毛果楊PtIPT5基因的克隆及低溫脅迫表達(dá)分析

摘要：為探究異戊稀基轉(zhuǎn)移酶基因（IPT）的抗逆機(jī)理，通過PCR技術(shù)從毛果楊葉片中克隆了IPT基因，命名為PtIPT5，對該基因及其蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并使用實(shí)時熒光定量技術(shù)（qRT-PCR）分析其在毛果楊組培苗不同組織及不同程度低溫處理下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，PtIPT5基因編碼區(qū)（coding sequence，CDS）長度為984 bp，可編碼327個氨基酸殘基；PtIPT5蛋白為穩(wěn)定親水蛋白，且無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，含有GxxGxGK［S，T］保守基序；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，毛果楊PtIPT5蛋白與美洲黑楊、紅皮柳等楊柳科植物的IPT親緣關(guān)系較近；同源蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，IPT蛋白高度保守，只有Cas3_I superfamily結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位預(yù)測PtIPT5蛋白位于葉綠體中；啟動子分析結(jié)果顯示，PtIPT5基因的啟動子序列包含多種脅迫響應(yīng)的順式作用元件；PtIPT5基因在毛果楊莖段、頂芽、腋芽、主根、側(cè)根、幼嫩葉、擴(kuò)展葉和黃化衰老葉中均有表達(dá)，其中在頂芽、根部和幼嫩葉中相對表達(dá)量較高；低溫脅迫下，PtIPT5基因的相對表達(dá)量隨溫度降低和脅迫時間增加顯著下降，據(jù)此推測該基因響應(yīng)低溫脅迫并發(fā)揮調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：毛果楊；PtIPT5基因；克隆；低溫脅迫；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號：S792.113.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）22-0014-10

毛果楊（Populus trichocarpa）是一種從美洲引進(jìn)的楊屬青楊派的落葉喬木，已完成基因組測序和注釋，具有抗性強(qiáng)、速生等特點(diǎn)，是研究木本植物分子機(jī)制、基因功能解析等分子生物學(xué)的模式植物［1-2］。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（isopentenyl transferases，IPT）基因最早在根癌農(nóng)桿菌中分離并鑒定，是細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）合成過程中的一個重要限速酶基因［3-4］。多種植物的研究表明，IPT基因能提高植物CTK的含量，在植物葉片衰老、作物產(chǎn)量和抗逆方面發(fā)揮重要作用［5-8］。Gan等將IPT基因轉(zhuǎn)入煙草中，提高了葉片的葉綠素含量和光合速率，延緩了葉片的衰老［9］。毛自朝等的研究表明，轉(zhuǎn)IPT基因番茄植株的CTK含量明顯增加，坐果率也有所提高［10］。玉山江·麥麥提等的研究表明，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)IPT基因水稻植株的CTK含量、葉綠素含量、抗旱性和產(chǎn)量顯著高于野生型［11］。史佳俊的研究表明，過表達(dá)MdIPT8的轉(zhuǎn)基因蘋果抗炭疽病能力顯著提高［12］。IPT基因除了可以提高植物的抗旱抗病能力，對植物的抗寒方面也具有影響。張曉等利用基因槍法將IPT基因轉(zhuǎn)入高羊茅，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的植株抗寒能力得到提高并延緩衰老［13］。陳能剛等發(fā)現(xiàn)，IPT基因在水稻中表達(dá)，可以使低溫脅迫下的水稻維持正常的生理活動，保持較高的根系活力，減輕低溫對植株的傷害［14］。李雙等在低溫脅迫轉(zhuǎn)IPT基因煙草的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)使煙草外植體正常分化，獲得較高的抗性愈傷誘導(dǎo)率，并且經(jīng)過處理的轉(zhuǎn)基因煙草IPT基因表達(dá)量明顯上調(diào)［15］。Xiao等發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)IPT基因茄子的葉綠素含量、CTK含量和活性氧清除酶的活性均比野生型茄子高，同時對冷脅迫的耐受性也顯著增強(qiáng)［16］。以上研究表明，IPT基因可以通過調(diào)控CTK的水平調(diào)節(jié)植物的抗性。目前，IPT基因的研究主要集中在草本植物中，在木本植物楊樹中相關(guān)研究鮮有報道，尤其在抗寒方面有待進(jìn)一步深入研究。本研究克隆了毛果楊異戊稀基轉(zhuǎn)移酶基因PtIPT5，采用生物信息學(xué)方法對該基因及其編碼的蛋白進(jìn)行了序列分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測、組織特異性表達(dá)分析及低溫脅迫應(yīng)答分析，為進(jìn)一步了解IPT基因在楊樹生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)，以期為楊樹育種研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究于2022年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試植物材料為毛果楊組培苗，由該實(shí)驗(yàn)室提供，使用MS+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2 毛果楊PtIPT5基因的克隆

