胰腺神經內分泌腫瘤微環境的形成機制及免疫/靶向治療研究進展

楊佳妮　張海蓉

摘要：胰腺神經內分泌腫瘤微環境是由腫瘤細胞、免疫/免疫抑制細胞和細胞外基質成分等共同構建的促癌微環境，以免疫抑制為突出特征，不僅可以抑制抗腫瘤免疫反應、促進血管新生導致腫瘤細胞免疫逃逸和侵襲轉移，也是患者對抗腫瘤治療產生耐藥的主要原因。因此，從胰腺神經內分泌腫瘤微環境出發，設計新的抗腫瘤治療策略以逆轉抑制性腫瘤微環境對提高胰腺神經內分泌腫瘤的療效有重要意義。本文綜述了胰腺神經內分泌腫瘤微環境的組成和作用及其靶向治療的最新研究進展。關鍵詞：胰腺腫瘤； 神經內分泌瘤； 腫瘤微環境；? ?治療學

Research advances in the mechanism of tumor microenvironment and targeted therapy for pancreatic neuroendocrine tumor

YANG Jiani， ZHANG Hairong. （Department of Gastroenterology， The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， National Key Clinical Specialty， Yunnan Province Clinical Research Center for Digestive Diseases， Kunming 650032， China）

Corresponding author：ZHANG Hairong， zhr919@sina.com （ORCID：0000-0002-9918-3673）

Abstract：The tumor microenvironment of pancreatic neuroendocrine tumor is a tumor-promoting microenvironment composed of tumor cells， immune/immunosuppressive cells， and extracellular matrix and has the marked feature of immunosuppression. It can lead to the immune escape， invasion， and metastasis of tumor cells by inhibiting antitumor immune response and promoting angiogenesis and is also the main cause of drug resistance to antitumor treatment. Therefore， it is of great significance to design new therapeutic strategies from the perspective of the tumor microenvironment of pancreatic neuroendocrine tumor to reverse suppressive tumor microenvironment and improve the treatment outcome of pancreatic neuroendocrine tumor. This article reviews the latest research advances in the composition and role of the tumor microenvironment of pancreatic neuroendocrine tumor and related targeted therapy.

Key words：Pancreatic Neoplasms; Neuroendocrine Tumors; Tumor Microenvironment; Therapeutics

胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumor，pNET）是一種相對罕見、起源于胰腺內分泌細胞和肽能神經元的腫瘤。近年來，pNET發病率呈上升趨勢［1］。根治性手術切除是目前唯一可治愈pNET的治療策略，然而pNET起病隱匿、早期診斷困難，很多患者至中晚期才能被確診以致失去根治性手術指征［2］。對于轉移性pNET患者，目前已有旨在控制癥狀和抑制腫瘤生長的治療方式，但部分患者仍獲益有限。腫瘤微環境被認為是決定腫瘤生物學的關鍵因素，近年來隨著對腫瘤微環境研究的深入，為pNET致病機理和靶向治療方面提供了新思路。

1pNET的腫瘤微環境

pNET腫瘤微環境主要由腫瘤細胞、腫瘤相關中性粒細胞（tumor-associated neutrophils，TAN）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）、腫瘤相關成纖維細胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAF）、調節性T淋巴細胞（Treg）及骨髓來源抑制細胞（myeloid derived suppressor cells，MDSC）等細胞成分及細胞外基質（ECM）等相互作用共同構成。pNET腫瘤微環境主要表現為低免疫原性、高免疫抑制性特點，即雖然有不同的免疫/免疫抑制細胞浸潤，但具有抗腫瘤作用的免疫效應細胞多處于數量與功能失衡狀態，而免疫抑制細胞則功能活躍且大量存在并分泌抑制性細胞因子誘導局部/全身免疫抑制。此外，高度血管化以及活躍的ECM重塑也是pNET免疫抑制性腫瘤微環境的重要促成因素，為pNET血管新生、細胞增殖、侵襲轉移及抗腫瘤治療耐藥創造了有利條件。

