小麥氮利用效率相關基因TaARE1的生物信息學分析及等位變異

摘要：為進一步解析小麥氮素利用效率基因TaARE1的生物學功能，以14個小麥品種為試驗材料，通過同源克隆、生物信息學分析以及PCR擴增、測序等方法分析該基因的序列特征、基因啟動子區域的順式作用元件以及該基因在13個小麥品種中的多態性情況。結果表明，本研究從普通小麥中克隆了3個同源基因TaARE1-A、TaARE1-B和TaARE1-D。這3個基因均包含7個外顯子和6個內含子，CDS 全長均為1 266 bp，編碼421個氨基酸；TaARE1蛋白分子量為48.8 ku，理論等電點pI為5.02；它具跨膜結構，無信號肽，為親水性蛋白；其蛋白二級結構由4種形式構成，包括α-螺旋（52.73%）、延伸鏈（17.10%）、β轉角（4.28%）、無規則卷曲（25.89%）。TaARE1的啟動子區富含3-AF1 binding site、LAMP-element、GATA-motif等8種與光響應有關的順式作用元件。通過對小麥TaARE1基因的多態性篩選，分別在其啟動子上游-261、-421、-819、-887、-969、-1 530 bp位置發現了6個SNP，這些位點可能與小麥產量相關聯。本研究可為揭示與TaARE1功能有關的調控機制提供有用的信息，并為進一步開發與氮素利用效率有關的功能標記以及分子標記輔助育種奠定基礎。

關鍵詞：小麥；氮素利用效率；TaARE1基因；生物信息學；等位變異

中圖分類號：S512.101 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0034-07

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上最重要的糧食作物之一，它為人類提供20%的蛋白質和能量［1］。因此，提高小麥產量，確保糧食安全一直是科研工作者追求的重要目標之一。氮作為一種大量元素在小麥生長發育過程中發揮了至關重要的作用。研究表明，提高小麥的氮素利用效率（nitrogen use efficiency，NUE）在很大程度上有助于提高小麥產量。近年來，許多學者圍繞如何通過提高小麥的氮利用效率獲得高產方面做了大量的研究［2-6］。唐繼偉等研究表明，有機肥氮用量≥300 kg/hm2 或化肥氮用量≥180 kg/hm2時，可確保高產優質［2］。馮悅晨等通過測土配方施肥加上地膜覆蓋，不僅提高了小麥產量，而且可減少氮肥施用量［3］。鄧麗娟等通過優化施氮量和基追比的綜合氮管理措施，不僅能協同實現小麥高產和優質的目標，還能降低環境排放量［4］。吳金芝等在小麥收后2周左右隔年深松土地，既提高了土壤含水量，又提高了小麥產量、水分利用效率和種植效益［5］。

另外，植物氮素利用過程主要涉及其吸收、運輸、同化和再利用等方面，銨態氮和硝態氮作為植物可利用的主要氮源在此過程中發揮了重要作用。NUE是一個復雜性狀，受多基因控制，許多學者紛紛對其相關的基因進行了克隆，并對其功能進行了研究。例如，與植物吸收、轉運密切相關的硝酸鹽轉運蛋白基因NRT1（nitrate transporter1/peptide transporter 1）在擬南芥、水稻和小麥等作物中均被做了大量的研究［6］。擬南芥中已鑒定出11個參與硝酸鹽吸收和轉運的NRT1.1蛋白基因［7-14］。水稻硝酸鹽轉運蛋白NRT1.1B一個氨基酸的變異導致秈稻型具有更高的硝酸鹽吸收及轉運活性，而攜帶秈稻等位基因的粳稻材料的NUE和產量也得到了顯著提高［15-17］。2022年，小麥中也成功克隆了硝酸鹽轉運蛋白基因TaNRT1.1及其同源子，研究結果表明，TaNRT1.1-1A基因和TaNRT1.1-1B基因可能在硝酸鹽的吸收過程中發揮了重要作用，TaNRT1.1-1D基因可能在硝酸鹽轉運方面發揮了重要作用。TaNRT1.1-1A基因啟動子上游 -1 120 bp 位置1個8 bp（TGCATGCA）的插入位點，可能與小麥氮利用效率密切相關［18］。另外一個與氮同化有關、可調控氮肥利用率的OsARE基因也做了大量的研究，該基因突變可延緩植物衰老，增強其耐受氮饑餓的特征。OsARE基因啟動子區域小片段的插入，可降低基因的表達水平，最終導致其產量的降低［19］。水稻Ghd7（grain number，plant height，and heading date 7）基因可通過抑制ARE1基因，增強氮素利用和籽粒產量［20］。除此之外，大麥HvARE1基因在低氮條件下主要在植物光合組織中表達。通過CRISPR/Cas9誘導HvARE1獲得其沉默突變體的研究結果表明，在低氮條件下，ARE1突變體的產量、葉綠素含量及其植株的地上部氮含量均有所提高［21］。由此可見，通過降低或者抑制ARE1基因表達，可提高籽粒的產量。

