啟動子低甲基化介導NOL9過表達促進肝癌細胞增殖

陳希瑤?許鎮?鄔喆斌?張博翔?彭亮?謝嬋

【摘要】目的 探討核仁蛋白9（NOL9）在肝癌中的表達和對肝癌細胞增殖的影響，進一步闡明NOL9在肝癌中表達上調的分子機制。方法 選擇7例肝癌患者的手術標本（癌組織和癌旁組織），通過蛋白免疫印跡法和反轉錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測NOL9在癌組織和癌旁組織中的表達水平；分別轉染小干擾RNA（si-RNA）到肝癌Huh7和HCCLM3細胞，采用RT-qPCR、蛋白免疫印跡法、細胞集落形成實驗、細胞計數試劑盒-8（CCK-8）分析差異；利用TCGA數據庫肝癌數據評估NOL9 mRNA表達水平和啟動子的甲基化水平，同時評估NOL9和DNA甲基異位擦除蛋白家族（TET1、TET2和TET3）轉錄水平的相關性；采用RT-qPCR和蛋白免疫印跡法檢測DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理后Huh7和HCCLM3細胞中NOL9表達水平的變化；5-Aza-Dc預處理后再轉染si-RNA，采用細胞集落形成實驗和CCK-8分析細胞增殖的差異。結果 NOL9在肝癌組織中表達上調；敲低NOL9能抑制肝癌Huh7和HCCLM3細胞增殖以及細胞集落形成（P均 < 0.01）；肝癌中NOL9啟動子甲基化與其mRNA水平呈負相關，NOL9 mRNA水平和一個CpG區域（cg07997941）呈負相關；在肝癌中，NOL9與TET1、TET2和TET3的轉錄水平均呈正相關；在給予5-Aza-Dc處理后，NOL9的表達上調；5-Aza-Dc的處理能逆轉敲低NOL9對肝癌細胞增殖以及克隆形成的抑制作用。結論 NOL9在肝癌組織中高表達，敲低NOL9抑制了肝癌細胞的增殖和克隆形成，其上調機制可能與啟動子低甲基化相關。

【關鍵詞】肝細胞癌；核仁蛋白9；增殖；甲基化

Promoter hypomethylation promotes proliferation of hepatocellular carcinoma cells by mediating NOL9 overexpression

Chen Xiyao， Xu Zhen， Wu Zhebin， Zhang Boxiang， Peng Liang， Xie Chan. Department of Infectious Disease，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，510630 Guangzhou，China

Corresponding author，Xie Chan，E-mail： xchan@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To evaluate the expression of nucleolar protein 9 （NOL9） in hepatocellular carcinoma and the effect of NOL9 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells， aiming to elucidate the molecular mechanism of NOL9 overexpression in hepatocellular carcinoma. Methods Surgical specimens （cancerous and para-cancerous tissues） were obtained from 7 patients with hepatocellular carcinoma. The expression levels of NOL9 in the cancerous and para-cancerous tissues were determined by Western blot and RT-qPCR. Huh7 and HCCLM3 cell were transferred with NOL9 si-RNA. The differences between two groups were analyzed by RT-qPCR， Western blot， colony formation assay and CCK-8 assay. Hepatocellular carcinoma data from TCGA database were used to evaluate the expression level of NOL9 mRNA and promoter methylation level. The correlation between NOL9 and transcription levels of Ten-eleven-translocation enzymes （TET1， TET2 and TET3） was analyzed. After administration of 5-Aza-Dc， the expression level of NOL9 in Huh7 and HCCLM3 cells was detected by RT-qPCR and Western blot. The cells were pretreated with 5-Aza-Dc and transfected with si-RNA， and then colony formation assay and CCK-8 assay were used to analyze the difference of cell proliferation. Results The expression of NOL9 was up-regulated in hepatocellular carcinoma tissues compared with para-cancerous tissues. Knockdown of NOL9 could significantly inhibit cell proliferation and cell colony formation in Huh7 and HCCLM3 cells （all P < 0.01）. The methylation level of NOL9 promoter was negatively correlated with its mRNA level in hepatocellular carcinoma. NOL9 mRNA level was negatively correlated with one CpG region （cg07997941）. In hepatocellular carcinoma， NOL9 was positively correlated with the transcription levels of TET1， TET2 and TET3. After administration of 5-Aza-Dc， the expression level of NOL9 was up-regulated. Treatment with 5-Aza-Dc could reverse the inhibitory effect of NOL9 knockdown on cell proliferation and colony formation. Conclusion NOL9 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues. Knockdown of NOL9 suppresses the proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells. The mechanism underlying NOL9 up-regulation may be related to promoter hypomethylation.