采用TIANGEN的RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒提取毛果楊組培苗葉片總RNA，采用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以毛果楊cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增其編碼序列，反應(yīng)體系為：Easy Taq Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板2 μL，去離子水6 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。引物序列見表1。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

電泳檢測后使用Omega的DNA凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，在含有氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上做抗性篩選，挑取陽性單克隆菌落搖菌，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證后送測序。

1.3 PtIPT5基因生物信息學(xué)分析

利用多種在線軟件對PtIPT5基因和蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析（表2）；使用Clustal X軟件對PtIPT5的同源蛋白進(jìn)行多序列比對；運(yùn)用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1 000；利用TBtools軟件對基因的保守基序以及基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析［17-19］。

1.4 PtIPT5基因表達(dá)分析

取長勢相似且生長期一致的毛果楊組培苗，利用試劑盒（見“1.2”節(jié)）提取其RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為qRT-PCR的模板。使用Light Cycler 480熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL（TaKaRa公司），上下游引物（10 μmol/L）各加 0.8 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s；72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。內(nèi)參基因Actin作為對照，每個樣品重復(fù)3次。將得到的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法計算該基因的相對表達(dá)量，并采用SPSS 25.0單因素方差分析法做差異顯著性分析［20］。

1.4.1 組織特異性表達(dá)分析 以毛果楊形態(tài)學(xué)頂端1～3個節(jié)間取樣為幼嫩葉，4～6個節(jié)間取樣為擴(kuò)展葉，余下至根部取樣為泛黃衰老葉，同時取頂芽、腋芽、莖段、主根、側(cè)根、幼嫩葉、擴(kuò)展葉和泛黃衰老葉8個組織，用液氮速凍并放于-80 ℃保存，提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.4.2 低溫脅迫下PtIPT5基因表達(dá)分析 將毛果楊組培苗分別置于10、5、0 ℃培養(yǎng)箱處理，25 ℃處理為對照組，除溫度外其他條件均保持一致，每個溫度分別處理0、3、6、12、24 h。取每組毛果楊幼嫩葉，用液氮速凍并放于-80 ℃保存，提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。所有溫度梯度及處理時間節(jié)點(diǎn)均含有3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtIPT5基因克隆與生物信息學(xué)分析

克隆毛果楊PtIPT5基因，運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，分別對該基因進(jìn)行編碼氨基酸理化性質(zhì)分析、同源氨基酸序列比對分析、蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析、同源基因及蛋白結(jié)構(gòu)域比對分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測和順式作用元件分析。

2.1.1 PtIPT5基因的克隆 以毛果楊葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到PtIPT5基因編碼區(qū)（CDS），序列長984 bp，編碼327個氨基酸殘基（圖1）。

2.1.2 PtIPT5基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析 通過Prot Param軟件分析PtIPT5氨基酸序列，結(jié)果顯示其等電點(diǎn)為6.72，分子量為36 977.54 u，攜帶負(fù)電荷的天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）的殘基總數(shù)為43，攜帶正電荷的精氨酸和賴氨酸（Arg+Lys）殘基總數(shù)為42，該蛋白中含量最多的為纈氨酸（Val），占8.9%，其次為亮氨酸（Leu），占8.6%，含量最少的為色氨酸（Trp），占1.2%（圖2）。分子式為 C1 646H2 613N459O479S15，總原子數(shù)5 212，脂肪系數(shù)為92.08，不穩(wěn)定指數(shù)為34.12，說明該蛋白較為穩(wěn)定，無信號肽區(qū)域，無跨膜結(jié)構(gòu)（圖3）。

Prot Scale在線分析結(jié)果表明，PtIPT5蛋白屬于親水性蛋白，在整個肽鏈中的得分最大值為1.956，在115個氨基酸處；最小值為-2.244，在30個氨基酸處。該蛋白存在10個高分值（gt;1.0），分別分布在37～40、53、92、114～117、154～160、162～164、267、287～288、293～294、319～322處；11個低分值（lt;-1.5），分別分布在14～16、18、28～30、82、105～108、144～146、191～194、197、225、247、278處，親水性（GRAVY）的平均水平為-0.212，屬于親水蛋白（圖4）。

