基于OSMAC與非靶向代謝組學的小鏈霉菌HCCB10043活性化合物挖掘

摘要：目的 基于OSMAC理念與非靶向代謝組學發現、鑒定小鏈霉菌產生的活性化合物。方法 通過改變培養基配方，結合抗菌活性檢測與UPLC-HRMS技術，借助MS-MS數據解析、化合物庫檢索等手段分析并初步鑒定小鏈霉菌HCCB10043發酵產生的諾卡胺類化合物與Collismycin類化合物，并通過基因序列比對找到其生物合成基因簇。結果 在小鏈霉菌HCCB10043的M1培養基發酵提取物中發現了四個諾卡胺類物質（A-D），其中化合物A為新化合物；在M7培養基發酵提取物中發現了三個Collismycin類物質（E-G）。結論 諾卡胺類與Collismycin類化合物均是首次在小鏈霉菌中發現的具有抗菌活性的次級代謝產物。該結果進一步擴展了小鏈霉菌的代謝產物組，為提高其主要活性產物—重要抗生素達托霉素前體—A21978C化合物的產量提供理論基礎；另一方面挖掘多樣化的微生物天然活性產物，為新藥研究提供化合物基礎。

關鍵詞：小鏈霉菌；UPLC-MS；代謝組學；OSMAC；諾卡胺；collismycin

中圖分類號：R978" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2023）02-0102-06

Mining Active Compounds of Streptomyces parvus HCCB10043 based on OSMAC Strategy and Non-targeted Metabonomics

Zhang Qiu-ping1，" "Rao Min1，2，" "Wei Wei1，2

（1 Zhejiang Medicine Co.， Ltd. Xinchang Pharmaceutical Factory，" " "Xinchang" "312500;2 Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceuticals Ramp;D，" "Shanghai" "200240）

Abstract： Objective Discovery and identification of the active compounds from S.parvus based on OSMAC strategy and non-targeted metabonomics. Methods By changing the medium， combining the antibacterial activity detection and UPLC-HRMS technology， with the help of MS-MS data analysis and database search， the nocardamine compounds and collismycin compounds from metabolites of S.parvus HCCB10043 were analyzed and identified.Their biosynthetic gene clusters were found by gene sequence alignment. Results Four kinds of nocardamine and its derivatives （A-D）， including compound A， a new one， were identified from the fermentation M1 extract of S.parvus. Three collismycin compounds （E-G） were identified from the fermentation M7 extract of S.parvus. Conclusion Seven antibacterial compounds were first discovered from S.parvus， which provided a theoretical basis for improving the yield of the main product A21978C-the precursor of daptomycin and enriched the quantity of active metabolites of Actinomyces to provide compound basis for new drug research.

Key words： S. parvus;" "UPLC-MS;" "metabolomics;" "OSMAC;" "nocardamine;" "collismycin

放線菌，特別是鏈霉菌產生的次級代謝產物一直是活性天然產物的重要來源，在新藥開發研究中發揮著重要作用[1-2]。傳統鏈霉菌天然活性產物挖掘主要是從固定的發酵液中提取和分離化合物，然而，這一策略開始變得效率低下。為了應對這一挑戰，研究人員開始尋找新的挖掘策略[3]。

高通量測序技術使放線菌基因組測序成為可能，大量基因組測序結果表明潛在編碼天然產物產生的基因簇數量與放線菌實際產生的特定代謝物總數之間存在差異[4]。因此，Bode等[5]提出了“單菌多化合物”（OSMAC，One Strain MAny Compounds）理論，即每個微生物菌株都有可能產生多種化合物，但在標準實驗室條件下，大部分微生物基因簇是沉默的，通過改變培養基組成、發酵pH值、溫度、鹽含量、通氣量甚至容器形狀等參數都會導致產生新的天然產物。Bode等[6]利用這種模擬自然環境變化的OSMAC策略，僅從六種微生物中分離出100多種化合物，其中有25多種不同的骨架。

本實驗室前期研究結果表明小鏈霉菌HCCB10043主要代謝產物為脂肽類物質A21978C、Arylomycin和寡肽類物質等[7-8]?；蚪M分析表明該菌株中存在許多未知化合物的生物合成途徑[9]。本文在課題組研究結果基礎之上，結合OSMAC策略和非靶向代謝組學技術，通過培養條件的改變，進一步挖掘其產生的活性代謝產物。

