腸道定植耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌分子特征及其感染相關研究

摘要：目的 通過對直腸拭子主動篩查出的耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）和對應患者感染后分離出的CRE進行配對分析研究，以探討CRE定植和感染之間的分子特征異同，為臨床CRE感染的防控提供幫助和指導。方法 采集2021年1月至2021年12月住院患者直腸拭子標本進行CRE菌株篩查。監測篩查陽性患者的感染發生情況，對感染菌株及其定植菌株同時進行多位點序列分型、耐藥基因和毒力基因檢測，并進行測序分析。結果 CRE主動篩查定植率為2.41%（75/3116），其感染率為45.3%（34/75）。碳青霉烯酶耐藥基因檢出以blaKPC為主：定植組blaKPC（25/34）、blaOXA48（9/34），感染組blaKPC（25/34）、blaOXA48（10/34），檢出率Pgt;0.05；ST分型以ST11型檢出率最高，定植組ST11型（25/34）、ST231型（9/34），感染組ST11型（25/34）、ST231型（9/34），檢出率Pgt;0.05。毒力基因檢出率較高的為：定植組mrkD（34/34）、uge（32/34）、fimH（33/34）、wabG（32/34）、entB（32/34），感染組mrkD（34/34）、fimH（31/34）、uge（34/34）、wabG（31/34）和entB（30/34），檢出率Pgt;0.05。定植菌是否發生感染與毒力基因uge、iucA、iutA、rmpA和iroB相關，P≤0.05。結論 腸內定植CRE與其感染CRE之間高度同源，主動篩查是防控CRE感染的重要舉措，通過CRE主動篩查對高危人群預防CRE感染意義重大。

關鍵詞：耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌；腸道定植；主動篩查；分子特征

中圖分類號：R987.1 文獻標志碼：A

Molecular characteristics of intestinal carbapenem-resistant Enterobacteriaceae bacteria and their correlation with infection

Meng Xue-fei1， Zhang Hong-juan1， Song Gui-bo1， Ma Zhi-gang1， Li Xiao-feng1， Liang Yuan1，

Liu Han-yu2， and Shan Bin1

（1 First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Medical Laboratory Medicine Research Center， Kunming 650032;

2 Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650021）

Abstract Objective Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） actively screened from rectal swabs and CRE isolated from corresponding patients after infection were analyzed by paired analysis to explore the relationship between CRE colonization and infection. The similarities and differences of molecular characteristics of CRE can provide help and guidance for the prevention and control of clinical CRE infection. Methods Rectal swab specimens from inpatients from January 2021 to December 2021 were collected for CRE strain screening. To monitor the occurrence of infection in patients with positive screening results， multi-locus sequence typing， drug resistance gene and virulence gene detection of infected strains and their colonized strains， and sequencing analysis were performed. Results The colonization rate of CRE active screening was 2.41% （75/3116）， and the infection rate was 45.3% （34/75）. Carbapenemase resistance genes were detected mainly as blaKPC： blaKPC （25/34） and blaOXA48 （9/34） in the colonization group， and blaKPC （25/34） and blaOXA48 （10/34） in the infection group， with Pgt;0.05; ST type had the highest detection rate， ST11 type （25/34） and ST231 type （9/34） in the colonization group， and ST11 type （25/34） and ST231 type （9/34） in the infection group， with Pgt;0.05. The higher detection rate of virulence genes were mrkD （34/34）， uge （32/34）， fimH （33/34）， wabG （32/34）， and entB （32/34） in the colonization group， and mrkD （34/34）， fimH （31/34）， uge （34/34）， wabG （31/34）， and entB （30/34） ） in the infection group， with Pgt;0.05. Whether the colonization bacteria is infected or not is related to the virulence genes uge， iucA， iutA， rmpA， and iroB， with P≤0.05. Conclusion" " There is a high degree of homology between colonized CRE and infected CRE. Active screening is an important measure to prevent and control CRE infection. Active screening of CRE is of great significance to prevent CRE infection in high-risk groups.