近期，Guo等在小麥中也成功鑒定了TaARE1基因，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，獲得了TaARE1基因不同變異的系列小麥are1材料。研究結果表明TaARE1基因的敲除有助于提高小麥產量［22］。然而對于TaARE1基因啟動子區域是如何影響小麥產量的，并沒有做任何研究。本研究擬通過克隆小麥TaARE1基因及其啟動子區，并通過生物信息學分析、多態性篩選等對其進行研究，以期為進一步詮釋與TaARE1基因功能有關的調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國春小麥品種用于TaARE1基因克隆和序列驗證。云麥29、定縣72、豫麥2號優系、內鄉991、鄭豐5號、周麥22號、許科1018、國展6號、豐德存麥1號、百農418、開麥20、泛麥803、安選5號等13個小麥品種則用于小麥TaARE1基因的多態性篩選，以上材料均由河南省農業科學院小麥研究所小麥營養與品質研究室保存和繁育。

十二烷基肌氨酸鈉（SLS）、Taq buffer緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶、溴化乙錠、Trizol購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、DH5α感受態菌株、pMD18-T克隆載體、反轉錄試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LB固體培養基/液體培養基、氨芐青霉素等購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 田間種植、農藝性狀調查

14個小麥品種分別于2019—2020年、2020—2021年種植于河南省農業科學院現代農業科技試驗示范基地。所有材料均采用點播種植，重復2次，按常規方式進行田間管理，每個品種種植2行，行長 2 m，株距10 cm。小麥成熟后，每個品種隨機取10個單株進行籽粒性狀的測量。粒長、粒寬、千粒質量等籽粒性狀測量參照Su等的方法［23］進行。

1.3 DNA提取、PCR擴增及測序

利用SLS法提取小麥種子DNA［24］。1.0%（質量濃度）的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA質量檢測。25 μL 的PCR反應體系主要包括：0.5 μL 上下游引物（10 pmol/μL）、100 ng基因組DNA、2.5 μL 10×Taq buffer （Mg2+plus）、 0.5 μL dNTP （2.5 mmol/L）、1.25 U Taq DNA聚合酶。反應程序和PCR產物的分離和檢測均參照文獻［24］進行。目的片段回收、連接、轉化至DH5α感受態細胞內。菌落PCR檢測、篩選陽性克隆，并測序。利用軟件Chromos 2.4.3對測序結果進行可靠性檢驗和分析。

1.4 引物設計

根據水稻OsARE1基因（LOC_Os08g12780）序列，通過Ensemble Plants進行同源BLAST，獲得小麥氮素利用效率基因TaARE1 （TaARE1-A、TaARE1-B、TaARE1-D）。隨后，通過中國春參考基因組2.0和已克隆的TaARE1 3個同源基因，獲得這3個同源基因的啟動子序列。根據假定的TaARE1基因組序列設計25對特異性引物（表1），用于擴增其基因組DNA全長序列。

1.5 小麥TaARE1生物信息學分析

用軟件SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測TaARE1蛋白的信號肽及結構域；用ProParam （http：//web.expasy.org/protparam/）分析TaARE1編碼氨基酸的數目、蛋白相對分子量、等電點等；用在線軟件TMHMM 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測TaARE1蛋白的跨膜區；用軟件SPOMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_opma.html）預測蛋白[CM（21]質二級結構；用在線軟件I-TASSER （https：//seq2fun.dcmb.med.umich.edu//I-TASSER/）預測蛋白質三級結構；用軟件Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測TaARE1基因啟動子順式作用元件。

1.6 TaARE1基因的多態性篩選

根據已克隆的TaARE1基因序列，利用已設計的25對特異性引物（表1）對不同小麥品種的基因組DNA序列全長進行PCR擴增、測序。

1.7 數據分析

利用Excel軟件對每個小麥品種的千粒質量、粒長、粒寬的平均值分別進行統計分析。利用統計軟件SPSS 26.0對2年數據進行差異顯著性分析和方差分析，并利用LSD（least significant difference）最小顯著差異法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 小麥TaARE1基因克隆