1.1pNET腫瘤微環境中主要的抗腫瘤免疫成分pNET 腫瘤微環境中的免疫細胞（尤其是T淋巴細胞）是介導抗腫瘤免疫的主要細胞成分。研究［3］顯示，pNET 腫瘤微環境中存在不同的T淋巴細胞群，包括CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD45RO+T淋巴細胞及CD3+T淋巴細胞，但抗腫瘤免疫反應受到不同程度的限制，使pNET細胞能夠逃避免疫監控。pNET中豐富的TAM、MDSC等免疫抑制細胞可產生T淋巴細胞激活負調控因子如程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制效應T淋巴細胞的活化和功能［4-5］。此外，pNET細胞本身也可通過多種機制抑制免疫細胞的抗腫瘤作用：（1）表達程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）以及細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）的相關配體以誘導效應T淋巴細胞凋亡、失活和耗竭［3，6］；（2）抑制pNET中人類白細胞抗原Ⅰ的成分（如β2-微球蛋白）的表達，阻礙抗原呈遞以抑制CD8+T淋巴細胞免疫應答［7］；（3）通過腫瘤細胞和CAF過表達的吲哚胺2，3-雙加氧酶和色氨酸2，3-雙加氧酶消耗腫瘤微環境中對T淋巴細胞增殖至關重要的色氨酸，生成犬尿氨酸及其衍生物，促進Treg生成及抑制樹突狀細胞的免疫原性［8］。

三級淋巴樣結構（tertiary lymphoid structures，TLS）是在非淋巴組織中形成的免疫細胞的有組織聚集體，可招募免疫細胞流入腫瘤部位，推動免疫反應對抗腫瘤的發生和進展。Allen等［9］發現在RIP1-Tag2小鼠模型中，PD-L1阻斷聯合抗血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor，VEGFR）2抗體DC101可誘導高內皮小靜脈形成并激活淋巴素β受體信號通路促進淋巴細胞浸潤及TLS形成，從而抑制pNET腫瘤生長及轉移。在Zhang等［10］的研究中超過1/3的非功能pNET存在TLS浸潤，其中最大的TLS亞群是CD45RO+T淋巴細胞（39.35%），其次是CD20+B淋巴細胞（36.61%）、CD4+T淋巴細胞（20.05%）、CD8+T淋巴細胞（3.99%），而免疫抑制細胞（CD68+巨噬細胞和Treg）則浸潤較低，與患者更好的臨床預后如淋巴結陰性、無血管和神經侵犯、TNM分期及WHO分級較低有關，所以，誘導TLS形成有望成為未來pNET治療新的研究方向。

1.2免疫抑制細胞

1.2.1TAN腫瘤組織可產生趨化因子趨化中性粒細胞通過血管壁進入腫瘤組織形成TAN，分泌基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9等誘導血管生成、降解ECM和促進腫瘤發生，還能減弱CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤作用并募集TAM和Tregs浸潤促進腫瘤進展［11］，與pNET分級增加、肝臟轉移、淋巴結及周圍神經浸潤顯著相關，是預后不良的危險因素［12］。與TAM類似，與原發性腫瘤相比TAN浸潤在肝臟轉移性病變中更常見并可能與活躍的補體通路有關［13］。除了浸潤狀態，中性粒細胞死亡過程中產生的細胞外陷阱也影響pNET患者的生存結局。細胞外陷阱是以核內或線粒體內DNA為骨架，負載彈性蛋白酶和水解酶等組成的網狀結構，可阻止腫瘤細胞與CD8+T淋巴細胞和自然殺傷細胞的接觸及調節腫瘤微環境中的CAF。在pNET中就細胞外陷阱促腫瘤相關機制的研究還尚少，但最近Xu等［11］發現中性粒細胞、巨噬細胞細胞外陷阱陽性是腫瘤預后不良的獨立危險因素，與無復發生存率降低相關。

