依替米星對斑馬魚細菌感染過程中中性粒細胞增殖及功能的影響

摘要：目的 中性粒細胞作為機體對抗細菌感染時的第一道免疫防線，發揮了重要的防御功能。本文探索依替米星在治療斑馬魚感染過程中，對中性粒細胞增殖和功能的影響。方法 采用斑馬魚胚胎心包腔內注射方法，考察不同細菌負載量對斑馬魚生存率的影響，建立感染模型；通過考察斑馬魚生存率及體內細菌清除情況，確定依替米星的體內治療濃度；將表達紅色熒光蛋白的大腸埃希菌與綠色熒光標記中性粒細胞的轉基因斑馬魚Tg（mpx： GFP）結合，通過蘇丹黑染色觀察中性粒細胞的顆粒，通過多色熒光成像和細胞計數觀察細菌與中性粒細胞的動態變化，并統計分析依替米星對中性粒細胞的增殖、趨化及脫顆粒的影響。結果 通過心包腔注射大腸埃希菌1000 CFU/胚胎，建立斑馬魚感染模型；確定依替米星治療濃度為4 mmol/L，該濃度下感染斑馬魚24 hpi的生存率顯著提高，體內的活菌數及細菌熒光強度顯著降低，趨化因子IL-8轉錄水平是感染組的1/3，心包腔部位中性粒細胞“+++”等級的斑馬魚占比是感染組的1/4，體內總中性粒細胞數量和脫顆粒比例占比略有下降，但不顯著。 結論" 依替米星在斑馬魚感染過程中，可有效清除心包腔部位的細菌，提高斑馬魚生存率，并且顯著抑制趨化因子IL-8誘導的中性粒細胞趨化，避免其在炎癥部位聚集，減輕過度炎癥反應對機體的損傷，但對中性粒細胞增殖和脫顆粒的影響不顯著。

關鍵詞：依替米星；斑馬魚；感染；中性粒細胞；增殖；趨化；脫顆粒

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Effects of etimicin on neutrophil proliferation and function of infected zebrafish

Zhang Rui， Zhang Ming-fang， Chen Dai-jie， Jing Li-li and Yin Yu

（Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240）

Abstract Objective As the first line of immune defense， neutrophils play an important role when the body is infected by bacteria. In this paper， the effects of etimicin on the proliferation and function of neutrophils in zebrafish infected with Escherichia coli were explored. Methods To establish the zebrafish bacterial infection model， the effects of different bacterial on zebrafish embryo survival was modeled by pericardial cavity injection in zebrafish embryos. The in vivo therapeutic concentration of etimicin was determined by calculating the survival rate and bacterial clearance in zebrafish. With the combination of red fluorescent protein-expressing E. coli， transgenic zebrafish Tg（mpx： GFP） line whose neutrophils were green-fluorescent labeled， and neutrophil granules stained with Sudan black， the dynamic changes of bacteria and neutrophils were observed by real-time multicolored fluorescence imaging and cell tracking. The effects of etimicin on the proliferation， chemotaxis， and degranulation of neutrophils were then statistically analyzed. Results" " Zebrafish infection model was established by injecting Escherichia coli 1000 CFU per embryo into the pericardial cavity. 4 mmol/L was determined to be the therapeutic concentration of etimicin. The survival rate of infected zebrafish was greatly enhanced， and the viable bacteria count and bacterial fluorescence intensity in vivo were dramatically reduced， at 24 h after infection at this concentration. In comparison to the infected model group， the level of chemokine IL-8 transcription and the proportion of zebrafish with \"+++\" grade neutrophils in the pericardial cavity were 1/3 and 1/4， respectively. The overall number of neutrophils and the proportion of neutrophils that degranulated both reduced slightly. Conclusion" "Etimicin could successfully eliminate bacteria from infected zebrafish’s pericardial cavity， increasing their survival rate. Etimicin suppressed neutrophil chemotaxis triggered by the chemokine IL-8， prevented their aggregation in inflammatory areas， and reduced the harm caused by an overactive inflammatory response in the body， but had no significant effect on neutrophil proliferation or degranulation.