【Key words】Hepatocellular carcinoma； NOL9； Proliferation； Methylation

肝細胞癌（肝癌）是原發性肝癌的主要形式，占肝癌病例的75%～85%，且是全球癌癥相關死亡的第三大原因［1］。自2019年Science一篇文獻報道，核仁可以暫時性儲存錯誤折疊的蛋白質，對于蛋白質的質量控制至關重要［2］。核仁蛋白（NOL）已成為惡性腫瘤相關領域的研究熱點，Hong等［3］發現端粒酶以NOL1蛋白依賴的方式激活細胞周期蛋白D1基因的轉錄。Gu等［4］在前列腺癌中發現NOL8的上調及其的致癌作用。Chen等［5］根據Kaplan-Meier生存分析得出結論，NOL4的表達與子宮內膜癌的總生存時間相關。Liang等［6］發現NOL6在子宮內膜癌細胞中作為一種促癌基因。Heindl等（2010年）和Bielczyk等（2015年）發現，NOL9是一種多核苷酸5′-激酶，主要位于細胞核仁中，對核糖體RNA成熟至關重要。已有研究發現NOL9與多種惡性腫瘤密切相關，如三陰性乳腺癌和急性髓系白血病等［7-8］。Castle等（2012年）認為，NOL9參與重要癌癥標志基因Las1L的組裝和運輸，且與細胞周期相關蛋白P53密切相關，可誘導細胞周期阻滯。這些都提示NOL9可能與肝癌的發生、發展過程密切相關。

本研究旨在闡明NOL9在肝癌中的具體作用和潛在機制，以期尋找肝癌診斷的生物標志物和潛在的治療靶點。

材料與方法

一、研究對象

收集2020年9月至2021年12月在中山大學附屬第三醫院行肝癌切除術的7例患者肝臟腫瘤組織和癌旁組織樣本，-80℃保存。肝癌組織均經病理學確診。本研究經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準（批件號：中大附三申倫［2021］02-356），所有參與者均知情同意。

二、細胞及主要試劑

肝細胞癌Huh7和HCCLM3細胞均來自中山大學附屬第三醫院肝病實驗室，胎牛血清、高糖DMEM培養基、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶溶液、青霉素加鏈霉素以及磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Gibco公司，NOL9小干擾RNA（siRNA）及陰性對照購自廣州漢一生物科技有限公司，轉染試劑Lipofectamine 3000及Opti-MEM無血清培養基購自美國Thermo Fisher公司，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，蛋白免疫印跡相關試劑均購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司，DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc購自美國Sigma公司，PCR所需引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，第一抗體：NOL9（1∶1000， ab140597）和GAPDH（1∶3000， ab8245）以及第二抗體均購自英國Abcam公司，細胞計數試劑盒-8（CCK-8）試劑盒購自廣州信研生物科技有限公司，結晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司。

三、方 法

1.細胞培養和轉染

取對數生長期的肝癌HCCLM3和Huh7細胞用于實驗。根據轉染試劑Lipofectamine 3000脂質體說明書將NOL9 siRNA（si-NOL9#1和si-NOL9#2）和陰性對照si-RNA分別添加到肝癌HCCLM3和Huh7細胞，轉染的細胞在恒溫箱培養24～72 h后進行后續實驗。根據轉染物的不同，實驗分為NOL9敲低組（si-NOL9#1和si-NOL9#2）和陰性對照組（si-nc）。

