不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤中叢枝菌根真菌群落變化*

李 俠，葉誠誠，張永芳，張 巽，霍麗娟，蘇世鳴

不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤中叢枝菌根真菌群落變化*

李 俠1，葉誠誠2**，張永芳1，張 巽1，霍麗娟3，蘇世鳴4

（1.山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，大同 037009；2.溫州市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)中心，溫州 325000；3.太原科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

以山西省大同市晉華宮人工復(fù)墾和自然恢復(fù)煤矸石山以及忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山為研究對(duì)象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)三座煤矸石山土壤AM真菌群落組成進(jìn)行分析，并測定其土壤理化性質(zhì)，以探究不同地點(diǎn)煤矸石山不同復(fù)墾方式下土壤中叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi, AM真菌）群落組成的差異及其土壤影響因子。結(jié)果表明：晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山和忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山AM真菌多樣性指數(shù)（Chao指數(shù)和香農(nóng)?威納指數(shù)）存在顯著差異，但晉華宮人工復(fù)墾和自然恢復(fù)煤矸石山AM真菌群落的多樣性指數(shù)差異不顯著。試驗(yàn)共檢測到67個(gè)AM真菌OTUs，可鑒定到3個(gè)AM真菌屬級(jí)分類單元，其中球囊霉屬（）在晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山、晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山和忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山中均為最優(yōu)勢菌，多樣孢囊霉屬（）、類球囊霉屬（）僅出現(xiàn)在晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山。多元置換方差分析和多維尺度分析結(jié)果表明，晉華宮兩種恢復(fù)方式的煤矸石山之間AM真菌群落組成差異不顯著，而晉華宮與忻州窯兩個(gè)地點(diǎn)的煤矸石山AM真菌群落組成差異顯著。AM真菌群落差異與土壤全氮、有機(jī)碳含量和AM真菌孢子密度相關(guān)。綜上，晉華宮人工復(fù)墾（10～20a）煤矸石山土壤AM真菌群落可達(dá)到與自然恢復(fù)（50～60a）煤矸石山較為一致的效果。兩個(gè)地點(diǎn)煤矸石山土壤AM真菌群落差異較大，土壤全氮、有機(jī)碳含量和AM真菌孢子密度是驅(qū)動(dòng)AM真菌群落組成差異的主要因子。

煤矸石山；叢枝菌根真菌群落；球囊霉屬；Illumina MiSeq高通量測序

煤矸石山由開采、洗選和利用煤炭的過程中產(chǎn)生的廢棄煤矸石堆積而成[1]，是煤炭生產(chǎn)過程中的必然產(chǎn)物，也是礦區(qū)的主要污染源之一。在礦山開采過程中，幾乎所有的開采活動(dòng)都超過了生態(tài)系統(tǒng)的自我恢復(fù)能力，依靠自身恢復(fù)是一個(gè)緩慢的過程，最少需要50～100a[2]。國內(nèi)外有不少關(guān)于煤礦區(qū)土地復(fù)墾和生態(tài)重建的研究，植被重建被認(rèn)為是修復(fù)礦區(qū)生態(tài)破壞與環(huán)境污染最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，也是目前國內(nèi)外主要采取的措施[3?4]。然而煤矸石風(fēng)化物顆粒粗、結(jié)構(gòu)差，水分和養(yǎng)分含量少，微生物區(qū)系稀少且活性低及重金屬含量高等嚴(yán)重制約了煤矸石山植被的恢復(fù)[5]。