1.2.2TAMTAM可分為M1型巨噬細胞（經典激活）和M2型巨噬細胞（替代激活）。腫瘤組織中浸潤的TAM大部分通過腫瘤細胞和基質細胞產生的細胞因子和趨化因子從外周血募集并完成M2極化，從而分泌多種促血管生成因子和侵襲性介質調節腫瘤微環境。在pNET中，原發及轉移性病灶均存在數量豐富的TAM，抑制了CD8+T淋巴細胞的浸潤及腫瘤殺傷功能并分泌VEGF及血管生成素受體Tie-2，介導腫瘤血管生成轉換及腫瘤生長、轉移，是不良預后的標志［4，6，14］。此外，pNET細胞及TAM均可產生組織蛋白酶Z，并通過RGD（Arg-Gly-Asp）模體、整合素的參與及隨后在腫瘤細胞中激活FAK-Src信號介導pNET細胞的侵襲及遷移［15］。

1.2.3CAF腫瘤細胞和CAF之間復雜的相互作用是病理性ECM重塑和結締組織增生的主要原因，被認為是某些腫瘤的不良預后因素及治療的重要靶點。在pNET中，腫瘤細胞可分泌TGF-β等可溶性因子刺激成纖維細胞的增殖和激活［16］，而CAF又可通過分泌TGF-β1、結締組織生長因子和成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）限制T淋巴細胞浸潤及募集、促進基質纖維化和血管新生［17-18］，或通過激活致瘤mTOR信號參與促進pNET的增殖、遷移及侵襲［19］。

1.2.4TregTreg是一類具有顯著免疫抑制作用的CD4+T淋巴細胞亞群，在生理條件下的免疫耐受維持中起著重要的作用，但也可通過分泌TGF-β、IL-10及CTLA-4、PD-1與T淋巴細胞受體結合，抑制CD4+輔助性T淋巴細胞1、CD8+T淋巴細胞以及自然殺傷細胞的增殖及活化從而驅動腫瘤細胞免疫逃逸。正常胰腺組織中Treg含量極少，但NET的發展伴隨著激活的Treg逐漸積累，如研究顯示高達97%的肝轉移胃腸胰NET（GEP-NET）被Treg浸潤，并在表面高表達PD-1、PD-L1［20-21］，Treg也是pNET患者疾病進展及肝轉移的獨立預后因素，浸潤密度增加與總生存期的縮短顯著相關［20，22］。

1.2.5MDSCMDSC是由未成熟髓樣細胞組成的異質性群體，包括單核型（M-MDSC）、粒細胞型（G-MDSC）和多核型（PMN-MDSC）亞群。在GEP-NET中，較高的循環和組織浸潤M-MDSC可通過過表達PD-L1干擾抗腫瘤T淋巴細胞效應，促使腫瘤免疫逃逸，與腫瘤的分期增加和轉移顯著相關，具有鑒別轉移亞組甚至對潛在的早期轉移作出預測的作用［5］。

1.2.6肥大細胞腫瘤組織中的肥大細胞活化后能分泌多種介質參與腫瘤微環境的重塑及誘導血管新生［23］。Soucek等［24］研究表明胰島β細胞內轉錄因子Myc的激活通過釋放IL-1β等介質招募肥大細胞、巨噬細胞及中性粒細胞快速涌入腫瘤及其鄰近間質，從而構建有利于胰島素瘤血管生成及生長的微環境，而抑制肥大細胞脫顆?；騽摻ǚ蚀蠹毎毕菪∈竽Ｐ涂烧T導腫瘤和內皮細胞缺氧和凋亡，使腫瘤增殖受抑。然而一項對187例pNET患者常見免疫細胞的綜合分析研究［25］顯示，肥大細胞在pNET中有潛在抗腫瘤作用，是無進展生存期（progression free survival，PFS）延長的獨立預測因子。因此，肥大細胞浸潤與預后的好壞相關，其在pNET中的作用機制及效應還需要進一步研究。