Key words Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Intestinal colonization; Active screening; Molecular characterization

耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（CRE）是全球傳播速度最快的多重耐藥菌之一，也是醫院獲得性感染的主要原因[1]，全因死亡率可高達32%～65%[2-3]。嚴重危害患者生命健康。研究表明，CRE在腸道定植是繼發其感染的高危因素[4]，此外腸道定植者由其他病原微生物導致血流感染的發生率也遠遠高于非定植者[5]。頻繁有創操作、胃腸道功能紊亂、碳青霉烯類抗菌藥物暴露[6-7]等因素促進CRE在腸道中定植。本文對高危人群采集直腸拭子[8]進行主動篩查并監測其后續感染情況，對CRE腸道定植率與繼發感染率及定植菌與感染菌的分子特征進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2021年1—12月昆明醫科大學第一附屬醫院CRE主動篩查陽性患者的直腸拭子和對應患者的感染標本中分離出的CRE菌株。納入標準：入院48 h內采集直腸拭子進行CRE主動篩查的患者。對于多次住院，僅統計第一次篩查陽性結果；對于住院期間同一患者多次篩查有兩次及以上陽性結果時僅統計第一次篩查結果。排除標準：未簽署知情同意書、患者無法配合、腹瀉患者。本研究已通過昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，倫理號：（2021）倫審L第20號（No. L-20/2021）。

1.2 研究方法

1.2.1 CRE主動篩查

根據美國CDC發布指南[8]患者入院48 h內、第7天及之后每隔一星期采集患者直腸拭子采用碳青霉烯紙片法進行篩查，至患者出院或者死亡。使用基質輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）質譜儀對菌株進行菌種鑒定，MIC法對藥敏結果進行復核。

1.2.2 PCR擴增耐藥基因

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取肺炎克雷伯菌基因組DNA作為PCR擴增模板，采用紫外分光光度法測定其濃度和純度。采用PCR方法對68株CRKP進行耐藥基因擴增，引物序列（表1）及反應條件參照文獻[9]進行。耐藥基因包括：blaKPC、blaOXA48、blaNDM、blaIMP和blaVIM。PCR擴增產物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序，測序結果經BLAST與已知序列比對，確定其耐藥基因型。

1.2.3 多位點序列分型

根據肺炎克雷伯菌多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）數據庫（http：//bigsdb.web. pasteur.fr/klebsiella/primer_used.html） 提供的引物序列和反應條件，采用PCR法擴增7對管家基因（gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi和rpoB），將擴增產物的測序結果與MLST數據庫進行比對，得出ST分型結果。

1.2.4 PCR擴增毒力基因

DNA提取方法同“1.2.2”，采用PCR方法對68株CRKP進行耐藥基因和毒力基因擴增，引物序列（表2）及反應條件參照文獻[11-12]進行。毒力基因包括：rmpA、mrkD、silS、iroB、iucA、kfu、fimH、wabG、uge、iroN、iutA、allS和entB；PCR擴增產物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序，測序結果經BLAST與已知序列比對，確定其毒力基因型。

1.3 CRE定植與醫院感染判定標準

CRE的定植：在排除污染的情況下，送檢直腸拭子培養出CRE，且無感染相關的臨床表現，判定為CRE的定植。根據國家衛生部頒布的《醫院感染診斷標準》[12-13]判定CRE的醫院感染，患者有以下臨床表現及實驗室檢查，如臨床表現：發熱、寒戰、咳嗽、咳痰、尿頻、尿急、尿痛、腎區叩痛、腹痛、腹部壓痛或反跳痛；體征：肺部濕啰音、皮疹、出血點、肝脾腫大、收縮壓低于90 mmHg，或較原收縮壓下降40 mmHg；實驗室檢查：白細胞總數增多和（或）中性粒細胞增多伴核左移、痰細胞病原菌≥106 CFU/mL、清潔中段尿培養菌落計數gt;105 CFU/mL、新鮮尿液離心相差顯微鏡檢查30個視野中有半數視野見到細菌、全血和腹水細菌培養陽性或者檢測到病原體抗原物質、腹水為滲出液；影像學表現：X線顯示肺部有炎性浸潤性病變。

1.4 統計分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，計數資料采用例數和百分比表示，n≥40且T≥1采用χ2檢驗，nlt;40或Tlt;1采用Fisher確切概率法檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRE檢出情況

共有3116例患者進行了直腸拭子篩查，陽性患者共75例，篩查陽性率為2.41%（75/3116）。其中肺炎克雷伯菌65株（占86.7%）、大腸埃希菌8株（占10.7%）、陰溝腸桿菌2株（占2.6%）。直腸拭子篩查陽性的患者，在后續的監測中有34例患者發生感染，并分別在痰、全血、尿液、腹水中檢出CRE，定植菌與感染菌均為肺炎克雷伯菌，集中分布于中心重癥監護室、老年呼吸科、神經外科。CRE主動篩查陽性患者與繼發感染患者科室分布情況以及檢出細菌菌種情況見表3；患者直腸拭子CRE主動篩查陽性及繼發感染標本檢出CRE的時間關系見表4。