根據水稻OsARE1基因序列（LOC_Os08g12780），通過中國春參考基因組2.0和EnsemblPlants進行同源BLAST，成功克隆水稻OsARE1基因在小麥中的3個同源基因TraesCS7A02G286400（TaARE1-A）、[JP4]TraesCS7B02G196800（TaARE1-B）、TraesCS7D02G283700（TaARE1-D），其基因組DNA序列全長分別為 8 017、7 656、10 527 bp。序列分析發現，這3個基因均由7個外顯子和6個內含子組成（圖1），其CDS長度均為1 266 bp，編碼421個氨基酸。根據中國春參考基因組2.0和已克隆的TaARE1基因，成功獲得該基因啟動子上游長度約2 000 bp的序列。

2.2 小麥TaARE1蛋白二級結構預測

通過SMART在線軟件預測表明，小麥TaARE1蛋白包含2個結構域：一個為low complexity結構域，位于第131～149個氨基酸之間，另一個為Pfam：CemA結構域，位于第190～420個氨基酸之間 （圖2-A）。生物信息學分析結果表明，TaARE1蛋白分子量為48.8 ku，理論等電點pI為5.02，為親水蛋白。蛋白二級結構由4種形式構成（圖2-B），包括α-螺旋（52.73%）、延伸鏈（17.10%）、β轉角（4.28%）、無規則卷曲（25.89%）。該蛋白有跨膜結構區，為膜蛋白，無信號肽（圖2-C）。利用軟件 SWISS-MODEL 進一步做空間結構預測，結果表明TaARE1含有豐富的α螺旋和無規則卷曲，與二級結構預測結果一致（圖2-D）。

2.3 小麥TaARE1基因啟動子順式作用元件預測

為了進一步研究小麥TaARE1基因的調控機制，利用Plantcare在線軟件預測了小麥TaARE1基因啟動子上游-2 000 bp區域的順式作用元件。結果（表2）發現該基因啟動子區域內富含3-AF1 binding site、LAMP-element、GATA-motif、GTGGC-motif、SP1、Box4、G-box以及TCCC-motif等8種光響應元件。另外，該基因啟動子區域還包含CGTCA-motif茉莉酸甲酯響應元件、LTR低溫響應元件、ARE厭氧誘導調控元件、水楊酸響應元件（TCA-element和SARE）、ABRE脫落酸響應元件GC-motif缺氧特異性誘導增強等多種逆境響應元件以及CAT-box分生組織響應元件和Circadian晝夜節律調控元件等與生長發育有關的順式作用元件。

2.4 小麥TaARE1等位變異的發現

研究證實，TaARE1基因可提高小麥產量。因此，挑選13個千粒質量差異明顯的小麥品種，利用TaARE1-P1～TaARE1-P25共25對特異性引物對其TaARE1-A、TaARE1-B和TaARE1-D 3個基因組DNA序列及啟動子序列進行PCR擴增、測序，測序結果顯示在TaARE1-A基因啟動子上游共發現了6個SNP的等位變異，它們分別位于其 -261 bp（C到T）、-421 bp（G到A）、-819 bp（A到G）、-887 bp（G到A）、-969 bp（G到A）和 -1 530 bp（A到G）的位置 （圖3），測序結果證實了這些位點的可靠性。而TaARE1-A的基因組DNA序列、TaARE1-B和TaARE1-D基因組DNA序列及啟動子序列中未發現其多態性。結合TaARE1基因啟動子[JP+2]順式作用元件預測結果發現，-261 bp（C到T）位點位于SP1、Box4和GTGGC-motif等光響應元件附近；-421 bp（G到A）位點位于3-AF1 binding site、LAMP-element、GATA-motif和G-box等光響應元件附近；-819 bp（A到G）和 -887 bp （G到A）位點主要位于CGTCA-motif、SARE和GC-motif等非生物脅迫相關的逆境元件附近；-1 530 bp（A到G）位點則位于Box4、G-box以及TCCC-motif等光響應元件附近。按照Mcintosh等對基因的命名方法［25］，將TaARE1-A基因啟動子上游-261、-421、-819、-887、-969、-1 530 bp位點分別為C、G、A、G、G、A的變異命名為TaARE1-A-a，將TaARE1-A基因啟動子上游-261、-421、-819、-887、-969 bp、-1 530 bp位點分別為T、A、G、A、A、G的變異命名為TaARE1-A-b（圖3）。結合表型分析發現，TaARE1-A-a基因型主要存在于高千粒質量的小麥品種當中，而TaARE1-A-b基因型主要存在于低千粒質量的小麥品種當中（表3）。因此推測該基因可能與小麥產量相關聯。

