鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌活性探究

摘要：目的 觀察鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌感染的抑菌效果。方法 以霧化吸入耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（CRAB）的120只成年BALB/c雄鼠為研究對象，獲得CRAB感染動物模型，將其隨機分為實驗組和對照組，每組各60例。對照組使用頭孢哌酮舒巴坦鈉灌胃治療，實驗組則在對照組治療的基礎上使用等量的鹽酸小檗堿灌胃治療，7 d為一周期，共治療3個周期。比較用藥后兩組死亡率以及用藥前后血清炎癥標志物的變化。結果 對照組死亡率顯著高于試驗組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。治療前，兩組白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平對比差異不具有統計學意義（P＞0.05）；治療后，兩組IL-6、TNF-α明顯下降，且組間差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌效果優于單獨使用頭孢哌酮舒巴坦。

關鍵詞：碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌；鹽酸小檗堿；頭孢哌酮舒巴坦

鮑曼不動桿菌是一種條件致病菌，在環境中廣泛分布，尤其在醫院環境中分布更密集。該菌容易在患者多個部位定植，如消化道、呼吸道等部位，可引發醫院獲得性感染，耐藥性極強[1]。由于抗生素的廣泛使用，以及近年來檢測水平大幅提高，鮑曼不動桿菌檢出率也在不斷增加。臨床研究數據表明，鮑曼不動桿菌檢出率僅次于大腸埃希菌，高達8.8%，其中反復的藥物篩選使得這種細菌具有多重耐藥性，如對亞胺培南、美羅培南和耐碳青霉烯等耐藥，被認為是一種“超級細菌”，嚴重影響抗感染治療效果，甚至導致患者死亡[2]。在眾多抗生素中，其對頭孢哌酮舒巴坦耐藥性較低，為36.7%[3]。

對于耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌感染，目前使用的藥物多為替加環素、多粘菌素，但這兩種藥物的副作用明顯，在臨床上的應用受到了極大的限制。《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》建議采用聯合用藥來治療多重耐藥不動桿菌，且劑量大，療程長。已有多項國內外研究證實，部分中藥成分具有抗菌能力[4]。小檗堿又名黃連素，是一種從黃連中提取的芐基異喹啉生物堿，被用于治療腸道感染。本研究旨在觀察鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌感染的抑菌效果。

1材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸小檗堿片，規格：25mg/片；注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉，劑型：粉針劑，規格：1.5g（1.0g/0.5g）。白細胞介素6（IL-6）以及腫瘤壞死因子α（TNF-α） ELISA試劑盒。

1.2 動物模型制備

實驗用動物為BALB/c雄性小鼠（6～8周齡；體重18～20 g），由南京模式動物研究所提供，將小鼠飼養3 d適應環境后經腹腔注射舒泰1 mg/只進行麻醉。麻醉后，將小鼠放入密閉塑料盒中（為使氣道充分打開，將小鼠盡量墊高）。配置鮑曼不動桿菌菌液，濃度為108 CFU/ml，搖勻后置于超聲霧化器中，連接好霧化管路（注意連接活性炭以收集殘余氣體），霧化速度為2 ml/min，霧化時間30 min。隨后豎立小鼠，左右旋轉體位。所有操作在生物安全柜中進行。于感染48 h后進行給藥治療，小鼠飼養在無特殊病原體（SPF級）動物房內，室溫22～24℃、濕度保持在50%～70%，12 h明暗交替，自由攝食。

1.3 方法

對照組給予頭孢哌酮舒巴坦1 mg/只，用0.9%氯化鈉注射液1 ml稀釋后灌胃治療，間隔12 h給藥1次。連續治療3周。實驗組聯合使用頭孢哌酮舒巴坦1 mg/只以及1 mg/只鹽酸小檗堿，用0.9%氯化鈉注射液1 ml稀釋后靜脈滴注治療，間隔12 h給藥1次。連續治療3周。