Key words Etimicin; Zebrafish; Infection; Neutrophils; Chemotaxis; Proliferation; Degranulation

氨基糖苷類抗生素是具有廣譜抗菌活性的抗生素，目前多用于治療多重耐藥的革蘭陰性桿菌感染[1]。依替米星是以慶大霉素同系物C1a為母核，引入乙基后得到的新型半合成氨基糖苷類抗生素[2]，因具有抗菌譜廣、抗菌活性強、交叉耐藥性小、安全性高等優點而被廣泛應用于感染性疾病的臨床治療[3]。

機體被細菌感染時，中性粒細胞作為第一道防線，被激活后可發揮趨化作用、吞噬作用、細胞內殺傷作用、胞外誘捕殺菌以及調節適應性免疫。近年來，抗生素的免疫調節作用引起了越來越多學者的重視。目前氨基糖苷類藥物中代表性的慶大霉素已在體外細胞實驗中被證實對人中性粒細胞胞外誘捕網具有抑制作用[4]。但在機體細菌感染時，此類藥物對中性粒細胞功能的影響尚無研究報道。

斑馬魚（Danio rerio）由于成本低，易于大規模繁殖，體外受精發育、胚胎光學透明，且熒光病原體和表達熒光免疫細胞的轉基因報告斑馬魚系，使宿主-病原體的相互作用易于表征[5]。本研究在確立氨基糖苷類藥物依替米星對感染斑馬魚的體內藥效學作用基礎上，進一步探究該藥物對感染斑馬魚體內中性粒細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

氨基糖苷類抗生素依替米星硫酸鹽 （ETM）及慶大霉素C1a硫酸鹽由常州方圓制藥有限公司提供，PTU、Tricane購自Sigma-Aldrich公司，Liberase Blendzyme3購自Roche公司，瓊脂糖、酚紅、氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，Proteinase購自Invitrogen公司，Beyozol、礦物油購自碧云天生物技術有限公司，RT reagent Kit試劑盒、Premix Ex TaqII試劑盒購自TAKARA公司，胰蛋白胨和酵母提取物購自OXOID公司，斑馬魚胚胎培養液E3 （4% CaCl2 ， 10% NaCl， 0.3% KCl， 1.63% MgSO4）。

1.1.2" " 實驗動物

野生型AB斑馬魚（Danio rerio）及中性粒細胞特異性綠色熒光標記的Tg（mpx： GFP）品系為復旦大學生命科學院獲得。成魚飼養溫度28.5℃±1℃，14 h光

照/10 h黑暗循環。選取健康成魚按雌雄比例1：1或2：1交配，收集受精卵，清洗挑選后轉移至E3培養液中，28.5 ℃恒溫培養至48 hpf （hour post fertilization）胚胎用于后續實驗。

1.1.3 實驗菌株

Escherichia coli BL21 （DE3）由實驗室保藏；表達RFP（紅色熒光蛋白）的BL21-RFP菌株構建：提取E. coli BL21 （DE3）/pET-RFP菌株中的RFP表達質粒，敲除RFP表達質粒中啟動子調節基因lac，并連接剩余部分，獲得無需誘導，即能表達RFP的BL21-RFP菌株。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射

細菌注射：采用心包腔內注射法。以1：100體積比轉接過夜振搖的大腸埃希菌，培養至對數生長期，以無菌PBS洗滌濃縮至不同濃度待用。選擇正常發育的48 hpf斑馬魚胚胎，用Proteinase脫去卵膜，將4 nL不同濃度的菌液注射至胚胎的心包腔內[6]，以構建大腸埃希菌體內感染模型，同時為了便于注射觀察，以4%酚紅PBS溶液作指示劑對照。每天更換E3培養液并檢查記錄斑馬魚的生存情況。