2.2 耐藥基因、MLST分型及毒力基因結果

對75例定植患者中繼發感染的34例患者直腸拭子檢出的CRE菌株和感染標本的CRE菌株的耐藥基因、MLST分型、毒力基因進行檢測，并分組比較。直腸拭子檢出CRE菌株歸為“定植組”，感染標本檢出CRE菌株歸為“感染組”。

2.2.1 耐藥基因檢出情況

PCR檢測結果顯示，耐藥基因檢出情況為：定植組：blaKPC（73.5%）、blaOXA48（29.4%），感染組：blaKPC（73.5%）、blaOXA48（26.5%）；總體以A類酶blaKPC為主，其次為D類blaOXA48，均未檢出blaNDM、blaIMP、blaVIM等碳青霉烯酶基因，定植組與感染組之間差異沒有統計學意義，Pgt;0.05。結果見表5。

2.2.2 MLST分型結果

MLST分型結果顯示，68株CRKP菌株中，共分出2個MLST型別，其中定植組ST11型占73.5%，ST231型占26.5%，感染組ST11型占73.5%，ST231型占26.5%；定植組與感染組之間差異沒有統計學意義（Pgt;0.05）。結果見表6。

2.2.3 毒力基因檢出情況

PCR檢測結果顯示，毒力基因檢出情況為：定植組mrkD（100%）、uge（94.1%）、fimH（97.11%）、wabG（94.1%）、entB（94.1%）、iucA（38.2%）、iutA（32.4%）、rmpA（20.6%）、silS（17.6%）、iroB（17.6%）、kfu（17.6%）、iroN（0%）；感染組mrkD（100%）、uge（100%）、fimH（91.2%）、wabG（91.2%）、entB（88.2%）、iucA（29.4%）、iutA（29.4%）、rmpA（17.6%）、silS（14.7%）、iroB（14.7%）、kfu（11.8%）和iroN（2.9%）。未檢出毒力基因alls；定植菌與感染菌之間差異沒有統計學意義，Pgt;0.05。結果見表7。

2.3 34對肺炎克雷伯菌耐藥基因、毒力基因、ST分型分布情況

圖1為34對由定植繼發為感染的患者其定植菌與感染菌檢出blaKPC、entB、wabG、fimH、mrkD、uge、silS、iroN、rmpA、iroB、blaOXA48、kfu、iucA和iutA等基因的分布情況。

2.3.1 耐藥基因

除1例患者定植菌攜帶耐藥基因為blaKPC和blaOXA48、感染菌攜帶的耐藥基因為blaKPC，其余患者定植菌與感染菌攜帶的耐藥基因呈現一一對應的關系。

2.3.2 毒力基因

同一患者定植菌與感染菌攜帶毒力基因一致的比例：entB（32/34， 94.1%）、wabG（31/34， 91.2%）、fimH（30/34， 88.2%）、mrkD（34/34， 100%）、uge（32/34， 94.1%）、silS（31/34， 91.%）、iroN（33/34， 97.1%）、rmpA（31/34， 91.2%）、iroB（33/34， 97.1%）、kfu（32/34， 94.1%）、iucA（32/34， 94.1%）和iutA（30/34， 88.2%），均大于80%。

2.3.3 MLST分型

同一患者的定植菌與感染菌MLST分型呈現一一對應的關系。

2.4 患者結局轉歸情況與耐藥基因和毒力基因的關系

75例CRE腸道定植患者有34例在入院時和后續監測中發生感染，感染率為45.3%（34/75）。將75例定植患者分為兩個組：定植未發生感染組和定植并感染組，將兩組患者檢出的耐藥基因和毒力基因進行統計分析：毒力基因uge、iucA、iutA、rmpA、iroB有統計學意義，P≤0.05；耐藥基因blaKPC和blaOXA48和毒力基因fimH、wabG、entB、silS、kfu和iroN無統計學意義，Pgt;0.05。定植并感染的34例患者中僅4例（11.8%）好轉出院，30例（（88.2%）結局不良（包括23例死亡、7例自動出院）。將其分為兩個組：感染好轉組、感染結局不良組并對感染菌攜帶的耐藥基因和毒力基因進行統計分析：好轉組耐藥基因和毒力基因與結局不良組之間之間差異沒有統計學意義，Pgt;0.05。結果見表8。