1 實驗材料

1.1 儀器設備

超凈工作臺（上海北亞醫用凈化空調設備廠），高壓滅菌鍋（日本HIRAYAMA），BL600電子天平（德國SARTORIUS），電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），控溫搖床（美國SCIENTIFIC INNOVA5000），臺式離心機TDL80-2B （上海安亭科學儀器廠），超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用儀（美國Waters公司）。

1.2 菌株

菌株HCCB10043分離自土壤，為小鏈霉菌（上海來益生物藥物研發中心保藏）?？咕钚詸z測菌株：藤黃八疊球菌、E.coli、金黃色葡萄球菌（均由上海來益生物藥物研發中心保藏）。

1.3 培養基

（1）固體培養基的成分（g/L）：可溶性淀粉 20，熟黃豆餅粉 10，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl" 2.0，CaCO3 3.0，瓊脂 20，pH 6.4。

（2）種子培養基的成分（g/L）：蛋白胨 10，葡萄糖 10，熟黃豆餅粉 15，酵母粉 5.0，pH 7.0～7.2。

（3） M0號發酵培養基（g/L）：黃豆餅粉DB2 22，糊精 36，葡萄糖 8.3，（NH4）2Fe（SO4）2 0.66，pH 7.0。

M1號發酵培養基（g/L）：棉籽餅粉 30，甘油 20，甘露醇 20，水解酪蛋白 5.0，KH2PO4 1.0，K2HPO4 1.5，NaCl 5.0，CaCO3 1.0，CoCl2 0.003，pH 6.8。

M2號發酵培養基（g/L）：葡萄糖 50，熟黃豆餅粉 20，蛋白胨 10，魚粉 5.0，KNO3 0.5，KH2PO4 0.3，CaCO3 2.0，pH 7.0。

M3號發酵培養基（g/L）：生黃豆餅粉 30，可溶性淀粉 30，MgSO4·7H2O 1.0，酵母浸粉 1.0，NaCl 3.0， CaCO3 2.0，FeSO4·7H2O 1.0，pH 7.0。

M4號發酵培養基（g/L）：熟黃豆餅粉 6.0，糊精32，葡萄糖 8.0，玉米淀粉 5.0，藥媒 16，β-環糊精 12、（NH4）2Fe（SO4）2 0.6，KNO3 2.0，pH 7.0。

M5號發酵培養基（g/L）：可溶性淀粉 10，糊精 20，熟黃豆餅粉 30，蛋白粉 5.0，K2HPO4 0.5， MgSO4·7H2O 0.5，CaCO3 0.2，pH 7.0。

M6號發酵培養基（g/L）：可溶性淀粉 20，棉籽粉 5.0，葡萄糖 5.0，酵母浸粉 5.0，CaCO3 2.0，玉米漿 5.0，pH 7.0。

M7號發酵培養基（g/L）：可溶性淀粉20，NaNO3 2.0，CaCO3 2.0，K2HPO4 1.0，KC l0.5， MgSO4·7H2O 0.5，pH 7.0。

（4）LB固體培養基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化鈉 10，瓊脂 20，pH 7.2。

2 方法

2.1 菌株的培養、發酵液的浸提和處理

將接種后的固體培養基平板置于28 ℃恒溫培養箱中培養4 d，取表面面積0.5 cm2左右的活化菌體孢子接種至含25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，在搖床28 ℃，240 r/min條件下培養 42 h。后以8%的接種量轉種于滅菌后的發酵培養基中，在搖床28 ℃，240 r/min條件下發酵4 d。取發酵液750 μL以等體積甲醇浸泡30 min后，12 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測試樣品。

2.2 發酵液體外抗菌活性檢測

采用紙敏片法測定發酵液的抑菌活性。3株檢驗菌株以0.5% （v/v，菌懸液CFU約為107/mL） 注入冷卻至50 ℃左右的LB固體培養基中混勻，每個平板倒入約30 mL菌體培養基混合物。將50 μL的發酵浸提液滴到一個半徑為0.5 cm的紙敏片上，待甲醇揮干后，將紙敏片貼到凝固后的檢測固體培養基上。37 ℃培養箱中倒置培養24 h后取出平板，觀察并測量抑菌圈的大小。

2.3 樣品的UPLC-MS分析

分析條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1×100 mm，1.7 μm），柱溫45 ℃，紫外210 nm及四級桿飛行時間串聯質譜儀進行檢測。毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓35 V，源內溫度100 ℃，干燥氣流溫度250 ℃，干燥器流速 400 L/h；碰撞能MS 6 eV、MS-MS 35 eV，質量掃描范圍 m/z 100-2000，掃描時間 1 s，掃描間隔時間 0.02 s。洗脫條件：流動相A 為0.1%甲酸水溶液；B為0.1%甲酸乙腈。0～2.0 min：5%B～15%B；2.0～6.0 min：15%B～30%B；6.0～12.0 min：30%B～99%B；12.0～15.0 min：99%B；15.0～16.0 min：99%B～5%B；16.0～19.0 min：5%B；流速為0.4 mL/min，樣品進樣量為5 μL。

