響應面法優化帝國世濤啤酒釀造工藝的研究

王 超，金德強，翟乃明，董小雷*

（齊魯工業大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點試驗室，山東 濟南 250353）

黑啤酒的歷史始于1795年，起源于德國[1]，當年阿瑟健力士于愛爾蘭的都柏林開設了一家釀酒廠，該種啤酒使用了大量的烘烤麥芽[2]，麥芽的抗氧化性強，因此其保質期往往比其他種類的啤酒要長，對于啤酒的銷售和貯存有積極的影響[3]。黑啤主要分為下面發酵啤酒（如德國黑啤、慕尼黑黑?。┖蜕厦姘l酵啤酒（如波特啤酒、世濤啤酒），其中世濤啤酒分為牛奶世濤、燕麥世濤、愛爾蘭世濤、巧克力世濤、帝國世濤及特種世濤[4]。

目前，中國雖然是啤酒生產大國，總產量已經穩居世界第一[5]，但對淡色啤酒的研究居多，而黑啤酒尤其是世濤啤酒的研究則非常少。世濤啤酒以其豐富的口味和其包容性在西方國家發展迅猛[6]，吸引著廣大啤酒愛好者的追捧，并且特種麥芽（巧克力麥芽、焦香麥芽、結晶麥芽、黑麥芽和燕麥）的比例大大提升，這使世濤啤酒具有更高的酒精度、濃烈的烘烤大麥焦糊味、更加豐富的層次感，以及無限拓展的空間，其中帝國世濤啤酒則最能體現世濤的風格特色[7]，并且其在酒精度及烘焙麥芽（增強抗氧化性）等方面也是比其他世濤啤酒要高，因此在銷售和貯存方面相對于其他世濤啤酒更具有優勢。

針對我國對于帝國世濤啤酒研究匱乏的現狀[8]，本研究利用特種麥芽，在單因素試驗的基礎上，利用響應面試驗對帝國世濤啤酒釀造工藝條件進行優化，確定最佳的釀造工藝條件，以期得到具有中國特色的帝國世濤啤酒釀造工藝，確保其在精釀啤酒的生產及大規模生產中的科學性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽（澳麥、巧克力麥芽、焦香麥芽、結晶麥芽、黑麥芽和燕麥，其色度分別為5 EBC、500EBC、100 EBC、150 EBC、1 200 EBC）：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；白砂糖：濟南長清家家悅超市；卡斯卡特酒花顆粒：張掖斯丹納酒花有限公司；上面發酵啤酒酵母US-05：齊魯工業大學中德啤酒中心保藏；鄰苯二胺（分析純）：天津市北聯精細化學品開發有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；乙醇（色譜純）：東莞市喬科化學有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；UV2350分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；WGZ-2PJ啤酒濁度儀、SD9012B EBC色度計：上海昕瑞儀器儀表有限公司；WYT-J手持糖度計：上海壘固儀器有限公司；ZM30L立式自控發酵罐：濟南正麥機械設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 帝國世濤啤酒的工藝流程及操作要點

操作要點：

原料配比：將5種麥芽按照此比例進行配比，澳麥51%、巧克力麥芽8%、焦香麥芽15%、結晶麥芽15%、黑麥芽6%、燕麥5%。

麥芽粉碎[9]：大麥芽加水濕粉碎，皮殼破而不碎；巧克力麥芽、焦香麥芽、結晶麥芽、黑麥芽粉碎，皮殼破而不碎；燕麥磨成細粉。

原料糖化[10]：采用單醪浸出糖化法，控制料水比1∶3（kg∶L），邊攪拌邊投料使料水充分混勻，投料完畢，醪液溫度為45℃，維持15 min；升溫至52℃，維持20 min；升溫至65℃，維持60 min。升溫至78℃，糖化完成。

麥汁過濾：麥汁轉移至過濾槽前，添加78℃水至過濾槽，水量剛好沒過篩板即可。麥汁入過濾槽，靜置20 min，回流，過濾，過濾速度由慢至快，保證獲得的麥汁清亮、干凈、無污染。過濾結束，洗糟兩次，洗糟水溫度控制在76～78℃。

麥汁煮沸[11]：將過濾、洗糟結束所得到的麥汁煮沸70 min。分三次添加0.45 g/L卡斯卡特啤酒花顆粒。初沸第10 min添加60%的啤酒花顆粒，煮沸第30 min添加20%啤酒顆粒，煮沸第60 min添加20%啤酒花顆粒。煮沸結束，將麥汁轉入回旋沉淀槽，靜置20 min，分離凝固物。