1.4 外周血象檢測

治療前后對兩組小鼠進行采血，眼眶靜脈叢采血，將血液樣本置于室溫2 h，隨后1 000×g離心20 min，吸取血清用于下一步細胞因子檢測。

1.5 觀察指標

治療3周后，比較從治療開始到結束兩組的死亡率。治療前后采用酶聯免疫雙抗體夾心法檢測IL-6、TNF-α水平的變化。試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司，操作過程嚴格依據試劑盒內的說明書實施。主要步驟包括：全部標本通過1：100的比例稀釋后依次向微孔板中加入，之后再將抗體于室溫條件下進行40 min孵育（分別向其中滴加IL-6，濃度為10 pg/ml、50 pg/ml、100 pg/ml 、200 pg/ml標準品、陰性和陽性對照，TNF-α濃度為200 μg/L、100 μg/L、50 μg/L、25 μg/L標準品、陰性和陽性對照），隨后進行5次洗板；在避光情況下滴加單抗（酶標記），室溫條件下進行40 min的孵育，再5次洗板；加入底物給予15 min的反應后終止，于全自動酶標儀的分析儀（購自美國賽默飛世爾公司）上對其吸光值（A）進行檢測。血清IL-6、TNF-α檢測的批內和批間變異系數均小于5%，提示此次實驗操作具有很好的精確度和重復性。

1.6 統計學分析

數據處理采用SPSS25.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，采用ｔ檢驗，計數資料用比率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 兩組治療后死亡率比較

實驗組小鼠死亡率明顯低于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組IL-6、TNF-α比較

治療前，兩組IL-6、TNF-α水平編輯差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后，兩組IL-6、TNF-α均明顯下降，且實驗組下降程度顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

3討論

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的大量使用及各種侵入性醫療技術的發展，鮑曼不動桿菌在醫院細菌感染中所占的比例逐漸上升，已成為醫院感染的主要條件致病菌，同時由于其對各類抗菌藥物的耐藥率的升高，給臨床治療帶來較大困難[5～6]。此外，鮑曼不動桿菌屬于非發酵菌屬，為條件致病菌，是人體正常菌群的組成部分，廣泛存在于自然環境、醫院環境中，同時還具有強大的克隆傳播、獲得耐藥性能力，故而廣泛耐藥、多重耐藥以及全耐藥的鮑曼不動桿菌呈世界性流行[7～8]。目前研究發現，鮑曼不動桿菌主要引起呼吸道感染，也可引起泌尿系感染、敗血癥等。曠南岳等[9]研究亦發現，鮑曼不動桿菌感染與院內感染死亡風險呈正相關。因此通過分析鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌感染的抑菌效果，對于治療鮑曼不動桿菌感染意義重大[103]。

頭孢哌酮舒巴坦具有抗菌作用強、抗菌譜廣的特點，作為復合制劑[11]，其中的頭孢哌酮可抑制細菌細胞壁，舒巴坦可抑制β-內酰胺酶，而且不可逆，兩者復合后可使抵抗多種β-內酰胺酶降解的能力得到增強，協同抗菌活性[12]。應用頭孢哌酮舒巴坦鈉治療碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌感染有一定的效果。但是由于鮑曼不動桿菌對其具有一定的耐藥性，長期使用可能使其耐藥性增強，導致治療效果減弱。鮑曼不動桿菌感染會導致人體內的重要炎癥因子（如IL-6、TNF-α）普遍升高，其原因可能是病原菌入侵機體產生的內毒素可激活炎性細胞（單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等），導致免疫功能異常，進而引起異常炎性反應，如白細胞釋放大量的氧自由基，刺激氧化應激反應。因此，炎性因子變化情況與疾病的發生發展密切關聯[13]。本研究結果顯示，對照組死亡率顯著高于試驗組，P＜0.05。治療前，兩組白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平差異不具有統計學意義，P＞0.05；治療后，兩組IL-6、TNF-α明顯下降，且組間差異具有統計學意義，P＜0.05。說明鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌效果顯著。IL-6、TNF-α為常見的促炎因子，其水平高低可反映疾病嚴重情況。小檗堿又稱黃連素，是一種異喹啉類生物堿，存在于小檗屬、黃連屬植物根莖中，具有調理肝臟、清熱解毒等作用，不良反應小。

綜上所述，鹽酸小檗堿聯合頭孢哌酮舒巴坦對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌的抑菌效果優于單獨使用頭孢哌酮舒巴坦。本研究不足之處在于樣本量較少且單一，得到的結果可能有一定的偏倚，今后進一步研究應增加樣本量、樣本種屬以及臨床實驗。

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