2.1.3 PtIPT5同源氨基酸序列比對分析 利用DNAMAN和GENEDOC軟件分析毛果楊PtIPT5、PtIPT3和擬南芥IPT基因家族的9個氨基酸序列。結(jié)果顯示，毛果楊和擬南芥氨基酸序列的相似度不高，但均具有GxxGxGK［S，T］基序，是IPT氨基酸序列特有的保守結(jié)構(gòu)域。AtIPT2序列中含有1個（C-X2-C-X12，18-H-X5-H）鋅指基序（圖5）。

2.1.4 IPT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將毛果楊PtIPT5氨基酸序列提交到在線數(shù)據(jù)庫Phytozome 11.0中，獲得與其同源性較高的氨基酸序列物種有美洲黑楊（Podel.10G025500.1.p）、紅皮柳（Sapur.010G011800.1.p）、木薯（Manes.15G022800.1）、柑橘（orange1.1g020362m）、棉花（Gohir.A10G114600.1）、擬南芥（AT5G19040.1）、蘋果[JP+2]（MD13G1182800）、[JP+1]白樺（BPChr08G05156）、黃瓜（Cucsa.253940.1）、蒺藜苜蓿（Medtr2g022140.1）、大豆（GlymaLee.13G173000.1.p）、玉米（ZmLH145.02G232200.1.p）、水稻（LOC_Os03g59570.1）、小麥（Traes_5BL_CC443DA6C.1）和番茄（Solyc01g080150.3.1） 。運(yùn)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。

由圖6可知，系統(tǒng)進(jìn)化樹分為三大類分支：茄科雙[CM（21]子葉番茄單獨(dú)聚為一類分支；禾本科水稻、玉米和小麥聚為一類分支；毛果楊、美洲黑楊、紅皮柳、木薯、柑橘、棉花、擬南芥、蘋果、白樺、黃瓜、蒺藜苜蓿和大豆共同聚為一類分支，其中木本植物楊柳科中毛果楊、美洲黑楊和紅皮柳的IPT蛋白共同聚為一類。結(jié)合同源氨基酸序列比對分析，毛果楊PtIPT5與美洲黑楊、紅皮柳和木薯的IPT蛋白相似度分別為 98%、86%、72%，與番茄、大豆和水稻的IPT蛋白相似度為57%、55%和54%，表明毛果楊與美洲黑楊、紅皮柳IPT蛋白的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系較近且符合生物學(xué)分類規(guī)律。

2.1.5 IPT基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 PtIPT5同源基因保守基序預(yù)測分析結(jié)果顯示，所有基因均含有基序（motif） 1～6，表明上述6個基序高度保守；除大豆和蒺藜苜蓿外的所有IPT基因均含有基序7，除木薯、水稻、小麥和玉米外的所有IPT基因均含有基序8， 表明基序7和基序8較為保守。

結(jié)合蛋白功能域分析，結(jié)果顯示，上述6個高度保守基序均在Cas3_I superfamily結(jié)構(gòu)域上，并且本試驗(yàn)分析的16個IPT蛋白均有且只有Cas3_I superfamily結(jié)構(gòu)域，表明該結(jié)構(gòu)域?yàn)镮PT家族的核心結(jié)構(gòu)域。同源基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，美洲黑楊、木薯、棉花、柑橘、擬南芥、蘋果、黃瓜、大豆、蒺藜苜蓿和番茄的IPT基因均含有3個外顯子，水稻、小麥的IPT和PtIPT5中含有2個外顯子，除毛果楊、紅皮柳、白樺、水稻、小麥和玉米以外的其他IPT均有內(nèi)含子（圖7）。

2.1.6 PtIPT5蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 應(yīng)用SOPMA在線軟件對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果表明，在構(gòu)成PtIPT5蛋白的327個氨基酸中，有48.62%的α螺旋（alpha helices）、11.31%的延伸鏈（extended strand）、7.34%的β折疊（beta turn）和32.72%的無規(guī)則卷曲（random coil）等結(jié)構(gòu)（圖8）。

通過在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測PtIPT5蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行盤曲或折疊，形成具有規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。PtIPT5蛋白三維結(jié)構(gòu)由1個PDB號3a8t.1.A的結(jié)構(gòu)為模板建立，屬于植物腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶與ATP的復(fù)合物，序列的相似性為0.43，一致性為46.89%，氨基酸序列的相似范圍為31～298，GMQE值為0.7（圖9）。

