中性粒細胞胞外誘捕網在冠心病進展中的作用及機制研究

覃思潤 盛喆 陳晨陽 詹耀坤 曹宇

[基金項目：國家自然科學基金資助項目（82000300）

通信作者：曹宇，E-mail：caoyu0811@csu.edu.cn]

【摘要】中性粒細胞是人體免疫系統的主要成分之一，在抵御感染和炎癥過程中扮演著重要角色。近年來，研究表明中性粒細胞除了其傳統的作用外，還能通過釋放胞外誘捕網的形式參與到冠心病等多種疾病的發生和發展中，越來越多的證據表明中性粒細胞胞外誘捕網在冠狀動脈粥樣硬化的進程中也起到關鍵性作用。因此，干預中性粒細胞胞外誘捕網的形成和釋放可能是治療冠狀動脈粥樣硬化及其并發癥的新策略。目前，針對中性粒細胞胞外誘捕網的干預已成為研究的熱點，未來，針對中性粒細胞胞外誘捕網的干預可能成為冠心病治療的新方向之一。現就中性粒細胞胞外誘捕網在冠心病發生發展中的作用機制及其應用前景進行綜述。

【關鍵詞】中性粒細胞胞外誘捕網；冠心病；動脈粥樣硬化；血栓形成

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2023.12.000

The Role and Mechanism of Neutrophil Extracellular Traps

in the Progression of Coronary Heart Disease

QIN Sirun，SHENG Zhe，CHEN Chenyang，ZHAN Yaokun，CAO Yu

（Department of Cardiovascular Medicine，The Third Xiangya Hospital，Central South University Changsha，Changsha 410013，Hunan，China）

【Abstract】Neutrophils are one of the main components of the body's immune system and play an important role in defending against infection and inflammation. In recent years， studies have shown that in addition to its traditional role， neutrophils can also participate in the occurrence and development of a variety of diseases， including coronary heart disease， through the release of extracellular traps， that is， more and more evidence that neutrophils extracellular traps also play a key role in the process of coronary atherosclerosis. Therefore， intervening in the formation and release of neutrophil extracellular traps may be a new strategy for the treatment of coronary atherosclerosis and its complications. At present， the intervention of neutrophil extracellular trap has become a research hotspot， and in the future， the intervention of neutrophil extracellular trap may become one of the new directions of coronary heart disease treatment. This article reviews the mechanism and application prospect of neutrophil extracellular trap in the occurrence and development of coronary heart disease.

【Key words】Neutrophil extracellular traps；Coronary artery heart disease；Atherosclerosis；Thrombosis

激活的中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）除經典的吞噬作用外，還可在細胞外釋放染色質、核蛋白和絲氨酸蛋白酶，形成一種名為中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）的網狀結構，并以此捕獲和殺死致病菌，最初被認為是人體抗感染的重要防御機制。隨后研究表明，NETs在人類自身免疫性疾病、癌癥、慢性阻塞性肺疾病、高血壓等病癥的發病機制中，同樣具有重要意義。NETs可促進內皮細胞功能障礙及凝血系統激活，成為炎癥、氧化應激、先天免疫、血栓形成的重要調節劑。冠狀動脈粥樣硬化是一種脂質驅動的動脈管壁長期漸進性炎性疾病，其持續進展可導致管腔狹窄，進而發生冠心病及急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）。現冠心病發生率逐漸上升，并呈年輕化趨勢，成為當今世界危害人體健康的第一大殺手。Borissoff等[1]研究發現，循環NETs生物標志物與冠狀動脈粥樣硬化斑塊大小呈正相關，且與冠心病的臨床嚴重程度和主要不良心臟事件的發生率密切相關。NETs可作為預測冠心病的嚴重程度、ACS發生風險、心肌梗死面積及血運重建后慢血流事件的生物標志物。既往大量研究將NETs與ACS事件聯系在一起，但目前研究證明NETs或許存在于冠狀動脈粥樣硬化進展的各個時期，在動脈粥樣硬化進展早期以NETs為靶點予以干預可發揮抗炎及抗凝作用，從而有效緩解疾病進展。