土壤微生物具有豐度高、種類多、代謝快等特征，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，在調(diào)節(jié)養(yǎng)分循環(huán)和穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著十分重要的作用[6]。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AM真菌）是一種廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生物，可以與大多數(shù)陸生植物共生[7]。AM真菌一方面侵染植物根系，另一方面可以延伸到土壤中，其龐大的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)極大地?cái)U(kuò)展了根系范圍，吸收土壤中水分以及氮、磷等礦質(zhì)元素，改善宿主植物水分和營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長[8]，AM真菌還通過對(duì)土壤重金屬的固定、隔離以及增加植物耐受性等方式提高植物抵抗重金屬的能力[9]。AM真菌與植物這種互惠互利的共生關(guān)系，有利于克服煤矸石山生態(tài)重建中養(yǎng)分含量低、干旱、重金屬含量高等逆境的潛力[10?11]。另外，AM真菌還可以通過分泌球囊霉素相關(guān)蛋白，以及菌絲的物理纏繞等方式促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成，改良土壤結(jié)構(gòu)[12]，因此，在生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)初期，菌根植物常作為先鋒植物在這些極端環(huán)境中優(yōu)先生存下來。牛天心[13]對(duì)補(bǔ)連塔煤礦采陷區(qū)植物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在所調(diào)查的20種植物中，菌根植物共有16種，且共分離鑒定出AM真菌13種。近年來，人工擴(kuò)繁的AM真菌菌劑也常被應(yīng)用到退化生態(tài)系統(tǒng)和污染環(huán)境的生態(tài)恢復(fù)中，畢銀麗等[1]在煤矸石山復(fù)墾區(qū)接種AM真菌13個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，煤矸石山植被的成活率提高了15%。這些研究表明AM真菌對(duì)煤礦區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復(fù)起重要的推動(dòng)作用。

在生態(tài)系統(tǒng)中，植物群落演替、人類活動(dòng)和環(huán)境條件變化會(huì)引發(fā)AMF真菌多樣性和群落組成的時(shí)空變化[14?16]。植物、土壤和AM真菌及其相互關(guān)系在受干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)功能恢復(fù)過程中起著重要作用[17]，以往關(guān)于采煤區(qū)生態(tài)恢復(fù)的研究主要集中在植物群落的演替變化和重建過程中，而穩(wěn)定的AM真菌群落組成對(duì)于提高生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力、維持生態(tài)平衡同樣至關(guān)重要[18]，其受植被、土壤、人為干擾、氣候和地理距離等生物和非生物因子的影響[19]。山西省煤礦資源十分豐富，是聞名全國的“煤都”。但在過去長期的開采過程中，礦區(qū)生態(tài)被嚴(yán)重破壞，水土流失嚴(yán)重。近些年，對(duì)一些煤矸石山采取了人工修復(fù)和治理，植被生長和覆蓋狀況得到了很大改善。李俠等[20]研究發(fā)現(xiàn)短期人工修復(fù)（10～20a）的煤矸石山盡管植被種類遠(yuǎn)少于長期自然恢復(fù)（50～60a）的煤矸石山，但植被蓋度兩者無顯著差異，甚至植被密度還高于長期自然恢復(fù)的煤矸石山，而不同地點(diǎn)的煤矸石山即使恢復(fù)年限較一致，但植物群落差異卻較大。然而關(guān)于不同地點(diǎn)和恢復(fù)方式煤矸石山土壤中AM真菌群落的研究卻少有報(bào)道。探明這些煤矸石山土壤中AM真菌群落組成狀況及土壤驅(qū)動(dòng)因子可為有效利用植物和AM菌種資源、合理制定煤矸石山修復(fù)方案提供重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地大同市晉華宮礦位于山西省北部，地處N40°6’, E113°8’；忻州窯礦位于山西省北中部，地處N38°25’, E112°43’；兩個(gè)礦均屬溫帶大陸性半干旱季風(fēng)氣候，年均降水量約為400mm。晉華宮礦的煤矸石山分別為人工復(fù)墾和自然恢復(fù)樣地，忻州窯礦的煤矸石山為自然恢復(fù)樣地。晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山采用覆土約20cm、人工種植紫苜蓿進(jìn)行修復(fù)，取樣時(shí)主要植被為中華草沙蠶、豬毛菜和紫苜蓿；晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山未進(jìn)行人為修復(fù)，取樣時(shí)主要植被為中華草沙蠶、鐵桿蒿和鵝絨藤；忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山也未進(jìn)行人為修復(fù)，取樣時(shí)主要植物為菊葉香藜、獨(dú)行菜和牛筋草[20]。