3 結果

3.1 發酵液體外抗菌活性檢測

基于OSMAC理論，改變小鏈霉菌HCCB 10043傳統發酵配方M0，對7種新發酵配方下的發酵液進行統一處理與分析，發現不同發酵配方產生的代謝產物差異較大。對其發酵液活性進行體外抗菌活性檢測，并對抑菌圈直徑進行測量，結果見表1。

由表1可以看出，除培養基M2、M5、M6外，M1、M3、M4、M7和A21978C發酵培養基M0的發酵液一樣，均對藤黃八疊球菌與金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用。結合UPLC-MS分析結果，培養基M3、M4和A21978C發酵培養基M0的發酵產物主要為已知的具有抑菌活性的代謝產物A21978C、Arylomycins以及糖苷類化合物和寡肽物質。而培養基M1的發酵產物中沒有已知的活性代謝物質A21978C、Arylomycins等物質，故推測M1中產生了其他類型的具有抑菌活性的化合物；培養基M7中雖然發現了已知活性物質A21978C，但含量非常低，而發酵液的抑菌圈大小與M0的相近，故推測M7中亦產生了其他類型的具有抑菌活性的化合物。

3.2 小鏈霉菌HCCB10043中諾卡胺類物質的鑒定和基因簇確定

我們對培養基M1的發酵液和空白培養基UPLC-HRMS結果進一步分析發現在菌株HCCB10043發酵液中有四個分子量相近，且具有相同碎片201.124 6[M+H]+的化合物（圖1，A、B、C、D），質荷比分別為569.364 3[M+H]+（Rt 3.48 min）、585.360 4 [M+H]+（Rt 3.72 min）、601.357 9 [M+H]+（Rt 3.93 min）和654.272 6 [M+H]+（Rt 2.71 min）。通過Masslynx軟件確定四個物質的分子式分別為C27H48N6O7（實測值569.364 3，理論值569.366 3）、C27H48N6O8（實測值585.360 4，理論值585.361 2）、C27H48N6O9（實測值601.357 9，理論值601.356 1）和C27H45N6O9Fe（實測值654.272 6，理論值654.272 2）。以分子式結合MS/MS圖譜碎片信息（圖2），經數據庫檢索，化合物B、C、D分別是已知化合物Nocardamine N6-Deoxy、諾卡胺、Ferrioxamine E。

對化合物A、B、C的二級MS碎片信息進行詳細比對（圖2），發現三者具有相同的碎片201.124 6[M+H]+，而化合物A和B亦具有相同碎片267.129 7[M+H]+，且與化合物C中碎片283.127 6[M+H]+相差16。同時化合物A與已知物B、C還存在分子量連續相差16的碎片，369.234 4[M+H]+、385.234 4[M+H]+和401.233 2[M+H]+（圖2），故推測化合物A為諾卡胺類化合物的同系物，差異在于諾卡胺為含有三個N-OH的環肽，Nocardamine N6-Deoxy為含有兩個N-OH的環肽，而化合物A為含有一個N-OH的環肽。該化合物搜索后未見文獻報道，為諾卡胺類新的結構類似物，按照已知諾卡胺物質的命名原則，我們將其命名為Nocardamine N6-Deoxy，N28-Deoxy，結構式如圖2（e）。Nocardamine及Nocardamine N6-Deoxy對細菌轉肽酶B有一定的抑制作用[10]，說明培養基M1發酵液的抑菌活性來自菌株產生的諾卡胺類化合物。

通過在NCBI網站進行基因組比對分析，在小鏈霉菌HCCB10043的基因組中找到了與天藍色鏈霉菌M145中諾卡胺生物合成基因desA、desB、desC、desD[11]以及始旋鏈霉菌HCCB100218中諾卡胺生物合成基因lylA、lylB、lylC、lylD[12]同源性較高的四個基因lyrA（P376_4 046）、lyrB（P376_4 048）、lyrC（P376_4 049）、lyrD（P376_4 050），其與天藍色鏈霉菌中相應蛋白的同源性分別為 82.4%、77.9%、62.9%、72.0%，與始旋鏈霉菌中相應蛋白的同源性分別為79.1%、83.1%、68.0%、71.8%，且在染色體上的排列順序與兩者一致（圖3），推測這四個基因主要負責小鏈霉菌中諾卡胺類化合物的生物合成。結合本課題組前面的研究[12]，我們推測在小鏈霉菌中，諾卡胺的合成途徑與始旋鏈霉菌中的合成途徑相似，區別在于新化合物A是由1個N-5 -氨基戊基- N -（羥基）-琥珀酰胺酸和2個N-5 -氨基戊基- N -琥珀酰胺酸脫去3個水分子合成。而化合物C，即諾卡胺進一步絡合一個鐵離子，形成化合物D，一種嗜鐵素，Ferrioxamine E[13]。