1? NETs在動脈粥樣硬化進展中的作用

多項研究證明NETs存在于人類和動物模型的動脈粥樣硬化病變的各個階段中，并與導致動脈粥樣硬化形成的各種機制有關。

內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化早期的表現[2]，單核細胞向受損內皮細胞黏附并轉移至內皮下且進一步分化成巨噬細胞吞噬脂質，演變成為泡沫細胞形成脂質條紋[3]。除單核細胞外，近年來，PMN在致動脈粥樣硬化進展中的作用受到學界關注。在早期階段，PMN主要是通過釋放危險信號分子如抗菌肽37，誘導內皮細胞表達細胞間黏附分子1和單核細胞趨化蛋白1募集大量巨噬細胞[4]；其次，PMN誘導巨噬細胞向M1型和泡沫細胞轉化，泡沫細胞可產生活性氧并誘導炎癥反應，促進動脈粥樣硬化進展；最近有研究[5]表明，在系統性紅斑狼瘡患者血管中，NETs包含的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9將內皮細胞包含的前MMP-2活化為MMP-2并與之結合，而后引起血管內皮細胞損傷（圖1）。

待病變進展至晚期，斑塊常顯示出強大的不穩定性及繼發的血栓形成傾向，其中不穩定斑塊又以薄的纖維帽、大的壞死核心及血管微鈣化、斑塊內微血管形成為特征[6-9]。Ionita等[10]等觀察到不穩定斑塊中存在大量的PMN浸潤。凋亡的PMN聚集并通過釋放MMP裂解促胞葬刺激性信號分子，從而抑制巨噬細胞耦聯的胞葬過程[11]，無法被及時清除的凋亡細胞堆積及繼發性壞死，加劇壞死核心的形成和生長；平滑肌細胞與PMN的相互作用誘導NETs形成，NETs中的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）產生的活性氧可提高膠原酶（MMP-2、MMP-9、MMP-14）活性，增強炎癥細胞的募集和細胞外基質的降解[12]；組蛋白H4則會降解平滑肌細胞從而導致纖維帽變薄，斑塊失穩。使用抗組蛋白H4抗體治療小鼠可有效抑制小鼠平滑肌細胞凋亡[13]。另外，研究表明，NETs可激活動脈粥樣硬化病變中的漿細胞樣樹突狀細胞的自身免疫，從而引起Ⅰ型干擾素（interferon-I，IFN-Ⅰ）大量合成釋放[14]，而IFN-Ⅰ的信號通路在破裂斑塊中上調，進而加劇病損部位平滑肌細胞凋亡及壞死核心的形成[15]。對小鼠模型使用氯脒藥物治療后可觀察到斑塊體積的減小和頸動脈血栓形成的延遲，然而在缺乏IFN-Ⅰ受體的小鼠模型中治療無效[16]，由此證明IFN-Ⅰ在介導動脈粥樣硬化的NETs反應中的重要作用（圖2）。

綜上所述，NETs主要通過加強機體動脈粥樣硬化的免疫及炎癥反應促進其進展。盡管學者們進行大量的臨床和實驗研究，證實NETs介導動脈粥樣硬化不同時期的發展機制，但現階段的研究仍存在一些尚待闡明的疑問，例如與凋亡細胞不同，不表現“食我信號”的NETs的被清除機制目前仍未可知[17]；中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）可降解膠原及纖維蛋白，使纖維帽變薄，并與不穩定斑塊具有相關性[6]。NE能否作為預測ACS事件的生物標志物仍需進一步研究；PMN導致冠狀動脈鈣化病變的潛在上游機制以及調控鈣化斑塊類型間相互轉化的分子機制尚待研究，仍需進一步探索加以明晰。

2? NETs與ACS

冠狀動脈粥樣硬化進展到一定程度，易損斑塊發生破裂或侵蝕繼發血栓形成是大多數ACS發病的主要病理學基礎。其中導致血栓形成最常見的三大機制分別為斑塊破裂、斑塊侵蝕和鈣化結節[18]。