1.2 土壤樣品采集

2016年6月，從大同市晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山（排矸年齡10～20a，用JH-AR表示）、晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山（排矸年齡50～60a，用JH-NR表示）、忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山（排矸年齡50～60a，用XY-NR表示）三座煤矸石山上各選取三個(gè)樣方。去除樣方表面的雜草植被（約2cm的表層土），按五點(diǎn)法采集5個(gè)15cm×15cm×10cm的次樣方，并將5個(gè)次樣方的土壤充分混勻作為一個(gè)待測土壤樣品。每個(gè)待測土壤樣品分裝成兩部分，一部分新鮮土壤放置于?80℃保存，用于土壤DNA的提?。挥嘞峦寥罉悠纷匀伙L(fēng)干后用于AM真菌孢子密度和土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3 項(xiàng)目測定

1.3.1 土壤AM真菌孢子密度

取風(fēng)干土壤樣品10g于2L的燒杯中，加水充分?jǐn)嚢?min，使孢子脫落。土壤懸濁液雙層篩（上篩20目，下篩400目）過濾，將400目下篩中的物質(zhì)水洗轉(zhuǎn)入50mL的大離心管4000r離心3min。倒掉上清液，加入60%的蔗糖溶液，再次離心（3000r，2min），將上清液倒入400目的篩子用水清洗，然后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中在顯微鏡下觀察并分格計(jì)數(shù)。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測定

分別對(duì)風(fēng)干土壤樣品中速效磷、有機(jī)碳、全氮、pH值、EC等指標(biāo)進(jìn)行測定[21]。

1.4 土壤AM真菌多樣性測定

1.4.1 土壤DNA的提取

取0.5g新鮮土壤樣品采用E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.) 試劑盒提取土壤基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量，并用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的純化

使用AML1F(5’-ATCAACTTTCGATGGT-AGGATA GA-3’)-AML2R(5’-GAACCCAAACACTT- TGGTTTCC-3’) 引物進(jìn)行第一輪PCR，擴(kuò)增長度大約為795bp 的18S rRNA片段[22]。PCR反應(yīng)體系按照TransStart?Fastpfu DNA Polymerase (AP221-02) 的說明書配置，每個(gè)樣品重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中加入1μL DNA模板，輕敲混勻后放入PCR儀（ABI GeneAmp? 9700）中，反應(yīng)條件設(shè)置為，95℃初始變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，然后72℃保溫10min。第一次PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二次PCR反應(yīng)的模板。第二次 PCR 使用的引物是加入帶有barcode的AMV4.5NF(5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’)-AMDGR(5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’)，擴(kuò)增長度約為300bp的18S rRNA片段[23]，體系和反應(yīng)條件與第一次PCR反應(yīng)一致（循環(huán)數(shù)為30）。將同一樣品的PCR產(chǎn)物混勻后用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，并用Tris-HCl進(jìn)行洗脫；之后用2%瓊脂糖電泳檢測。

1.4.3 MiSeq高通量測序

參照電泳的初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，隨后根據(jù)每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例混合。將相應(yīng)比例混合的PCR產(chǎn)物交予相關(guān)生物公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4.4 序列處理

Illumina MiSeq高通量測序測得的原始數(shù)據(jù)使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）進(jìn)行篩選和優(yōu)化序列。僅包含有完整的barcode和正向引物、質(zhì)量得分≥25以及長度在200～300bp（不包括條形碼和引物序列）的序列。使用Usearch v7.1優(yōu)化序列，修剪后的序列依據(jù)97%的相似度劃分OTUs。刪除序列數(shù)低于5的OTUs，從每個(gè)OTUs中選擇數(shù)量最多的序列作為代表序列。之后將物種代表序列與Maarj AM數(shù)據(jù)庫（www.maarjam.botany. ut.ee）進(jìn)行比對(duì)注釋。原始數(shù)據(jù)提交到國際基因庫GenBank保存，序列號(hào)為PRJNA818836。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)、屬級(jí)分類單位的相對(duì)豐度和孢子密度的差異，采用Duncan多重比較檢驗(yàn)不同煤矸石山差異的顯著性水平。采用皮爾森（Pearson）相關(guān)分析檢驗(yàn)AM真菌多樣性指數(shù)、群落各屬、孢子密度和土壤理化性質(zhì)兩兩之間的相關(guān)性。以上分析在SPSS（22.0）中進(jìn)行。

利用R（4.0.2），使用多維尺度分析（Nonmetric multidimensional scaling, NMDS）基于Bray-Curtis 距離算法分析不同煤矸石山AM真菌群落組成的差異，采用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance）檢驗(yàn)不同煤矸石山土壤AM真菌群落組成的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)對(duì)比