2.1.7 PtIPT5蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析 利用WOLF PSORT軟件對PtIPT5蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明，PtIPT5蛋白在葉綠體中得分為9.5，初步推斷該蛋白可能在葉綠體內(nèi)發(fā)揮一定作用（表3）。

2.1.8 順式作用元件分析 利用在線軟件PlantCARE分析PtIPT5基因啟動子區(qū)域2 000 bp的順式作用元件（表4）。該基因啟動子區(qū)域具有多種順式作用元件，如光響應(yīng)元件AE-box、G-box、L-box、TCT-motif、AT1-motif、GA-motif等，以及低溫誘導(dǎo)元件LTR、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、生長素響應(yīng)元件TGA-element等。表明PtIPT5基因可能與光響應(yīng)、激素響應(yīng)和低溫等生物脅迫和非生物脅迫的多種生物功能相關(guān)。

2.2 PtIPT5基因的組織特異性表達(dá)分析

以毛果楊莖段、頂芽、腋芽、主根、側(cè)根、幼嫩葉、擴(kuò)展葉和泛黃衰老葉不同組織的cDNA為模板，通過qRT-PCR檢測分析各組織PtIPT5基因的相對表達(dá)量（圖10）。結(jié)果顯示，PtIPT5基因在上述各組織中均有表達(dá)，其中在泛黃衰老葉中的表達(dá)量最低，其次是莖段；在頂芽和根部中表達(dá)量較高，其次是幼嫩葉，說明PtIPT5基因在根部、頂芽和幼嫩葉等分生能力強(qiáng)的組織中表達(dá)量較高。

2.3 低溫脅迫下PtIPT5基因的表達(dá)分析

對毛果楊組培苗進(jìn)行低溫脅迫，利用qRT-PCR檢測其幼嫩葉中PtIPT5基因的相對表達(dá)量。由圖11可知，在25 ℃下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達(dá)量幾乎不變，維持在1.2左右；之后溫度降低，在10 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達(dá)量降低，在24 h時略微升高；在5 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達(dá)量降低，在12 h時升高，隨后又降低，在24 h時趨近于0；在0 ℃脅迫下，幼嫩葉隨時間變化其PtIPT5基因的相對表達(dá)量降低，在24 h時趨近于0。在0～3 h 時，在10、5、0 ℃脅迫下幼嫩葉基因的相對表達(dá)量均急劇下降，而在12～24 h 時下降幅度較緩。以上結(jié)果表明，不同的低溫及脅迫時長均影響幼嫩葉中PtIPT5基因的表達(dá)，該基因?qū)Φ蜏啬婢尘哂幸欢ǔ潭鹊倪m應(yīng)和調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

異戊稀基轉(zhuǎn)移酶由IPT基因編碼，根據(jù)其氨基酸序列結(jié)構(gòu)分為ATP/ADP-IPTs和tRNA-IPTs等2類：ATP/ADP-IPTs以ATP或ADP作為其首選底物，參與異戊烯基腺嘌呤（iP）型和反式玉米素（tZ）型細(xì)胞分裂素的生物合成；而tRNA-IPTs通過將異戊烯基轉(zhuǎn)移到tRNA中腺嘌呤的N6原子上，參與順式玉米素（cZ）型細(xì)胞分裂素的合成［21-22］。

克隆獲得毛果楊中與細(xì)胞分裂素相關(guān)的PtIPT5基因，通過生物信息學(xué)分析方法了解該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能。該基因CDS序列長984 bp，可編碼327個氨基酸殘基。PtIPT5與擬南芥氨基酸序列中均含有GxxGxGK［S，T］保守功能區(qū)段，該區(qū)段是ATP/GTP 和 DMAPP 的結(jié)合域，也是細(xì)胞分裂素底物合成的結(jié)合位點(diǎn)［23］。毛果楊和擬南芥IPT家族的同源氨基酸序列比對顯示，擬南芥AtIPT2序列中含有（C-X2-C-X12，18-H-X5-H）鋅指基序（圖6），該基序在保持真核生物tRNA-IPTs酶活性中具有重要的作用［23］。PtIPT5[JP3]序列中無此基序，推測PtIPT5屬于ATP/ADP-IPTs并參與異戊稀基腺嘌呤（iP）和反式玉米素（tZ）的生物合成。同源蛋白結(jié)構(gòu)域比對表明，PtIPT5蛋白高度保守，Cas3_I superfamily是該蛋白保守結(jié)構(gòu)域。本研究中PtIPT5亞細(xì)胞定位預(yù)測主要在葉綠體中，Huynh等研究發(fā)現(xiàn)IPT基因可以調(diào)控CTK的生物合成，提高葉綠素含量，從而提高植物光合效率［24］，由此推測該蛋白可能參與葉片光合作用。