3.3 小鏈霉菌HCCB10043中Collismycin類物質的鑒定

我們對培養基M7的發酵液和空白培養基UPLC-HRMS結果進一步分析發現在菌株HCCB10043發酵液中有三個質荷比分別為263.080 4 [M+H]+ （Rt 3.95 min）， 276.076 6 [M+H]+ （Rt 4.65 min）和244.050 6 [M+H]+ （Rt 6.76 min）的化合物（圖4，E、F、G）。通過Masslynx軟件確定四個物質的分子式分別為C13H14N2O2S（實測值263.0804，理論值263.0854）、C13H13N3O2S（實測值276.0766，理論值276.0807）和C12H9N3OS（實測值244.0506，理論值244.0545）。以分子式結合MS/MS圖譜碎片信息（圖5），經數據庫檢索，化合物E、F、G分別是已知化合物 SF2738C 、COLA 、SF2738F，屬于Collismycins （COLs） 類抗生素，化學式中均具有聯二吡啶結構，屬吡啶類生物堿[14]。培養基M7發酵液的抑菌活性應來自SF2738C 、COLA 和SF2738F。

通過在NCBI網站進行基因組比對分析，在小鏈霉菌HCCB10043的基因組中找到了與Streptomyces sp. CS40中Collismycin生物合成基因clmAL、clmP、clmL、clmS、clmN1、clmN2、clmD1、clmT[15]同源性較高的八個基因A1b（P376_0177）、A1a（P376_0178）、P1（P376_0179）、P2（P376_0180）、A2（P376_0181）、A3（P376_0182）、B1（P376_0183）和A4（P376_0184），其與Streptomyces sp. CS40中相應蛋白的同源性分別為96.3%、86.2%、79.5%、97.2%、74.0%、95.7%、97.7%、95.5%，且在染色體上的排列順序一致（圖6），推測這八個基因主要負責小鏈霉菌中Collismycin類化合物的生物合成。小鏈霉菌中E、F、G三個化合物的合成途徑與Streptomyces sp. CS40生物合成SF2738C 、COLA 和SF2738F相同[15]。

4 討論

諾卡胺類化合物除具有抑菌活性外，由于其優良的金屬離子絡合能力及低細胞毒性，可用作鐵和鋁等的金屬解毒劑 [16]。諾卡胺亦能增強SOD酶的活性，從而減輕自由基對腦組織的損傷，故可應用于制備抗老年癡呆藥物[17]。而化合物Ferrioxamine E則是改進病原菌檢測的重要工具，在預增菌肉湯和增菌肉湯培養基中加入Ferrioxamine E 可顯著提高污染食品中沙門菌的檢測靈敏度等[18]，因此，諾卡胺類化合物具有良好的臨床應用前景和開發價值。

化合物E、F、G結構中含有的氮原子主要以吡啶的結構單元形式存在，為吡啶生物堿，屬于Collismycins類抗生素。除抑菌作用外，Collismycins及其衍生物作為氧化應激抑制劑，可用作細胞氧化應激所引起疾病的備用治療藥物，尤其能夠針對神經變性疾病發揮作用，例如阿爾茨海默病和帕金森病[19]。

本文基于OSMAC理念，結合UPLC-HRMS/MS技術分析鑒定出小鏈霉菌中三個諾卡胺類物質諾卡胺、Nocardamine N6-Deoxy、Ferrioxamine E、三個Collismycin類物質 SF2738C 、COLA 、SF2738F和一個諾卡胺類新物質Nocardamine N6-Deoxy，N28-Deoxy，并通過基因序列比對，找到了這兩類化合物的生物合成基因簇，簡要分析其在小鏈霉菌HCCB10043的合成途徑。這一結果將為諾卡胺類和吡啶生物堿類的抗生素提供新的資源，同時為提高重要抗生素達托霉素前體A21978C的產量提供新的思路和途徑。

參 考 文 獻

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