1.3pNET微環境中的細胞外成分

1.3.1ECM及ECM降解腫瘤相關ECM可阻止藥物擴散并促進腫瘤細胞的增殖、遷移和血管生成。Naba等［26］用定量蛋白質組學方法證實RIP1-Tag2小鼠胰島素瘤模型ECM蛋白表達組成明顯改變，纖維蛋白-3、纖維蛋白原和激肽原顯著上調，而飾膠蛋白、半椎蛋白、凝集素、半乳糖凝集素-1等則表達下調，促進了胰島素瘤血管生成轉換和微血管生成。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細胞由上皮細胞向間充質細胞轉化的過程，是腫瘤細胞實現轉移前獲得侵襲性表型的關鍵步驟。在TGF-β等EMT誘導信號作用下［19］，Twist等轉錄因子表達升高可誘導細胞黏附分子E-cadherin下調，促使上皮細胞失去極性和細胞間黏附作用，轉化為間充質表型，從而促進膠原合成及啟動pNET浸潤和轉移［27］。

ECM的降解及重塑也是腫瘤浸潤性生長及轉移的重要促成部分。在腫瘤微環境中，被降解的ECM成分碎片可招募炎癥細胞浸潤創造有利于腫瘤生長的局部微環境，而重塑后的ECM可促進腫瘤細胞穿越宿主組織屏障并誘導生長因子釋放和促進腫瘤血管新生。pNET中ECM的動態變化主要歸因于肝素酶和MMP家族。肝素酶是一種內源性β-葡萄糖醛酸酯酶，主要來源于腫瘤微環境中的Gr1+/Mac1+先天免疫細胞（如巨噬細胞），在RIP1-Tag2小鼠胰島素瘤的多階段進展過程中不斷增加，可裂解ECM糖蛋白的肝素硫酸鹽側鏈導致基質松動，并動員VEGF等促血管生成分子誘導血管、腫瘤周圍淋巴管生成，促進腫瘤進展及遠處轉移［28-29］。MMP屬于鋅依賴性蛋白酶家族，在IL-1β等的作用下，MMP9于腫瘤微環境中積累可降解ECM并促進pNET細胞增殖和遷移［30］，但抑制pNET中MMP9表達可改變腫瘤微環境中蛋白酶譜，使半胱氨酸組織蛋白酶尤其組織蛋白酶B表達上升，從而參與降解纖連蛋白、Ⅰ/Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白等ECM成分以及E-鈣黏蛋白，加速腫瘤進展［31］。

1.3.2血管生成pNET是一種高度血管化的腫瘤，其血管生成由以下多種途徑介導：（1）促血管生成因子產生增多。在pNET中腫瘤細胞及基質細胞可分泌血小板源性生長因子、信號素、神經纖毛蛋白2及Tie-2、c-kit、VEGF等促血管生成因子參與促進pNET血管生成［6，14，32-33］。（2）ECM中基質蛋白誘導。骨膜蛋白可促進人pNET中M2-TAM的募集及極化并使FGF表達升高，直接促進血管內皮細胞增殖、血管成熟及調節腫瘤細胞和基質細胞產生其他促血管生成分子，誘導pNET血運重建［34-35］。（3）乏氧微環境誘導。在快速增殖的pNET小鼠腫瘤缺氧區域缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）控制酶CYP46A1過表達，可通過激活HIF-1α-24S-HC軸使促血管生成中性粒細胞在CYP46A1+胰島附近定位，誘導血管生成轉換及腫瘤增長［36］。