ACS患者血清中增長的PMN數量和紊亂免疫調節為NETs的發生發展提供良好的生理條件。多項臨床研究證實，在ACS患者血管中提取的血栓及循環中均顯示較正常人群更高水平的NETs生物標志物[19]，提示NETs的形成與ACS事件的發生顯著關聯。一項針對ST段抬高型心肌梗死（ST-elevated myocardial，STEMI）患者的研究表明，血栓內較重負荷的NETs和脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）的活性與更大的梗死面積和抬高的ST段延遲回落有關[20]，用于評估微血管阻塞的心臟磁共振實時成像顯示，隨著血清雙鏈脫氧核糖核酸的增加，STEMI患者可能發生微血管阻塞，DNaseⅠ聯合重組組織型纖溶酶原激活物可通過阻斷NETs誘導的微血栓形成，在心肌缺血再灌注損傷誘導的心肌“無復流”中具有治療潛力[21]。Riegger等[22]則表明NETs存在于1/4的經皮冠狀動脈介入治療后支架內血栓形成樣本中，是支架內血栓形成的標志。現在越來越多文獻都表達一個觀點：PMN、血小板、NETs三者之間存在著與凝血相關的作用。研究表明，來自心肌梗死患者的NETs攜帶組織因子，一旦暴露在血液中便會觸發凝血級聯反應，導致凝血酶的產生，進一步激活血小板[23]；NETs的成分本身也可促進凝血因子的基因表達，如血管性假血友病因子和纖維蛋白原，后者可轉化為纖維蛋白，促進血栓前分子的積累；另外，NETs還可捕獲循環中的血小板、纖維蛋白鏈和血管性假血友病因子，構成血栓形成的支架，具有穩定血栓的作用[24]。目前冠心病的主要治療措施包括抗血小板和抗凝，但隨之而來的藥物不良反應包括各種出血事件的發生。當前新型抗血栓療法，如DNaseⅠ通過降解NETs加速血栓的溶解而不以增加患者的出血風險為代價，從而在抗血栓和出血事件間達到平衡，為冠心病二級預防及心肌梗死后治療提供新思路。

斑塊破裂是ACS發生的首要機制[18]。斑塊破裂后釋放大量膽固醇結晶，上調促炎細胞因子及趨化因子的表達，這一無菌性炎癥反應通過募集PMN誘導NETs形成，同時NETs攜帶的活性組織因子進一步表達，促進破裂斑塊處血栓的形成并通過PAR信號通路激活血小板導致血栓的擴大，進而影響病變進展[25]。區別于斑塊破裂，約31%的ACS患者是由斑塊侵蝕導致的，其病理特征為斑塊表面內皮細胞的剝脫，纖維帽呈完整狀態，管腔狹窄程度較輕。2018年研究急性心肌梗死患者罪犯和非罪犯斑塊中NETs的浸潤及分布情況，結果PMN和NETs大量存在于所有罪犯斑塊中，但在斑塊破裂、斑塊侵蝕和斑塊內出血三者之間無顯著差異性[26]，但隨著研究的深入發現，NETs其實與斑塊侵蝕更為相關，其機制被認為是PMN和NETs可通過Toll樣受體2機制誘導氧化應激和內皮細胞剝脫，并分泌白細胞介素-8來募集PMN，形成正反饋效應放大內皮損傷，導致隨后的血栓形成[22]。這提示NETs在斑塊侵蝕中可能發揮更重要的作用。目前臨床上不論病理機制，STEMI患者一律采用經皮冠狀動脈介入治療，然而2018年的EROSION研究[27]提出對于斑塊侵蝕所致的ACS患者，在狹窄程度較輕、血流較好的情況下，可采用規律強化的雙聯抗血小板治療穩定病情從而避免支架植入后的一系列并發癥，將NETs及其相關成分作為靶點開發相應的治療用于斑塊侵蝕的患者，或許可為其提供一種新穎的治療手段。

3? NETs與穩定性冠心病

研究[28]表明，NETs的相關組成成分可作為冠心病的生物標志物，在穩定性冠心病中可作為預測動脈粥樣硬化疾病嚴重程度和未來心血管事件風險的診斷工具。雙鏈脫氧核糖核酸、MPO-DNA復合物、瓜氨酸組蛋白H3、核小體或NE以及其他NETs成分在血漿中的存在并以其獨特的方式在冠心病中扮演著不同的角色。核小體的血漿水平被發現是嚴重冠狀動脈狹窄的獨立替代指標，MPO-DNA復合物的濃度與病變血管的數量正相關，并可預測主要不良心臟事件的發生。既往大多數研究著眼于動脈粥樣硬化晚期或ACS患者中NETs的表達，對于早期及穩定性冠心病患者中NETs的臨床研究尚缺乏。穩定性冠心病患者比ACS患者更容易檢測到分層斑塊，其代表頻繁發生的亞臨床血栓形成，Langseth等[29]在檢測穩定性冠心病患者循環中NETs生物標志物時發現，慢性NETs活動的存在可能與亞臨床血栓形成事件及穩定性冠心病的不良結局相關，筆者推測慢性NETs活動與斑塊反復的亞臨床破裂和修復相關，及分層斑塊可能觀測到更強的NETs活動，導致斑塊的快速進展[29]。