由表1可知，AM真菌測序的覆蓋率均達(dá)到了99.99%以上，表明測序結(jié)果能夠很好地反映土壤AM真菌群落組成的真實(shí)情況。晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山土壤AM真菌Chao指數(shù)和香農(nóng)?威納指數(shù)顯著高于忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山，兩者與晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山差異不顯著；三座煤矸石山間土壤AM真菌覆蓋率、Ace指數(shù)以及Simpson指數(shù)差異均不顯著。

2.2 不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤AM真菌Illumina MiSeq序列對(duì)比

由圖1可知，三座煤矸石山土壤樣本中AM真菌的OTUs稀釋曲線都達(dá)到了平臺(tái)區(qū)，表明試驗(yàn)的測序量足以覆蓋每個(gè)樣方的AM真菌群落。在晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山的三個(gè)樣方（JH-AR1、JH-AR2、JH-AR3）中分別測得31659條、33913條和40388條屬于AM真菌的有效序列，在97%的相似度下分別劃分為39、38和28個(gè)OTUs；在晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山的三個(gè)樣方（JH-NR1、JH-NR2、JH-NR3）中分別測得34567條、39217條、43967條屬于AM真菌的有效序列，在 97%的相似度下分別劃分為40、31和13個(gè)OTUs；在忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山的三個(gè)樣方（XY-NR1、XY-NR2、XY-NR3）中分別測得35130條、38728條和40661條屬于AM真菌的有效序列，在97%的相似度下分別劃分為11、19和12個(gè)OTUs。

試驗(yàn)在97%序列相似度下共得到67個(gè)AM真菌OTUs，其中晉華宮人工復(fù)墾和自然恢復(fù)煤矸石山分別有52和50個(gè)AM真菌OTUs，忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山有23個(gè)OTUs。三座煤矸石山共有OTUs為15個(gè)；晉華宮人工復(fù)墾和自然恢復(fù)兩座煤矸石山共有的OTUs為38個(gè)，分別占兩座煤矸石山總OTUs的73%和76%；晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山和忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山共有的OTUs為19個(gè)，晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山和忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山共有的OTUs為16個(gè)。晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山、晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山和忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山特有的OTUs分別為11、10和3個(gè)（圖2）。

表1 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落多樣性指數(shù)的比較

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)。同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示三座煤矸石山之間差異顯著（P<0.05）。JH-AR指晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山，JH-NR指晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山，XY-NR指忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山。下同。

Note: Values are means ± stand error (n=3). Different lowercases in the same column represent significance among three different coal gangue hills according Duncan test following significant ANOVA (P<0.05). JH-AR is artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city; JH-NR is natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city; XY-NR is natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln. The same as below.

圖1 不同煤矸石山土壤各平行樣本中叢枝菌根真菌OTUs稀釋曲線

注：JH-AR1、JH-AR2、JH-AR3分別為晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山的三個(gè)平行樣本；JH-NR1、JH-NR2、JH-NR3分別為晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山的三個(gè)平行樣本；XY-NR1、XY-NR2、XY-NR3分別為忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山的三個(gè)平行樣本。

Note: JH-AR1, JH-AR2, JH-AR3 are three parallel samples of artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace; JH-NR1, JH-NR2, JH-NR3 are three parallel samples of natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace; JH-NR1, JH-NR2, JH-NR3 are three parallel samples of natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln.

2.3 不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤AM真菌群落組成對(duì)比

試驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)3個(gè)鑒定到屬的AM真菌屬級(jí)分類單元，包括球囊霉屬（）、多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（），不能分類到已知屬名的OTUs被定義為Unknow。其中球囊霉屬（）在三座煤矸石山中均為最優(yōu)勢屬。晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山土壤中的球囊霉屬（）相對(duì)豐度顯著高于忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山，而晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山土壤中的球囊霉屬（）相對(duì)豐度與前兩者無顯著差異；多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（）僅在晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山土壤中鑒定到（表2）。