2pNET微環境的靶向及免疫治療進展

2.1靶向腫瘤血管生成抗血管生成藥物主要包括酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinases inhibitor，TKI）和非酪氨酸激酶抑制劑。繼舒尼替尼之后，包括帕唑替尼、卡博替尼等在內的多靶點TKI已被證實在pNET中可獲得良好療效，其在pNET治療中的應用及研究進展主要體現在一些新藥的研究成果。索凡替尼是國產小分子多靶點TKI，SANET-p Ⅲ期研究［37］顯示，索凡替尼治療延長了晚期pNET患者的中位PFS（10.9個月）且具有可接受的安全性，有望成為pNET晚期患者的一種治療選擇。侖伐替尼主要作用于VEGFR 1～3、成纖維生長因子受體（FGFR）1～4及kit。Ⅱ期TALENT臨床研究［38］中侖伐替尼治療pNET患者的客觀緩解率（objective response rate，ORR）為44.2%，可顯著延長中位PFS（15.7個月），但疲勞、高血壓和腹瀉等不良反應較嚴重，高達93.7%的患者需要減少或中斷劑量。除了一系列TKI藥物，傳統的非TKI藥物還包括VEGF人源化單抗貝伐珠單抗。最近發表的一項Ⅱ期研究（CALGB 80701）［39］顯示，依維莫司聯合貝伐珠單抗治療晚期pNET患者有較高的ORR（31%）且顯著延長了PFS（16.7個月），但治療相關毒性反應也更為常見。

2.2缺氧激活前藥抗血管生成治療的主要缺點是在缺氧條件可誘導其他替代性促血管生成因子的產生并激活逃逸機制從而介導治療耐藥。缺氧激活前藥與抗血管生成治療聯合使用可能通過在腫瘤缺氧區域內局部發揮細胞毒性作用而克服這一限制。如Evofosfamide（TH-302）可在缺氧的腫瘤區域選擇性激活并進一步轉化為細胞毒性效應劑：DNA烷化劑溴代異磷酰胺氮芥從而殺死腫瘤細胞。在pNET中，SUNEVO Ⅱ期研究［40］顯示舒尼替尼聯合TH-302治療可使17.6%的患者達到完全或部分緩解，PFS為10.4個月，但全身毒性較高致使88.2%的患者停止治療而不具可行性，提示未來研究中應嘗試用其他更安全的療法克服pNET對抗血管生成藥物的耐藥性。

2.3抗免疫抑制性細胞治療腫瘤微環境中異常的免疫抑制細胞組分為pNET的治療提供了靶點。Tie-2+巨噬細胞是促血管生成和組織重塑功能極強的TAM亞群，能促進血管淋巴管生長、抑制抗腫瘤免疫從而驅動腫瘤發生發展及治療耐藥。有研究［14］顯示Rebastinib治療減少了Tie-2+巨噬細胞募集、浸潤和血管生成素的生成，顯著抑制了pNET小鼠模型腫瘤的生長和轉移。氯膦酸鹽脂質體是一種巨噬細胞清除劑，可通過巨噬細胞內吞作用進入TAM并誘導其凋亡。在RIP1-Tag2小鼠胰島素瘤模型中，氯膦酸鹽脂質體可顯著消耗巨噬細胞，增強抗腫瘤CD3+T淋巴細胞浸潤比例，導致腫瘤血管生成受抑并抑制了腫瘤侵襲性生長和惡性轉化［4］。伊布替尼是一種布魯頓TKI，可抑制肥大細胞脫顆粒使pNET動物模型血管塌陷和腫瘤消退，然而2019年最新公布的一項驗證伊布替尼抗GEP-NET作用的Ⅱ期臨床試驗中并沒有達到客觀治療反應［41］。因此，靶向腫瘤微環境的免疫抑制細胞，恢復抗腫瘤免疫細胞活性及功能是一種極具潛力的pNET治療方法，進一步研究有望為pNET患者帶來新的突破。