3 討論與結論

在有限氮的情況下，通過提高氮肥利用率，延緩植物衰老，對小麥生產的可持續發展至關重要。Wang等研究證實OsARE1基因突變可導致水稻顯著延遲衰老、增強氮肥利用效率和增加籽粒產量［19］。Zhang等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，定點敲除小麥品種鄭麥7698的TaARE1基因，不同突變體均表現出了不同程度的延遲衰老，并且在氮有限的條件下，提高了氮素利用效率，增加了小麥產量［26］。Karunarathne 等也利用了同樣的方法在大麥中成功驗證了HvARE1的功能［21］。綜上所述，ARE1在植物界是一個高度保守的基因，其具有延遲植物衰老、提高產量的作用。

在此基礎上，本研究首先利用同源克隆的方法獲得了水稻氮利用效率基因OsARE1在小麥中的3個同源基因TaARE1-A、TaARE1-B和TaARE1-D，并通過生物信息學分析發現， 這3個同源基因所編碼的蛋白均為親水蛋白，2級結構含有豐富的 α-螺旋和無規則卷曲，為膜蛋白。其次，在小麥TaARE1基因啟動子上游預測到了3-AF1 binding site、LAMP-element、GATA-motif、GTGGC-motif、SP1、Box 4、G-box、TCCC-motif等8種與光響應有關的元件。已有研究表明，外界環境如光照對植物體氮代謝過程影響較大，而小麥TaARE1基因編碼的蛋白主要定位于葉綠體中，推測小麥TaARE1基因及其同源子可能在植物光合作用過程中發揮了重要作用［26-27］。此外，在其啟動子區域還預測到了茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、低溫響應元件LTR、厭氧誘導調控元件ARE、水楊酸響應元件（TCA-element和SARE）、脫落酸響應元件ABRE和缺氧特異性誘導增強元件GC-motif等與逆境相關的調控元件以及分生組織響應元件CAT-box和晝夜節律調控元件Circadian等一些與植物生長發育有關的順式作用元件，推測該基因在植物生長發育過程（尤其是參與植物光合作用過程）以及在抵御非生物脅迫過程中均發揮了重要作用。無論如何，需要更深入地研究證實小麥氮素利用效率相關基因TaARE1及其同源子在植物體內所具有的作用。

另有研究證實，水稻OsARE1基因啟動子區域小片段的插入，可降低其基因的表達水平，最終導致其產量的降低［19］。在本研究中，筆者在TaARE1-A啟動子區域發現了新的6個SNP位點，研究結果表明，TaARE1-A基因的這些等位變異位點可能與小麥產量相關聯。小麥TaGS5基因啟動子上游 -1 925 bp 的位置發現了一個G堿基的插入，該位點位于SP1光響應元件內，研究結果表明，該G堿基的插入與TaGS5基因的高表達、千粒質量的增加密切相關，同時對其他農藝性狀也產生影響。而本研究發現的這些等位變異位點主要位于TaARE1-A基因啟動子的SP1、Box4、GTGGC-motif、G-box和TCCC-motif等光響應元件附近。因此，在深入分析TaARE1基因功能時，將光響應元件作為一個順式作用元件所發揮的作用是非常有用的。然而，本研究中用于篩選TaARE1基因多態性的材料較少，可能還需要更多的研究材料進一步證實TaARE1基因啟動子上游6個SNP位點對該基因以及小麥產量的影響。

該研究揭示了與TaARE1功能有關的調控機制，以期為進一步開發其功能標記及分子標記輔助育種奠定基礎。

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收稿日期：2023-04-28

基金項目：河南省科技研發計劃聯合基金（編號：222103810015）；國家重點研發計劃（編號：2022YFD2300802、2021YFD1700900）；河南省自然科學基金（202300410023）；河南省科技攻關計劃（編號：222102110449）。

作者簡介：王沙沙（1981—），女，河南焦作人，博士，助理研究員，從事小麥分子育種研究。E-mail：shasha0391@126.com。

通信作者：宋 曉，博士，副研究員，從事小麥栽培和土壤養分演變研究。E-mail：songxiao401@126.com。