3 討論

CRE的流行趨勢嚴峻，對公共健康造成了嚴重的威脅，給治療與防控帶來了巨大的挑戰。歐洲CDC和世界衛生組織發布的指南《預防耐碳青霉烯類腸桿菌科進入醫療機構的防控指南》和《醫療機構耐碳青霉烯的腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌防控指南》[14-15]把CRE列為緊急威脅并推薦對于高風險人群進行主動篩查，對攜帶者進行干預有助于降低CRE的發生率。研究指出CRE的感染可以在經過治療后得以控制，但其腸道定植狀態甚至可達1年以上[16-17]，48%的CRE感染發生于先前有腸道定植的患者，相比之下僅12%的感染是由于院內傳播引起[18]。本研究中，3116例住院患者中篩出CRE攜帶患者有75例，定植率為2.41%，篩出細菌以肺炎克雷伯菌為主占86.7%（65/75）其次為大腸埃希菌和陰溝腸桿菌分別占10.6%（8/75）、2.7%（2/75），說明院內耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的腸道定植情況較為嚴重。65例檢出CRKP的患者中有34例在入院時和后續的監測中發生身體其他部位的感染，分別在痰、尿液、全血、腹水中檢出CRKP。全國細菌耐藥監測網2014—2019年耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌流行病學變遷監測報告顯示CRKP檢出率從2014年的6.4%上升到2019年的10.9%[19]，提示應重點加強CRKP的防控。據于定植CRKP中較高的感染發生率，通過主動篩查發現定植患者定位及其所在科室，并盡早干預。

產碳青霉烯酶是CRE主要的耐藥機制，目前報道的有A、B、D 3種類型。本次共檢出兩種碳青霉烯酶以KPC型為主其次為OXA-48型，未檢出NDM、IPM、VIM型，定植組與感染組之間差異沒有統計學意義，Pgt;0.05；并且過熱圖對比可以看出僅一個配對株之間不一致。我國最常見碳青霉烯酶的是A類酶中的KPC型[20]，作為最普遍和廣泛傳播的碳青霉烯酶，與高死亡率相關[21]。相關研究[22]指出定植CRE產KPC型碳青霉烯酶或亞胺培南MIC≥32是定植患者在后續發展為感染風險較大的危險因素。OXA48型主要流行于拉丁美洲和歐洲[23]，但近年來OXA48型碳青霉烯酶開始在我國流行[24]，其通過colkp3質粒在不同菌株之間以較快的速度傳播。通過MLST對68株CRKP進行同源性分析，共檢出兩種ST分型，以ST11為主占，其次為ST231型，總體ST11型的檢出率為73.5%，ST231型的檢出率為26.5%。熱圖顯示配對菌株之間ST分型一致，這部分患者主要分布于中心重癥監護室、老年呼吸科和神經外科存在集中流行的趨勢。并且這部分患者伴有嚴重的基礎疾病、抵抗力較差。國內一項關于腸道定植CRE的分子流行病學研究共分離出15株CRKP并且ST分型全部為ST11型[25]。可以看出ST11型耐碳青霉烯類肺炎克雷伯（ST11-CRKP）在腸道定植中占居主要地位。近10年來，（ST11-CRKP）引起醫院感染的數量迅速增加[26]，腸道定植的CRKP成為碳青霉烯酶編碼基因的重要儲存庫。

由CRKP引發的機體感染，不僅治療花費較大，細菌攜帶的毒力作用于機體容易留下嚴重的后遺癥。菌毛（I型fimH、III型mrkD），三價鐵離子攝取（kfu），脂多糖（uge、wabG），氮利用（sil），鐵載體（腸桿菌素entB、氣桿菌素iucA、iutA和沙門菌素iroB、iroN）等，均在CRKP的致病過程中發揮著重要作用，菌毛介導細菌黏附于腸道或其他感染部位是細菌感染人體的關鍵一步，以及隨后在腸道定植和建立感染起到重要作用[27]。脂多糖是革蘭陰性桿菌產生的內毒素可導致機體發生全身炎癥反應綜合征、膿毒癥、休克等毒性反應，其中相關研究[28]指出缺乏uge的肺炎克雷伯菌不易引起肺部感染、泌尿系感染和敗血癥等。鐵是細菌生長繁殖所必需的微量元素，鐵載體系統可吸收運輸鐵，其中氣桿菌素幫助細菌從宿主內環境獲得鐵離子，明顯提高肺炎克雷伯菌在腹水和血清中的生存率[29]，容易導致定植菌遷移引發血流感染。一項回顧性分析指出攜帶iutA是肺炎克雷伯菌血流感染患者死亡的獨立危險因素[30]。本次檢出率較高的毒力基因是mrkD、fimH、entB、uge和wabG檢出率均在90%以上，其次為iucA、iutA、kfu、rmpA、silS、iroB和iroN。34例并發感染的患者中定植組與感染組之間差異沒有統計學意義，與相關研究[31]一致。