發酵及二次發酵[12]：添加上面發酵酵母US-05，為保證酵母充分利用麥汁中營養物質進行生長繁殖，酵母接種量控制在（1.0～1.5）×107個/mL[13]。將麥汁轉移至發酵罐，冷卻過程中對麥汁進行充氧，充氧量控制在8～10 mg/L，控制麥汁冷卻溫度在19.5～20.0℃范圍，以保證酵母能夠正常生長繁殖。發酵期間，當糖度為5.5°P時封罐，帝國世濤啤酒中的可發酵性糖無明顯下降時，在另一發酵罐加入白砂糖，把帝國世濤導入該發酵罐中，15℃二次發酵至糖度為2～3°P時結束。

后貯[14]：待雙乙酰含量＜0.15 mg/L，先以1.5℃/h降至5℃左右，保溫保壓24 h，再以1℃/L降至0.5℃左右，冷貯啤酒，進行啤酒風味物質分析檢測。注意降溫過程中觀察發酵罐壓力變化，使發酵罐壓力控制在0.14～0.16 MPa，壓力＜0.14 MPa時及時補充外源二氧化碳，確保啤酒強烈的殺口力。

1.3.2 單因素優化試驗

采用單因素變量控制法進行單因素試驗，考察原麥汁濃度（12 °P、14°P、16 °P、18°P、20 °P）、白砂糖添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、發酵溫度（14℃、16℃、18℃、20℃、22℃）對帝國世濤啤酒感官評分的影響。

1.3.3 釀造工藝條件的響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以感官評分（Y）為響應值，對發酵溫度（A）、原麥汁濃度（B）、白砂糖添加量（C）進行3因素3水平響應面試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 帝國世濤啤酒釀造工藝優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for brewing process optimization of Imperial Stout Beer

1.3.4 感官評價及理化檢測方法

（1）感官評價標準

邀請10名啤酒感官品評專家，分別從泡沫、香氣、口味3方面對試驗樣品進行感官評分，滿分為100分。感官評分標準見表2。

表2 帝國世濤啤酒的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of Imperial Stout Beer

（2）理化指標的檢測方法

雙乙酰、色度、濁度、苦味值及總酸的測定：參考GB/T 4927—2008《啤酒》中的方法[15]；酒精度的測定：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法；pH：采用pH計直接測量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗優化結果

2.1.1 發酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響

發酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響結果見圖1。

圖1 發酵溫度對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖1可知，隨著發酵溫度的升高，啤酒感官評分先增高后降低。發酵溫度為18～22℃時，啤酒感官評分＞80分，這可能是因為當發酵溫度較低時，上面酵母發酵速度緩慢，產生的香味淡薄；當發酵溫度為20℃時，感官評分達到最大值，給人以濃烈的烘烤大麥焦糊味、更加豐富和有層次感的口味。當發酵溫度為22℃時，酵母發酵速度快，代謝產生高級醇等含量高，對整體口感影響大。因此，選擇發酵溫度20℃為宜。

2.1.2 原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官品評的影響

原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官評分的影響見圖2。

圖2 原麥汁濃度對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.2 Effect of the original wort concentration on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖2可知，隨著原麥汁濃度的增加，啤酒感官評分呈先增加后減少的趨勢；當原麥汁濃度為15°P時，啤酒感官評分最高，為91分，其帶有適度的咖啡、深色可可、烘培味道，酒體厚重，給人黏稠、綿密的感受。繼續增加原麥汁濃度，啤酒感官評分開始下降；因為原麥汁濃度的變化直接導致麥汁組分發生改變，隨著原麥汁濃度的升高，酵母細胞活力及其發酵性能也會隨之發生相應的變化，影響酵母發酵產生的香味物質[16]，進而對感官品評產生影響。因此，選擇原麥汁濃度為15°P。

此外，還應大力開發度假類型的旅游產品。如今人們生活水平提高了，精神層面的需求更加旺盛，都市的繁忙和緊張的生活節奏使得人們對于古鎮緩慢、安逸的氣息充滿向往和渴求，同時隨著城市化進程的加快，新農村建設步步推進，古色古香的鄉村氛圍，自然清新的生態環境也越來越少，霍童古鎮自然環境優越，能夠滿足都市人群對于淳樸生活的追求。古鎮應增加建設度假型山莊、農家樂、鄉村木屋、帳篷酒店等住宿場所，滿足不同年齡階段不同消費水平游客的住宿需求，同時增加收益。

2.1.3 白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官品評的影響

白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官評分的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對帝國世濤啤酒感官評分的影響Fig.3 Effect of sugar addition on the sensory score of Imperial Stout Beer