圖2 不同地點(diǎn)煤矸石山土壤樣本中AM真菌OTUs韋恩圖

2.4 不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤AM真菌孢子密度對(duì)比

孢子作為真菌的一種重要繁殖體，其在土壤中的豐度常用孢子密度來反映，本試驗(yàn)中AM真菌孢子密度用每10g土壤中含有的孢子個(gè)數(shù)來表示。不同地點(diǎn)煤矸石山土壤樣本中的AM真菌孢子密度差異顯著，晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山土壤的AM真菌孢子密度顯著高于忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山，晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山土壤AM真菌孢子密度與其余兩座煤矸石山差異不顯著（圖3）。

表2 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌各屬相對(duì)豐度

圖3 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌孢子密度

2.5 不同地點(diǎn)和復(fù)墾方式煤矸石山土壤環(huán)境因子影響對(duì)比

2.5.1 影響土壤AM真菌群落組成差異的因子分析

AM真菌群落的多維尺度分析（NMDS）和多元置換方差分析（PERMANOVA）結(jié)果表明，晉華宮兩種恢復(fù)方式煤矸石山之間土壤AM真菌群落沒有明顯分開，差異也不顯著；而兩者與忻州窯煤矸石山之間土壤AM真菌群落明顯分開，差異達(dá)到顯著水平（R2=0.23，P=0.04）。土壤全氮（R2=0.63，P=0.045）、土壤有機(jī)碳（R2=0.75，P=0.009）和AM真菌孢子密度（R2=0.75，P=0.016）與煤矸石AM真菌群落組成顯著相關(guān)（圖4）。

圖4 不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落NMDS分布

注：橢圓代表不同煤矸石山土壤樣本中AM真菌群落95%置信區(qū)間水平下的變異。TN表示全氮，TOC表示有機(jī)碳，Spores表示AM真菌孢子密度。

Note：Ellipses in the plots represent 95% confidence intervals around AM fungi community in different coal gangue hills.TN represents total nitrogen, TOC represents total organic carbon, Spores represent spore density.

2.5.2 影響AM真菌多樣性、各屬水平的土壤理化性質(zhì)分析

煤矸石山土壤中AM真菌多樣性、各屬水平與土壤理化性質(zhì)各指標(biāo)之間的皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示。由表可知，AM真菌多樣性指數(shù)（覆蓋率、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和香農(nóng)?威納指數(shù)）與土壤速效磷（僅Chao指數(shù)和香農(nóng)?威納指數(shù)）和AM真菌孢子密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與土壤全氮（僅覆蓋率和香農(nóng)?威納指數(shù)）、有機(jī)碳（Ace指數(shù)除外）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。球囊霉屬（）與土壤速效磷和AM真菌孢子密度均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，多樣孢囊霉屬（）和類球囊霉屬（）與土壤理化性質(zhì)及AM真菌群落多樣性指數(shù)之間均無顯著相關(guān)關(guān)系。

表3 不同煤矸石山土壤AM真菌多樣性指數(shù)、各屬水平及土壤理化性質(zhì)指標(biāo)之間相關(guān)性

注：*表示P≤0.05，**表示P≤0.01。

Note:*is P≤0.05，**is P≤0.01.

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

無論采用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法還是高通量測序技術(shù)研究都發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬（）在大多數(shù)生態(tài)環(huán)境中其出現(xiàn)頻率和相對(duì)豐度均為最高的AM真菌類群，為優(yōu)勢屬[24?26]。本研究采用高通量測序技術(shù)，在調(diào)查的所有煤矸石山中，發(fā)現(xiàn)球囊霉屬（）相對(duì)豐度最高，為優(yōu)勢屬。最近對(duì)晉華宮煤矸石山不同植物根際土壤AM真菌的研究也發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬（）占據(jù)主導(dǎo)地位[26]。這些結(jié)果表明球囊霉屬（）具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性，這可能與球囊霉屬（）有較強(qiáng)的養(yǎng)分吸收能力、繁殖能力及侵染植物的能力有關(guān)[27]。

晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山AM真菌僅鑒定出球囊霉屬（），而自然恢復(fù)煤矸石山還鑒定出多樣孢囊霉屬（Diversispora）和類球囊霉屬（Paraglomus），表明人工復(fù)墾方式由于修復(fù)年限較短，損失了一些稀有AM真菌屬。Ezeokoli等[28]在采煤區(qū)根系和根際土壤中也發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)AM真菌屬，其相對(duì)豐度也較低，盡管不同復(fù)墾年限采煤區(qū)植物根際土壤AM真菌多樣性無顯著差異，而群落組成差異顯著。然而，本研究中晉華宮兩種恢復(fù)方式的煤矸石山之間AM真菌多樣性和群落組成均無顯著差異，且共有的AM真菌OTUs達(dá)到38個(gè)，占比較高，分別達(dá)到兩座煤矸石山總OTUs的73%～76%，表明人工復(fù)墾10～20a煤矸石山土壤AM真菌群落可達(dá)到與自然恢復(fù)50～60a煤矸石山較為一致的效果。與本研究結(jié)果類似，侯湖平等[29]對(duì)徐州市不同復(fù)墾年限煤矸石山土壤細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，與未受煤矸石影響的對(duì)照土壤相比，復(fù)墾區(qū)土壤在各個(gè)分類水平上的細(xì)菌數(shù)量均減少，且群落多樣性也降低；而隨著復(fù)墾年限的增加，復(fù)墾區(qū)與對(duì)照土壤的貼近度越來越高。本課題組之前對(duì)煤矸石山植物群落的研究也發(fā)現(xiàn)，相比自然恢復(fù)50～60a的煤矸石山，盡管人工復(fù)墾10～20a煤矸石山植物種類較少，但兩者植物群落差異不顯著[20]。AM真菌是與植物共生的一種真菌，它只能利用宿主植物提供的碳，不能離體培養(yǎng)，其分布極大程度受植被類型的制約。Krüger等[17]在捷克采煤區(qū)的研究顯示，相比非生物因素，AM真菌群落組成主要受植物群落影響。甄莉娜等[26]調(diào)查了大同市晉華宮礦煤矸石山區(qū)禾本科、菊科、豆科和藜科植物根際土壤的AM真菌多樣性，發(fā)現(xiàn)禾本科和藜科根際AM真菌OTUs數(shù)量較多，而豆科和菊科根際AM真菌OTUs數(shù)較少；禾本科根際AM真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，多樣性和豐富度最高。本研究中晉華宮兩種恢復(fù)方式煤矸石山優(yōu)勢植物一致，均為禾本科中華草沙蠶，這可能是兩座煤矸石山AM真菌群落差異不顯著的原因。

一個(gè)地區(qū)的群落如何裝配及哪些物種可以共存是生態(tài)學(xué)的中心問題。AM真菌的物種多樣性及群落組成受多種生物和非生物因子如植被、土壤、人為干擾、氣候和地理距離等的影響[19,30]，但是它們的相對(duì)重要性極大地依賴于空間尺度，在不同尺度上，有不同的裝配因子起作用。在較小的尺度上AM真菌群落主要是由植物種類決定，在較大尺度上AM真菌群落組成主要受空間距離、土壤、溫度和植物群落類型等影響[15,31]。對(duì)全球1014個(gè)植物根部樣品AM真菌空間分布格局的研究表明，空間距離是影響AM真菌群落組成的主要因素[15]。本研究中除晉華宮人工復(fù)墾煤矸石山AM真菌群落Chao指數(shù)、香農(nóng)?威納指數(shù)顯著高于忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山外，三座煤矸石山其余的AM真菌多樣性指數(shù)間差異不顯著，然而晉華宮兩座煤矸石山與忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山之間AM真菌群落明顯分開，差異也達(dá)到顯著水平，這表明相比AM真菌多樣性，群落組成可能更敏感捕捉到環(huán)境的變化。另外，由于晉華宮自然恢復(fù)煤矸石山與忻州窯自然恢復(fù)煤矸石山恢復(fù)時(shí)間基本一致，表明空間距離可能對(duì)兩座煤矸石山AM真菌群落組成產(chǎn)生重要影響。Jansa等[32]在瑞士農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)，相比管理方式，土壤因子和空間距離是影響AM真菌群落主要因素，與本研究結(jié)果一致?？臻g距離較遠(yuǎn)的煤矸石山間由于各種氣候條件等不同，導(dǎo)致其土壤因子、植被類型等有較大差異。之前研究發(fā)現(xiàn)晉華宮煤矸石山優(yōu)勢植物為中華草沙蠶，而忻州窯煤矸石山優(yōu)勢植物為菊葉香藜。另外，本研究發(fā)現(xiàn)土壤全氮、有機(jī)碳和AM真菌孢子密度是造成晉華宮和忻州窯兩個(gè)地點(diǎn)煤矸石山AM真菌群落組成差異的主要驅(qū)動(dòng)因子。李曉亮在西藏色季拉山研究發(fā)現(xiàn)海拔主要通過影響土壤pH和速效磷從而間接影響AM真菌多樣性和群落組成；在森林、草地和農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)，不同利用方式主要通過影響土壤pH從而影響AM真菌群落[25]，本研究中，空間距離可能通過影響土壤全氮、有機(jī)碳和AM真菌孢子密度影響晉華宮和忻州窯兩個(gè)地點(diǎn)煤矸石山AM真菌群落組成。