2. CCK-8檢測

細胞轉染24 h后，接種在96孔板中，細胞密度1×104/孔，每組設置6個復孔。使用CCK-8檢測細胞增殖能力，根據CCK-8試劑盒說明書，在37℃下培養1 h后，酶標儀測量490 nm處各孔吸光度值，棄去最小值和最大值，計算細胞增殖指數。

3.細胞集落形成實驗

細胞轉染24 h后，接種在6孔板中，細胞密度500/孔，每組設置3個復孔。細胞培養14 d，每3 d更換培養基。細胞固定后采用結晶紫染色，并用Image J軟件計算克隆形成數量。

4. RNA分離和RT-qPCR

按照TRIzol法提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計NANODROP ONE檢測RNA的濃度和純度。接下來，根據反轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄成模板DNA（cDNA）；再根據實時熒光定量PCR試劑盒說明書，將cDNA進行RT-qPCR檢測。2-ΔΔCt法計算目的 mRNA 相對表達量。

表1 目的基因的引物序列

基 因 引物序列

NOL9 正向 5′-ATCTGTCGTGTGACTTGCCTC-3′

反向 5′-AAAAATTCTGCATCGACCAACG-3′

GAPDH 正向 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′

反向 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′

5.蛋白免疫印跡法

采用蛋白免疫印跡法檢測NOL9蛋白的表達，采用化學發光法檢測試劑盒進行顯影，以GAPDH為對照，計算各蛋白的相對表達量。

6.生物信息學分析

利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數據分析HCC中NOL9 mRNA和啟動子甲基化水平。使用UALCAN檢測HCC中NOL9啟動子甲基化水平［9］。探針（cg07997941）信息從MEXPRESS獲得［10］。

四、統計學處理

統計學分析和圖形繪制分別使用SPSS 26.0版軟件、GraphPad Prism 8.0。正態分布資料以? 表示，比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，進一步組間兩兩比較用LSD-t檢驗；癌旁組織與癌組織間比較用配對t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、肝癌和癌旁組織中NOL9 mRNA以及蛋白相對表達量比較

收集7例肝癌患者手術切除的新鮮組織標本，通過RT-qPCR和蛋白免疫印跡檢測NOL9在癌組織和癌旁組織中的表達情況。與癌旁組織相比，癌組織的NOL9 mRNA（t = 11.76，P < 0.001）和蛋白（t = 2.52，P = 0.045）相對表達量均明顯上調。見圖1A～C。

二、NOL9的敲低對HCCLM3和Huh7細胞集落形成的影響

轉染后的RT-qPCR檢測結果顯示，在HCCLM3細胞中，與si-nc組細胞相比，si-NOL9#1（t = 9.37，P < 0.001）和si-NOL9#2（t = 9.54，P < 0.001）組細胞的NOL9 mRNA和蛋白相對表達均明顯下調；在Huh7細胞中，與si-nc組細胞相比，si-NOL9#1（t = 7.72，P < 0.001）和si-NOL9#2（t =

9.84，P < 0.001）組細胞的NOL9 mRNA和蛋白相對表達均明顯下調。見圖2A～C。

平板克隆形成實驗結果顯示，在HCCLM3中，si-NOL9#1組（t = 13.18，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 14.79，P < 0.001）集落數均少于si-nc組；在Huh7中，si-NOL9 #1組（t = 6.59，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 8.40，P < 0.001）集落數也均少于si-nc組。見圖2D、E。

三、NOL9的敲低對HCCLM3和Huh7細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示，在HCCLM3細胞中，48 h

后，si-NOL9#1組（t = 7.34，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 15.00，P < 0.001）細胞活力均低于si-nc組；72 h后，si-NOL #1組（t = 18.72，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 29.47，P < 0.001）細胞活力仍低于si-nc組。在Huh7細胞中，48 h后，si-NOL9#1組（t = 13.64，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 11.02，P < 0.001）細胞活力均低于si-nc組；72 h后，si-NOL9#1組（t = 12.74，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 12.40，P < 0.001）細胞活力仍低于si-nc組。見圖3A、B。