IPT基因的表達(dá)具有組織特異性。張停林等對黃瓜中的IPTs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的IPT基因在黃瓜各個組織中的表達(dá)量有明顯差異，在根、葉、幼果中表達(dá)量較高［25］。Cai等在麻風(fēng)病樹中克隆了6個IPT基因，分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要在根、頂端分生組織和成熟葉片中表達(dá)［26］。張勇研究發(fā)現(xiàn)，SlIPT4在番茄幼嫩葉中表達(dá)量較高，隨葉片的發(fā)育和成熟其表達(dá)量逐漸降低［27］。研究認(rèn)為，內(nèi)源細(xì)胞分裂素合成后能通過維管系統(tǒng)長距離運(yùn)輸?shù)狡渌课唬M(jìn)而影響植物的生長發(fā)育［28］。Lacombe等研究發(fā)現(xiàn)，tZ型CTK主要在植物根系中合成，通過木質(zhì)部轉(zhuǎn)移到形態(tài)學(xué)上端幼嫩組織中，而iP型CTK多數(shù)在幼嫩葉中合成并通過韌皮部轉(zhuǎn)移到根系［29］。綜上可知，PtIPT5基因可能參與tZ型和iP型CTK的生物合成，因此該基因在毛果楊根、頂芽和幼嫩葉中的相對表達(dá)量較高，結(jié)果與前人研究結(jié)果［27］相符，推測其可能調(diào)控葉片的前期生長發(fā)育和后期衰老。

低溫是影響植物生命活動的非生物脅迫之一［30］。植物自身可以通過調(diào)節(jié)光合呼吸，改變酶活性和激素含量，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，以減緩長時間低溫脅迫的傷害［31-32］。低溫脅迫下，植物內(nèi)源脫落酸（abscisic acid，ABA）的含量發(fā)生變化［33］。擬南芥和水稻在低溫下其葉片中ABA含量顯著增加，而CTK含量逐漸減少，且有研究表明IPT基因的表達(dá)受ABA的負(fù)調(diào)控［34-36］。通過對野生型毛果楊組培苗進(jìn)行不同程度低溫脅迫處理后，對幼嫩葉中PtIPT5基因進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)溫度的降低和脅迫時間的延長均抑制了PtIPT5基因的表達(dá)。本研究中毛果楊幼嫩葉在5、0 ℃脅迫下其PtIPT5基因的相對表達(dá)量呈下降趨勢，其原因可能是葉片受到低溫脅迫后，ABA含量增加，抑制了PtIPT5基因表達(dá)，由于植物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，在處理12 h時該基因的相對表達(dá)量有所上調(diào)繼而下降；在10 ℃處理組中，毛果楊葉片的應(yīng)激反應(yīng)可能出現(xiàn)在24 h時或脅迫更長時間時；在0 ℃處理組中，幼嫩葉耐低溫能力相對較低，PtIPT5基因的相對表達(dá)量持續(xù)下降。以上結(jié)果表明，PtIPT5基因可能在低溫脅迫的過程中發(fā)揮著調(diào)控作用，其表達(dá)受低溫負(fù)調(diào)控并可能參與突發(fā)環(huán)境變化或長期響應(yīng)的過程。

為進(jìn)一步挖掘IPT基因在楊樹抗逆分子機(jī)制，定向改良楊樹品種方面的潛能，計劃對PtIPT5進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，以闡明該基因在毛果楊細(xì)胞分裂素生物合成途徑的催化特性以及在生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用，為培育抗逆楊樹優(yōu)良新品種提供候選基因。

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收稿日期：2023-01-02

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)（編號：2018ZX08020002-005-005）。

作者簡介：畢田田（1997—），女，遼寧朝陽人，碩士研究生，主要從事林木生物技術(shù)研究。E-mail：1756988574@qq.com。

通信作者：白玉娥，博士，教授，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：baiyue@imay.edu.cn。