藥物注射：采用顧維爾氏管注射法。斑馬魚心包注射細菌2 hpi（hour post infection）時，注射2 nL一定濃度的藥物至胚胎顧維爾氏管，以4%酚紅PBS溶液作為對照。每天更換E3培養液并檢查記錄斑馬魚的生存情況。

1.2.2 活菌計數及細菌體外示蹤

每10條AB斑馬魚胚胎為一組，分別于感染細菌后0、6和24 h麻醉，PBS洗滌3次后勻漿，梯度稀釋并涂布于LB平板，37℃過夜培養。統計各時間點斑馬魚胚胎體內的菌落數，每個時間點重復3次。感染BL21-RFP細菌后，于0、6和24 hpi時于熒光顯微鏡下拍照記錄斑馬魚體內細菌分布情況。

1.2.3 實時熒光定量PCR

Beyozol法提取AB斑馬魚全胚胎總RNA，利用RT reagent Kit反轉錄酶反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR（qRT-PCR）。以GAPDH為內對照，以對照組為外對照，利用Bio-RAD熒光實時定量PCR儀進行擴增，2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。所用的斑馬魚引物序列如表1所示。

1.2.4 中性粒細胞分布及數目統計

Tg（mpx： GFP）斑馬魚胚胎于48 hpf注射BL21-RFP細菌，2 hpi時給予ETM處理，分別于6和24 hpi及48 hpi于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄斑馬魚胚胎全身中性粒細胞分布情況。于2 hpi給藥，24 hpi麻醉胚胎并切碎重懸，加入裂解酶37℃孵育20 min，10%FBS停止裂解。過濾離心后棄上清，重懸細胞并過濾，選擇488 nm激發波長，流式細胞術統計斑馬魚全胚胎中性粒細胞數。

1.2.5 中性粒細胞脫顆粒統計

向48 hpf AB斑馬魚胚胎注射1000 CFU BL21細菌后，使用4%多聚甲醛PBS溶液于4℃過夜固定。PBS沖洗后于蘇丹黑染色液中染色6～8 h，用70%乙醇及70%乙醇與PBS 1：1混合液及PBS溶液次序洗滌。用1%氫氧化鉀去除斑馬魚體內色素后，用PBS洗滌3次。將染色后的斑馬魚胚胎于體式熒光顯微鏡下拍照統計中性粒細胞脫粒比例。

1.2.6 數據分析

利用ImageJ軟件統計斑馬魚體內熒光面積及平均強度，熒光強度=熒光面積×平均強度。數據統計使用（x±s）表示方法，采用SPSS 26.0軟件對數據進行分析，細菌處理后各組間中位生存時間及不同時間總體生存率采用Kaplan-Meier法比較，多組間生存率采用log-rank比較；多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為具有顯著差異。

2 結果

2.1 斑馬魚胚胎體內感染大腸埃希菌模型的建立

為了使注射入斑馬魚體內部位的細菌相對固定，便于觀察，本文采用心包腔注射細菌的方式建立斑馬魚心包感染模型，該區域相對封閉，細菌不易擴散至全身。細菌負載量是控制斑馬魚感染模型最重要的參數，分別以100、500、1000、2000和4000 CFU/胚胎的負載量向48 hpf野生型AB斑馬魚心包腔內注射E. coli BL21，每組24個胚胎，每日統計生存情況并更換培養液。

圖1中生存曲線為感染后1～7 d觀察結果，從結果可知，2000 CFU/胚胎及4000 CFU/胚胎負載量時，中位生存時間僅2 d。在感染2 d時，1000 CFU/胚胎細菌負載量下，總體生存率為83%；2000 CFU/胚胎細菌負載量下，總體生存率為50%。細菌負載較高時，斑馬魚在2 d內死亡較多，不利于后續觀察；細菌負載較低時，斑馬魚自體免疫即可清除細菌，斑馬魚的生存率與健康個體相比變化較小；考慮注射給藥操作可能會造成斑馬魚二次損傷，選擇1000 CFU/胚胎作為感染濃度，在該細菌負載量下，斑馬魚的生存率為63.8%。

