

根據(jù)發(fā)明順序及其抗菌譜喹諾酮類藥物分為四代：第一代產(chǎn)品主要對痢疾大腸桿菌、大腸桿菌、克雷白桿菌和部分變形桿菌有抗菌活性；第二代產(chǎn)品具有廣泛的抗菌譜，對綠膿桿菌、腸桿菌科、馬氏沙雷桿菌具有一定抗菌活性；第三代產(chǎn)品的抗菌譜進一步擴大，包括革蘭陽性、陰性菌；第四代引入8-甲氧基，加強了抗厭氧菌活性，抗菌譜進一步擴大到衣原體、支原體等病原體，且藥物的不良反應更小[5]。歷代喹諾酮藥物的優(yōu)、缺點及抗菌譜差異見表1。

表1 歷代喹諾酮藥物的優(yōu)缺點、抗菌譜差異

2 使用現(xiàn)狀

1980 年，抗生素開始在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，主要用來控制病原微生物，減少養(yǎng)殖對象的感染風險。起初抗生素主要用于具有重要經(jīng)濟效益的養(yǎng)殖品種，1990 年后，其使用范圍逐步擴大，大多數(shù)海水和淡水養(yǎng)殖品種均有使用[13]。

2018 年，我國養(yǎng)殖業(yè)使用的獸用抗菌藥有69 種，其中10 種為氟喹諾酮類藥物，占總量的14.5%。在獸用抗菌藥的使用品種和數(shù)量上，氟喹諾酮類與β-內酰胺類及抑制劑類、磺胺及增效劑類并列第一[14]。喹諾酮類藥物在畜禽、水產(chǎn)、蠶等養(yǎng)殖動物中均有使用。其藥物代謝特點與使用對象及給藥途徑有密切關系，同時這些也影響著藥物的吸收速度、數(shù)量及作用強度。1982—2000 年，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗生素藥物在我國逐步研制成功[15]。目前，越南和中國使用抗生素的種類較多，分別為31 種和17 種，以特色水產(chǎn)養(yǎng)殖為主且養(yǎng)殖強度較低的國家，如印度尼西亞和孟加拉國，使用抗生素的種類較少。水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用的喹諾酮類藥物種類見表2。

為降低水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的風險，各國對部分藥物設定了限量標準，美國則禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗菌喹諾酮類藥物。2015 年9 月1 日起，中華人民共和國原農(nóng)業(yè)部公告第2292 號明確停止使用洛美沙星等4 種家畜用獸藥，并撤銷有關獸藥上市許可文號[17]。《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定，喹酸的最大殘留限量為100 μg/kg；《無公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）中，也對喹諾酮類藥物的使用作出了規(guī)定（表3）。

表3 喹諾酮類藥物使用限量

3 藥物殘留檢測前處理方法

3.1 液液萃取法

液液萃取法是一種分離過程，是利用各組分在2 個不相溶（或僅部分相溶）的液相中的不同溶解度，將它們從一個液相轉移到另一個液相。2021 年，楊霄等[18]運用鹽析輔助液液萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，測定漁業(yè)水體中7 種喹諾酮類抗生素含量。2015 年，黃培婷等[19]采用固相分散萃取-液態(tài)微萃取結合超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法，建立了快速、靈敏、簡便的測定各種水基中殘留抗生素的方法。

3.2 固相萃取法

固相萃取法的目的是減少樣品中雜質的干擾，提高測定的靈敏度。2021 年，梁思慧等[20]建立一種新型的固相萃取前處理方法，該方法的基質凈化能力顯著升高，再結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜，檢測出淡水魚中四環(huán)素和氟喹諾酮殘留。2022 年，丁紫榮等[21]采用固相萃取-液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜（SPE-LC-MS/MS）技術，建立了養(yǎng)殖尾水中17 種氟喹諾酮類抗生素（FQs）的測定方法，以養(yǎng)殖尾水為基質，17 種FQs 的加標回收率為47.8%～118.7%，相對標準偏差（RSD）＜20%（n=6）。

3.3 凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜法的分離過程，是在一個充滿多孔物質的柱子上進行。填料顆粒包含許多不同大小的孔洞，不同分子質量的聚合物分子，被淋洗溶液的流出物，按分子質量從大到小分開。2016 年，吳兆鳳等[22]建立了凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質譜（GPC-GC-MS/MS），測定奶粉中有機氯農(nóng)藥殘留的分析方法，采用凝膠滲透色譜技術，成功檢測出有機氯農(nóng)藥殘留。

3.4 QuEChERS 萃取法

QuEChERS 的方法本質上是振蕩萃取、液液預處理和基質分散的固相萃取的組合，從而實現(xiàn)了樣品預處理。楊金易等[23]采用新型QuEChERS 前處理技術與酶聯(lián)免疫法結合，快速檢測水產(chǎn)品中3種喹諾酮類殘留。章紅等[24]以QuEChERS 樣品預處理方法、四極桿飛行時間高分辨質譜（Q-TOF MS）為檢測手段，建立了典型水產(chǎn)品中的15 種喹諾酮類藥物殘留的快速篩查方法。