CRKP引發的感染當中以血流感染最為兇險，一項國內的研究指出CRKP血流感染14 d死亡率為46.8%[32]。本研究中檢測到全血標本來源的CRKP與其配對的腸道定植菌均攜帶有rmpA、iucA和iroB等基因，其與高毒力相關并攜帶于plVPK質粒上，它是一種大約170 000 hp、可移動的的毒力元件，可與碳青霉烯酶耐藥基因整合，獲得plVPK質粒的CRKP具有高毒力、高耐藥、高傳播的特點[33]，相關研究指出iucA、iroB和rmpA與肺炎克雷伯菌引起感染的嚴重程度相關[34]。本文通過對定植患者是否并發感染兩組患者攜帶的耐藥基因和毒力基因進行比較：其中毒力基因uge、iucA、iutA、rmpA和iroB有差異與研究[35]一致。說明這5個毒力基因在感染的進程起到關鍵促進作用。定植是否發生感染與fimH、wabG、entB、silS、kfu和iroN不相關與研究[35-36]一致。感染好轉組與感染結局不良組耐藥基因和毒力基因之間差異性分析得出其與感染患者的轉歸和預后不相關。同時Remya等[37]通過單因素分析得出多重耐藥與非多重耐藥肺炎克雷伯菌感染患者攜帶的毒力基因與患者的預后和死亡率之間無顯著相關性。但是相關研究顯示blaKPC在預測CRKP所致血流感染14 d死亡率方面具有價值[38]。Bakr等[39]也通過檢測100例膿毒血癥患者毒力基因并分析與死亡率之間的關系得出毒力基因rmpA與膿毒血癥所致的死亡率具有顯著相關性，基于本研究中發生血流感染的患者例數較少需擴大樣本量進行檢測，進一步需要細分毒力基因與不同感染類型的預后之間的關系。

本文分別對同一患者配對菌株進行了對比分析得出34例CRE篩查陽性并繼發感染的患者定植組與感染組檢出細菌均為肺炎克雷伯菌；ST分型一致、碳青霉烯酶基因和本次所測毒力基因均無明顯差異，兩者之間高度同源，并且所攜帶的耐藥基因和毒力基因具有較高致病性。與相關研究報道的定植菌與感染菌之間的相似性達80%以上相一致[40]。推測從腸內定植遷徙為感染，CRE的分子特征未發生明顯改變。如果定植狀態持續存在，會在機體免疫力低下的情況下發生感染。目前國內不推薦對醫務工作者常規進行CRE的直腸拭子篩檢，而國外一項針對醫護人員腸道定植菌的篩查可以看出耐藥革蘭陰性菌易在重癥監護病房的護理工作者的腸道定植[41]，并且ICU內醫護人員污染的手套和防護服[42]也是耐藥菌在患者之間傳播的主要原因，尤其是與ICU住院患者密切接觸的呼吸科治療師的手套和防護服必須重點消毒以及接觸隔離。本研究經監測一半的CRE腸道定植患者在后續發生了嚴重的感染，各部門應嚴格按指南要求對CRE進行主動篩查并采取預防接觸隔離措施、環境消毒、加強手衛生等來降低CRE傳播[41]，對于定植者本身盡可能減少不必要的醫療暴露[43]降低內源性感染的發生。一項針對兒童重癥監護室CRE主動篩查的研究發現在進行主動篩查并干預后CRE的感染率由8.5%下降到5.7%[44]。

綜上，醫院重癥監護室是CRE腸道定植最高的科室，定植后繼發的感染率較高并且感染患者預后較差，臨床治愈率較低。同一患者定植菌與感染菌之間具有很高的相關性，其菌種一致、ST分型一致、所攜帶的耐藥基因和毒力基因之間高度同源。本次研究存在不足之處，樣本量少無法準確通過耐藥基因和毒力基因評估患者的預后和轉歸。CRE在腸道定植是感控的難點和重點，醫院各部門應積極配合主動篩查并進行干預，可有效控制CRE的傳播與感染。

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