由圖3可知，隨著白砂糖添加量的增加，啤酒感官評分呈先增加后減少的趨勢；當白砂糖添加量為5%時，啤酒感官評分最高。這可能是由于白砂糖對啤酒的醇厚度等會產生一定的影響，隨著白砂糖添加量的增加，啤酒的醇厚度等也會增加，當白砂糖添加量＞5%時，其在二次發酵過程中，啤酒醇厚度等重要指標會過度增加。因此，選擇白砂糖添加量為5%。

2.2 帝國世濤啤酒響應面試驗結果

試驗設計方案見表3，響應面試驗結果分析包括響應面二次模型的方差分析及響應面二次模型的擬合分析見表4。

表3 帝國世濤啤酒釀造工藝優化Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for brewing process optimization of Imperial Stout Beer

使用Design-Expert 7.0對試驗所得數據（表3）進行分析，得到二次回歸方程為：

表4 響應面二次模型的方差分析及擬合分析Table 4 Variance and fitting analysis of response surface quadratic model

由表4可知，3個因素的影響大小為：B（原麥汁濃度）＞C（白砂糖添加量）＞A（發酵溫度）；一次項B、C、二次項A2、C2對感官評分的結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A、交互項BC及AC的對結果影響顯著（P＜0.05），其他因素對結果影響不顯著；模型P=0.000 3＜0.01，說明該模型極顯著，失擬項P=0.950 6＞0.05，表明模型失擬不顯著[17]。

相關系數R2=0.9631，接近于1，表明二次多項式方程能充分擬合試驗數據，方程擬合度很好。校正相關系數R2adj=0.9157，說明響應值的變化有93.27%來源于所選變量，該試驗中變異系數（coefficientof variation，CV）為1.34%＜5%，說明該試驗的精確度和試驗重復性很高。校正相關系數R2adj=0.915 7和預測相關系數R2pred=0.902 2很接近，且信噪比為13.123，表明所建立的模型可用于優化帝國世濤啤酒發酵工藝條件的分析[18]。

采用Design-Expert 7.0軟件根據回歸方程繪制等高線和響應面圖[19]，如圖4所示。由圖4可知，發酵溫度和白砂糖添加量交互作用及原麥汁濃度和白砂糖添加量交互作用顯著，與表4中的交互相P值的分析結果一致。響應面的坡度較為陡峭，表明感官品評的響應值對發酵溫度、原麥汁濃度、白砂糖添加量的變化較為敏感[20]。在發酵溫度不變的條件下，隨著白砂糖添加量的增加，響應值先逐漸升高再逐漸降低；在白砂糖添加量不變的條件下，隨著發酵溫度的升高，響應值先逐漸升高再逐漸降低[21]。在原麥汁濃度不變的條件下，隨著白砂糖添加量的增加，響應值先逐漸升高再逐漸降低；在白砂糖添加量不變的條件下，隨著原麥汁濃度的升高，響應值逐漸升高。

圖4 發酵溫度、原麥汁濃度和白砂糖添加量交互作用對感官評分影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,original wort concentration and sugar addition on the sensory score

2.3 帝國世濤啤酒檢測分析結果

對優化后的帝國世濤啤酒進行理化指標進行檢測分析。結果表明，其理化指標為雙乙酰0.12 mg/L，色度458.5 EBC，濁度0.8 EBC，酒精度9.5%vol，苦味值55 BU，總酸2.79 mL/100 mL。其雙乙酰、色度、酒精度等均符合GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標準；所釀帝國世濤啤酒深褐色至深棕色，泡沫細膩，掛杯時間長；濃郁且多樣，有著程度變化的烘焙谷物香，麥芽香，水果酯香，酒花香和酒精香味；酒體厚重，有嚼勁，帶有柔軟、甜美的質感。參考啤酒感官品評[22]和GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標準可知，優化后的帝國世濤啤酒符合國家標準，具有消費者所喜愛的特殊風味，其理化指標和感官品評結果對其發展提供了堅實的理論基礎，可適用于精釀啤酒和工業化啤酒的生產。

3 結論

本研究采用單因素試驗和響應面法分析對帝國世濤啤酒釀造工藝條件進行了優化。結果表明，帝國世濤啤酒最佳釀造工藝條件為：原麥汁濃度16°P，發酵溫度21℃，白砂糖添加量5.1%。其感官評分為95分，理化指標為雙乙酰0.12 mg/L，色度458.5 EBC，濁度0.8EBC，酒精度9.5%vol，苦味值55BU，總酸2.79 mL/100 mL，符合GB/T 4927—2008《啤酒》中的國家標準，具有堅實的理論支持；為精釀啤酒以及工廠生產的可行性提供了堅實的理論和實踐基礎，對帝國世濤啤酒在我國的發展有重要的指導意義。

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