為了進行進行可視化追蹤，選擇BL21-RFP細菌感染斑馬魚進行觀察。如圖2所示，在1000 CFU/胚胎細菌感染24 h后，心包腔部位的紅色細菌并未被機體清除，可進一步用于藥效學和免疫調節反應研究。

2.2 依替米星在感染斑馬魚模型中的體內藥效學研究

依替米星的體內藥效主要從斑馬魚生存情況、體內細菌清除情況兩方面進行考察。

2.2.1 斑馬魚生存情況

1000 CFU/胚胎細菌負載量下，2 hpi時于斑馬魚胚胎顧維爾氏管注射不同濃度藥物，每組20枚胚胎，重復3次，統計感染后7 d內AB斑馬魚胚胎生存率，生存曲線如圖3，5 d后感染模型組死亡率為80%；斑馬魚的死亡率和給藥濃度成反比，慶大霉素C1a的治療效果略差于相同濃度的ETM。當ETM給藥濃度4 mmol/L時，感染5 d后死亡率降低至14%，與模型組相比死亡率顯著降低（Plt;0.05）。鑒于更高濃度下（8及16 mmol/L），斑馬魚胚胎發育出現軀干彎曲等異常，故選取4 mmol/L的ETM用于進一步的藥效及體內免疫調節研究。

2.2.2 斑馬魚體內細菌清除情況

給予感染斑馬魚4 mmol/L的藥物，于0、6及24 hpi測定體內活菌數，觀測細菌熒光分布并統計相應的熒光強度，結果如圖4。由圖可見，隨著胚胎發育，模型組斑馬魚體內的細菌數近乎指數式增加，而ETM給藥組斑馬魚體內活菌計數相比于模型組均顯著減少（Plt;0.05）。心包部位紅色熒光細菌明顯減少，體內紅色熒光強度也于24 hpi時顯著降低（Plt;0.01）。

2.3 依替米星對感染斑馬魚中性粒細胞的影響

機體被細菌感染時，中性粒細胞作為第一道防線，發揮重要的防御作用。然而在嚴重炎癥反應時，中性粒細胞抗菌能力會降低，并出現中性粒細胞介導的免疫抑制。為了進一步考察依替米星對斑馬魚體內作用除與其抗菌作用直接相關外，是否還與宿主免疫系統相互作用有關，用熒光標記中性粒細胞的轉基因斑馬魚系實時可視化觀察中性粒細胞對細菌感染及藥物的反應。即用BL21-RFP菌株感染Tg（mpx： GFP）斑馬魚胚胎，2 hpi于顧維爾氏管注射

4 mmol/L ETM，考察中性粒細胞的增殖、趨化和脫顆粒作用。

2.3.1 依替米星對感染斑馬魚中性粒細胞增殖的影響

使用流式細胞儀對24 hpi時斑馬魚體內綠色熒光中性粒細胞數統計可知，單獨注射ETM對健康斑馬魚體內中性粒細胞數的影響較小（圖5）；相比無感染的空白對照組（Blank組）及溶劑對照組（Control組），感染斑馬魚體內中性粒細胞數顯著增加，約為對照組的1.8倍，而ETM處理后，中性粒細胞數有降低的趨勢（Pgt;0.05），但不顯著。