四、NOL9啟動子甲基化水平

生物信息學分析表明，肝癌中NOL9 mRNA水平與一個CpG區域（cg07997941）呈負相關（R =

-0.25，P < 0.001）。此外，在肝癌中NOL9的表達上調，而其啟動子甲基化水平下調（P均 < 0.001），見圖4A～C。NOL9與TET1（R = 0.35，P < 0.001）、TET2（R = 0.52，P < 0.001）和TET3（R =

0.50，P < 0.001）的轉錄水平均呈正相關。見圖4D～F。

五、5-Aza-Dc對NOL9表達的影響

在給予不同濃度DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理后，通過RT-qPCR檢測，NOL9 mRNA水平呈濃度依賴性上調（P均 < 0.001），見圖5A。蛋白免疫印跡法檢測顯示，不同濃度5-Aza-Dc處理后，NOL9蛋白表達上調（P均 < 0.001）。見圖5B、C。

六、5-Aza-Dc對NOL9敲低細胞增殖的影響

CCK8實驗結果顯示，DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc能逆轉NOL9敲低對HCCLM3和Huh7細胞增殖的抑制作用（P均 < 0.001）。見圖6。

討論

由于高復發、高轉移、預后差及5年生存率低，肝癌發生、發展的分子調控機制仍需進一步深入研究。在本研究中，我們揭示了NOL9在肝癌中表達上調，NOL9的敲低抑制細胞增殖和克隆形成，并證實了啟動子低甲基化促進NOL9的表達。

眾所周知，表觀遺傳修飾在基因表達的轉錄調控中起著關鍵作用，如乙酰化、甲基化、磷酸化以及泛素化等，其中DNA啟動子甲基化水平與基因轉錄活性密切相關。表觀遺傳修飾通過對基因表達的精細調節參與調控許多關鍵的生物學過程，如細胞分化和胚胎發生。同時，許多研究表明表觀遺傳修飾在癌癥相關基因動態轉錄調節中發揮重要作用［11］。TET蛋白家族可將5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，該過程是DNA去甲基化的1個必要階段［12］。已有研究表明，TET蛋白家族對癌基因或抑癌基因啟動子甲基化的調控是肝癌進展中關鍵的表觀遺傳修飾因子［13-14］。本研究顯示，在肝癌中NOL9啟動子甲基化降低，而NOL9 mRNA表達被上調。此外，我們還觀察到在肝癌中NOL9 與TET1、TET2及TET3在轉錄水平呈正相關。同時，體外實驗進一步驗證DNA甲基化在NOL9表達調控中的作用，我們用DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理肝癌細胞，然后檢測NOL9的表達。結果顯示，5-Aza-Dc處理后NOL9的mRNA和蛋白表達明顯上調。以上結果說明，NOL9啟動子低甲基化可能是肝癌細胞系和肝癌組織中NOL9表達增加的關鍵因素。與此同時，本研究通過體外實驗初步探討了NOL9在肝癌中的作用。本研究首先將NOL9的siRNA轉染至HCCLM3和Huh7細胞，通過調節NOL9的表達水平，利用集落形成實驗及CCK-8觀察細胞生長的變化。轉染NOL9后細胞生長受到抑制。這說明NOL9可能通過促進肝癌細胞生長，在肝癌發生、發展中發揮癌基因的作用。接著在轉染的細胞中加入5-Aza-Dc，細胞的增殖能力較未加入5-Aza-Dc升高，進一步證明對癌基因NOL9的去甲基化修飾促進肝癌細胞的生長，這與既往研究結論一致。因此，NOL9異常甲基化可用于肝癌細胞增殖的預測因子。

本研究有三點不足：①組織樣本量不夠大；②未進一步探究NOL9啟動子甲基化的調控機制；③未通過動物模型對NOL9在肝癌發生、發展中的作用進行體內研究。后續相關實驗驗證將進一步闡明。

綜上所述，NOL9作為癌基因促進腫瘤細胞增殖，其表達上調與啟動子低甲基化有關。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-11-25）

（本文編輯：楊江瑜）