2.4免疫檢查點抑制劑免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）是通過靶向阻斷腫瘤細胞及基質細胞上過表達的免疫檢查點分子，逆轉免疫抑制信號進而增強抗腫瘤免疫反應的治療手段。ICI的出現改進了腫瘤治療方案。然而，有研究［42-43］表明在pNET中ICI單藥如派姆單抗和斯巴達珠單抗（PD-1抑制劑）治療pNET的ORR分別為6.3%、3.0%，均未達到有效的客觀緩解（≥10%）。分析其療效可能受限于pNET中PD-L1表達較少、腫瘤突變負荷低、微衛星不穩定及DNA錯配修復缺陷少見、對T淋巴細胞殺傷內在不敏感等特性。根據pNET 腫瘤微環境的特點及其對免疫治療的影響，將不同的糾正免疫抑制腫瘤微環境的策略聯合應用可能有助于改善pNET的治療效果。如CA209-538研究［44］顯示伊匹木單抗（CTLA-4抑制劑）和納武利尤單抗（PD-1抑制劑）聯合治療在高級別pNET患者中ORR高達43%，改善了pNET患者PFS和總生存期。此外，可放大抗腫瘤應答的溶瘤病毒是正在評估的可增加對免疫檢查點阻斷易感性的治療方式之一。研究［45］顯示mpJX-594聯合PD-1單抗可協同誘導CD8+T淋巴細胞及自然殺傷細胞內流促進抗腫瘤免疫，顯著抑制腫瘤增殖及肝轉移，延長了pNET小鼠模型的生存時間。

2.5嵌合抗原受體T淋巴細胞免疫療法嵌合抗原受體T淋巴細胞（chimeric antigen receptor-modified T-cell，CAR-T）是利用基因編輯技術將改裝的T淋巴細胞回輸到患者體內從而精準靶向殺傷腫瘤細胞的一種新型細胞免疫療法，可為腫瘤患者提供持久有效的抗腫瘤免疫能力。生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）在GEP-NET中廣泛表達且與腫瘤分化程度和預后相關［46］，因此靶向SSTR的CAR-T淋巴細胞為SSTR+GEP-NET提供了新的免疫干預措施，且在體內外研究中都顯示出了高度特異性的抗腫瘤活性［47］。CDH17又名LI鈣黏蛋白，是重鏈單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody）的靶點，既可在NET腫瘤細胞表達，也表達于健康組織如腸上皮細胞之間側膜。最近Feng等［48］研發了靶向CDH17的納米抗體VHH1驅動CAR-T（CDH17CAR-T），通過體外研究發現，CDH17CAR-T能特異性殺傷人和小鼠pNET腫瘤細胞，且進一步在異種移植瘤或原發小鼠模型中避免攻擊同樣表達CDH17正常細胞的同時根除表達CDH17的pNET細胞。因此，CAR-T療法在pNET治療中有巨大潛力，對CAR-T及相關靶點進一步研究有希望為pNET治療開展新篇章。

3小結

在pNET中，免疫抑制腫瘤微環境的形成不僅為腫瘤的發生發展及遠處轉移創造了有利條件，也為pNET的治療帶來了難度。因此闡明腫瘤微環境中更全面、完整的免疫浸潤的促/抗腫瘤機制、識別潛在治療靶點可為進一步了解pNET的發生發展機制及合理設計成功的臨床試驗改善患者預后奠定基礎。目前，針對pNET微環境的ICI、CAR-T免疫療法等已成為pNET治療的研究熱點并在臨床前研究中取得了新的進展，有待進一步的臨床驗證。總之，根據腫瘤微環境的特點設計合理的治療策略，清除TAN、TAM等過多的免疫抑制細胞、增加效應T淋巴細胞的浸潤及其抗腫瘤活性以逆轉免疫抑制性腫瘤微環境，有望為更高效、精確的治療pNET帶來新的突破。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。 作者貢獻聲明：楊佳妮負責收集、分析文獻，撰寫論文; 張海蓉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2022-10-26；錄用日期：2022-11-29

本文編輯：王瑩

引證本文：YANG JN， ZHANG HR.? Research advances in the mechanism of tumor microenvironment and targeted therapy for pancreatic neuroendocrine tumor［J］. J Clin Hepatol， 2023， 39（8）： 2005-2011.