4? 冠心病中針對NETs的治療靶點

NETs的發現填補了PMN在免疫浸潤與心血管疾病上的空白，NETs也應被視為有吸引力的治療靶點。PMN特異性酶如MPO、肽基精氨酸脫亞氨基酶（peptidyl arginine deiminase type IV，PAD4）和NE在NETs的形成中起著關鍵作用。經證實缺失PMN特異性酶的小鼠將不能產生或僅產生不完全的NETs。目前，已開發出BMS-P5、GSK484、GSK199、CL-脒等PAD4抑制劑和PF-1355、PF-06282999、INV-315、AZD5904等MPO抑制劑，它們可能通過阻斷NETs形成，在NETs病理損傷性疾病的治療中具有潛在作用。但是，NETs抑制劑在冠狀動脈粥樣硬化進程中是否發揮治療作用，其相關副作用如何，仍有待于進一步大樣本研究證實（表1）。

冠心病的二級預防策略包括抗血小板、調脂、穩定斑塊，血小板活化對于血小板介導的NETs是必不可少的，如臨床上廣泛使用的阿司匹林可間接抑制NETs的形成，延緩動脈粥樣硬化進展。另外，抗凝劑肝素能像DNaseⅠ一樣有效地拆除NETs支架，證明抗血小板、抗凝藥物通過抑制NETs在冠心病中的治療機制。既往研究[35]證明口服凝血因子X（Coagulation Factor X，FX）抑制劑利伐沙班在穩定性冠心病的獲益，在穩定性冠心病患者中，與單抗相比，阿司匹林中加入利伐沙班2.5 mg每日兩次顯著降低動脈粥樣硬化主要結局、心血管死亡和全因死亡的風險。另一研究[36]發現，FX因子的Gla結構域在NETs形成期間介導FX因子與活化的PMN的結合中起重要作用，二者結合后形成NETs-FX復合物，較FX因子具有更強的促凝血功能。以上兩項研究表明，利伐沙班或許可通過阻斷FX因子與NETs形成的正反饋機制，且阻斷NETs-FX的強化凝血功能從而達到冠心病獲益（圖3），從而為其在穩定性冠心病中的運用提供依據。

注：①，FX因子通過活化中性粒細胞促進NETs形成過程；②，NETs能捕獲FX因子形成NETs-FX復合物，較FX因子具有更強的促凝血功能；③，利伐沙班通過抑制FX因子打斷凝血與NETs形成的正反饋效應，且阻斷NETs-FX的強化凝血功能。

圖3? 利伐沙班通過阻斷NETs與FX因子的正反饋機制在冠心病中發揮保護作用

5? 總結

綜上所述，NETs是PMN釋放的一種網狀殺菌結構，它在冠心病進展中扮演著重要的角色，其能引發內皮細胞功能障礙及促進凝血系統激活，在炎癥和氧化應激之間均能進行有效調節，而冠心病的發生與動脈管壁長期漸進性炎性疾病息息相關。NETs存在于冠狀動脈粥樣硬化進展各個時期，與動脈粥樣硬化的形成有重要關聯。冠狀動脈粥樣硬化進展到一定程度，易損斑塊發生破裂或侵蝕繼發血栓形成，是ACS發病的主要病理學基礎，在ACS患者血管中提取的血栓以及循環中均顯示較正常人群更高水平的NETs生物標志物。NETs相關組成成分可作為冠心病的生物標志物，在穩定性冠心病中可作為預測動脈粥樣硬化疾病嚴重程度和未來心血管事件風險的輔助診斷工具，慢性NETs活動與斑塊反復亞臨床破裂和修復相關，且分層斑塊能觀測到更強的NETs活動，導致斑塊快速進展。然而，NETs或是一把雙刃劍。它不僅可促進內皮細胞功能障礙和凝血系統激活，導致嚴重的心血管事件，還能誘導梗死區巨噬細胞向M2極化并促進心肌細胞的愈合。同時，PMN也是人體抵御病原體侵襲的第一道防線。對于正常人群，NETs被釋放出以發揮其捕捉和殺死病原體的免疫效能。因此，直接影響PMN功能的治療方法有可能會削弱機體的防御系統，謹慎使用NETs抑制劑，以避免削弱機體的防御系統。因此，NETs與冠心病進展密切相關，對其進行深入研究將有助于全面理解冠狀動脈粥樣硬化的發生機制和冠心病的防治。未來需要找到最佳治療策略，既不會削弱機體的免疫防御系統，又能有效地降低冠心病的風險，以造福于冠心病患者。

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收稿日期：2023-03-16