2.3.2 依替米星對感染斑馬魚中性粒細胞趨化作用的影響

BL21-RFP菌株感染Tg（mpx：GFP）斑馬魚胚胎后，2 hpi于顧維爾氏管注射4 mmol/L ETM治療，分別于6、24和48 hpi通過熒光顯微鏡動態觀察給藥后中性粒細胞的分布情況，并通過分級（“+”至“+++”代表向心包部位聚集程度逐級增加）進行定量統計分析。由圖6A～6B可見，感染模型組斑馬魚體內中性粒細胞自6 hpi（心包部位中性粒細胞聚集程度“+++”占比55.6%）至24 hpi（聚集程度“+++”占比66.7%）迅速向感染部位遷移，48 hpi時心包腔破裂（圖6A紅框部位，聚集程度“+++”占比61.1%），說明感染后，機體立即啟動第一道免疫防線中性粒細胞，并快速趨化至感染部位；而ETM治療組斑馬魚中性粒細胞向感染處遷移數量比模型組少，24 hpi時心包部位聚集程度“+++”的斑馬魚占比16.7%，為感染組的1/4，且在48 hpi時大部分中性粒細胞已回遷至全身血流。

白介素-8（IL-8）是促進中性粒細胞趨化及激活的關鍵細胞因子[9]，本研究對24 hpi時斑馬魚體內的IL-8轉錄水平進行測定，如圖6C可見，相比對照組，IL-8在感染模型組與給藥組斑馬魚體內轉錄水平均有提高，但給藥組的轉錄水平相對感染組顯著降低，為感染組的1/3。結合圖6A熒光顯微成像結果，提示24 hpi時感染組斑馬魚體內存在中性粒細胞過度趨化現象，而ETM藥物治療后可明顯緩解這一作用。

2.3.3 依替米星對感染斑馬魚中性粒細胞脫粒活化的影響

哺乳動物中性粒細胞在吞噬微生物后，會釋放殺滅微生物的顆粒至吞噬小體中，該過程稱為脫顆粒[10]。斑馬魚被細菌感染后，也會存在類似的活化反應[11]。本研究于10 hpi對Tg（mpx： GFP） 斑馬魚進行蘇丹黑染色，統計其心包附近的脫顆粒中性粒細胞（即蘇丹黑染色陰性的中性粒細胞）占總數比例（圖7A）。如圖7B所示，感染組脫顆粒中性粒細胞占比顯著上升，是對照組的4倍，而ETM治療組有降低中性粒細胞脫粒活化的趨勢（Pgt;0.05），但不顯著。

3 討論

一般認為，抗生素的主要作用是直接抑制或殺菌作用。然而，也有研究表明，抗生素還可與宿主先天免疫系統相互作用，刺激中性粒細胞等免疫細胞活化，從而加快細菌清除率，如大環內酯類抗生素可誘導形成含有抗菌肽和組蛋白的中性粒細胞胞外誘捕網（NET）誘捕細菌[12]。而當細菌感染嚴重時，體內中性粒細胞快速向感染部位募集發揮吞噬和殺傷病原菌功能的同時，也會釋放系列炎癥介質引起炎癥反應，炎癥反應過度則會引起機體的細胞損傷。因此，在治療細菌感染的同時，控制炎癥反應也很關鍵。已報道有些抗生素如萬古霉素和達托霉素，即可通過抑制中性粒細胞的功能，從而抑制過激免疫反應[13]。因此，選擇合適的抗生素，并能保持合適的抗菌作用與解除中性粒細胞的免疫抑制是抗感染治療的方向。

本研究中，依替米星本身對未感染斑馬魚的中性粒細胞數量和趨化作用及脫顆粒作用無顯著影響。但當感染發生時，模型組中性粒細胞向感染的心包部位迅速募集，48 hpi時可能由于炎癥反應過度心包破裂，而依替米星可顯著抑制中性粒細胞的趨化及趨化因子IL-8的表達，也可降低斑馬魚體內中性粒細胞數和脫粒比例，避免過度炎癥炎癥反應導致的機體損傷。這跟另一氨基糖苷類藥物慶大霉素通過抑制感染細胞中性粒細胞胞外殺菌網釋放，從而抑制中性粒細胞功能一致[4]。細菌感染過程中，中性粒細胞的作用是一把“雙刃劍”。本實驗條件下，斑馬魚細菌感染較重，而輕癥感染條件下，依替米星對機體的免疫調節作用是否一致，仍需進一步研究。

參 考 文 獻

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