3.2 結(jié)論

在調(diào)查的所有煤矸石山中，球囊霉屬（）是相對(duì)豐度最高的AM真菌類群，為優(yōu)勢屬。晉華宮人工復(fù)墾10～20a煤矸石山土壤AM真菌群落可達(dá)到與自然恢復(fù)50～60a煤矸石山較為一致的效果。晉華宮與忻州窯兩個(gè)地點(diǎn)煤矸石山土壤AM真菌群落差異較大，土壤全氮、有機(jī)碳含量和AM真菌孢子密度是驅(qū)動(dòng)AM真菌群落組成差異的主要因子。AM真菌作為生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，其與植物、土壤環(huán)境變化息息相關(guān)，本研究結(jié)果表明AM真菌群落變化有潛力成為反映煤矸石山生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)力的一類生物指標(biāo)。

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Community Response of Arbuscular Mycorrhizal Fungi to Restoration Managements and Sites in Coal Gangue Hills

LI Xia1, YE Cheng-cheng2, ZHANG Yong-fang1, ZHANG Xun1, HUO Li-juan3,SU Shi-ming4

（1.College of Agronomy and Life Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, China; 2.Wenzhou Good Agri-Products Development Service Center, Wenzhou 325000; 3.School of Environmental Science and Engineering, Taiyuan University of Science andTechnology, Taiyuan 030024; 4.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Environment, Ministry of Agriculture and Rural, Beijing 100081)

Illumina MiSeq high-throughput sequencing approach was applied to investigate arbuscular mycorrhizal fungi (AM fungi) community and relevant soil factors were analyzed in coal gangue hills with different restoration patterns (i.e., artificial restoration and natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong City; natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln). The results showed: α-diversity (Chao index and Shannon-Weiner index) of AM fungi community differed significantly between artificial restoration coal gangue hill of Jinhua palace and natural restoration coal gangue hill of Xinzhou kiln, but comparable α-diversity was observed between artificial restoration and natural restoration coal gangue hill of Jinhua palace. A total of 67 AM fungal OTUs assigned to 3 genus were recovered withbeing the predominant genus in all three coal gangue hills, whileandpopulations were exclusive tonatural restoration coal gangue hill of Jinhua palace in Datong city. Integrated the permutational multivariate analysis and nonmetric multidimensional scaling analysis suggested that AM fungi community were similar between the two restorations of Jinhua palace coal gangue hill, while the community significantly differed between coal gangue hill of Jinhua palace and Xinzhou kiln. The AM fungal community appeared to significantly correlate with soil total nitrogen, soil organic matter and AM fungi spore density. In conclusion, artificial restoration for 10-20 years can exert a comparable effect on AM fungal community as natural restoration 50-60 years in coal gangue hill of Jinhua palace. AM fungal community of the two locations showed great variance, and soil total nitrogen, soil organic matter and soil AM fungi spore density were the main driving factors.

Coal gangue hill; Arbuscular mycorrhizal fungi community;; Illumina MiSeq high-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1000-6362.2023.04.003

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2022?05?17

國家自然科學(xué)基金（41807130）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（201901D111306）；大同市平城區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202003）；大同市重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020044）

葉誠誠，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究，E-mail：chchye@cau.edu.cn

李俠，E-mail：lixia810504@163.com