3.5 分子印跡固相萃取方法

分子印跡技術是基于模擬抗原-抗體、酶-底物等生物分子識別特異性的仿生分子識別技術[25-26]，是一種制備具有分子特異識別功能聚合物的技術。分子印跡聚合物可以對目標化合物進行特異性選擇，使其能夠分離復雜樣品中的特定成分，具有較高的儲存能力，可以從環(huán)境中吸收低濃度的目標化學品，具有較高的檢測靈敏度。劉芃巖等[27]同時以左氧氟沙星和環(huán)丙沙星為模板分子，合成了復合模板分子印跡聚合物，可同時測定魚肉中10 種FQs含量，可以滿足水產(chǎn)品中FQs 類藥物的確證和多殘留分析的要求。2019 年，王瑞等[28]建立了同時測定雞肉中16 種喹諾酮類藥物殘留的分子印跡固相萃取（MISPE）-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法，該方法靈敏度高，操作簡單、快速。

3.6 固相微萃取法

固相微萃取法的基礎，是使用涂有固相的石英玻璃纖維來吸附和聚集樣品中被測物質。2010 年，孫福江等[29]建立了頂空固相微萃取（HS-SPME）結合氣相質譜（GG-MS），檢測蘋果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法。

以上6 種喹諾酮類藥物檢測的前處理方法各有優(yōu)缺點（表4）。研究和分析人員必須針對需要檢測的喹諾酮類藥物的特性和試驗目的，選擇合適的樣品處理方法，以期獲得快速、準確、可靠的檢測結果。

表4 喹諾酮藥物樣品前處理方法的優(yōu)缺點[30-31]

4 檢測技術

4.1 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）是使用最廣泛的免疫測定方法。在基本方法中，已知的抗原或抗體被吸附在一個固相支持物的表面上，酶標抗原-抗體反應就在固相的表面上進行，而液相中游離的部分被洗掉。最常用的ELISA 法是雙抗體夾心法，用于檢測大分子抗原，間接法用于檢測特定的抗體[32]。王強等[33]建立了檢測水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法。

4.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（GICT），是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。以膠體金為標記物，與待測物的絡合物被相應的配體捕獲而濃集顯色,以纖維膜上顯色帶的有無進行定性檢測。2018 年，宗婧婧等[34]采用膠體金免疫層析法，水產(chǎn)樣品用0.1%甲酸乙腈溶液提取，正己烷除脂，膠體金試紙條檢測，檢測出15 種喹諾酮類藥物。2021 年，羅梅霞[35]制備的抗FQs 單克隆抗體M4E3 洛美沙星、氧氟沙星和恩諾沙星等8 種FQs，有較高的交叉反應率，基于此抗體所建立的膠體金免疫層析法，可以在現(xiàn)場快速靈敏地檢測豬肉和鴨肉中的這8 種FQs。

4.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPIC）是一種以高壓液體作為流動相、以傳統(tǒng)液相為基礎的色譜過程。日常所說的柱色譜法、薄層色譜法或紙色譜法是經(jīng)典的液相色譜法。在這些方法中，＞100 mm 的吸附材料（硅膠、氧化鋁等）被用作固定相。朱品玲等[36]應用HPIC法，建立了測定水產(chǎn)品肌肉中4 種喹諾酮類殘留量的方法，采用乙腈-二氯甲烷（4∶3，V/V），為提取液，濃縮至干，用20%乙腈水溶解殘留物。

4.4 液相色譜-串聯(lián)質譜法

液相色譜-串聯(lián)質譜法是一種將多種高效組成成分都定量于一體的分析方法，對高沸點、不具有揮發(fā)性和對熱不穩(wěn)定性的極性化合物進行分離檢測和含量分析。高效液相色譜串聯(lián)質譜法主要用于強極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定性的化學物。Meng 等[37]測定了牛奶中8 種氟喹諾酮類藥物含量，建立了低于最大殘留量濃度的多殘留分析方法。Magda 等[38]僅用0.5 mL 有機溶劑萃取樣品，在0.25～2.0 mL 內回收率良好；以600 多個牛奶樣品對檢測限、定量限和適用性進行評價，結果均良好。梁晶晶等[39]應用最新型的固相萃取（PRiME HLB）凈化技術，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜（UPLC-MS/MS），建立了水產(chǎn)品中19 種喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。

4.5 化學發(fā)光免疫分析法

化學發(fā)光免疫分析法由2 部分組成，一個免疫反應系統(tǒng)和一個化學發(fā)光檢測系統(tǒng)。化學發(fā)光免疫分析在國內畜禽領域的應用相對較多，在水產(chǎn)領域應用相對較少。2008 年，官婷婷[40]利用鹽酸四環(huán)素本身沒有化學發(fā)光且會使化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的化學發(fā)光明顯消失的性質，對人類晨尿樣品中的鹽酸四環(huán)素進行了檢測。

為進一步了解樣品檢測的便捷性、準確性和檢測成本等因素，對比不同的檢測方法的優(yōu)缺點（表5），選擇合適的喹諾酮類藥物檢測方法，以期在較短時間內，獲得準確、可靠的檢測結果，為下一步抗生素的使用和管理提供有效的數(shù)據(jù)支撐。

5 結語

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色健康發(fā)展的推進，在預防和治療養(yǎng)殖對象的疾病中，抗生素依舊起著重要作用，因此抗生素使用導致的細菌耐藥性[44-46]、環(huán)境污染及水產(chǎn)品抗生素的殘留問題[47]依然存在。在水產(chǎn)品喹諾酮類藥物殘留檢測中，用于樣品前處理的固相萃取[48-49]和QuEChERS[50-51]方法，檢測成本低、效率高；用于樣品檢測的高效液相色譜法、液相色譜-質譜法和酶聯(lián)免疫法等[52]，目前使用最廣泛的為高效液相色譜法。