89株紋帶棒狀桿菌耐藥性及其耐藥基因特征分析

摘要：目的 通過分析河北省華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院臨床分離的紋帶棒狀桿菌的耐藥性和基因組特征，為臨床鑒別、治療和防控提供參考。方法 收集并鑒定臨床分離非重復(fù)紋帶棒狀桿菌89株。經(jīng)VITEK2-Compact全自動細菌儀聯(lián)合16S rRNA鑒定為紋帶棒狀桿菌，采用微量肉湯稀釋法進行體外藥敏試驗，使用全基因組測序技術(shù)進行測序。結(jié)果 藥敏結(jié)果顯示所有菌株對利奈唑胺及萬古霉素都表現(xiàn)為敏感，對環(huán)丙沙星（89， 100.0%）全部耐藥；全基因組測序共檢出identity在90%以上耐藥基因16種，大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類耐藥基因和耐藥表型匹配度較高；在基因組水平上，紋帶棒狀桿菌的傳播具有優(yōu)勢克隆群。結(jié)論 該院分離的紋帶棒狀桿菌同時攜帶多種抗菌藥物的耐藥基因，其某些耐藥表型和耐藥基因型具有一致性。該院紋帶棒狀桿菌院內(nèi)傳播由于優(yōu)勢克隆群的存在，菌株在進化過程中能通過耐藥基因的獲得及累積而產(chǎn)生不同的克隆群。

關(guān)鍵詞：紋帶棒狀桿菌；耐藥性；耐藥基因；全基因組

中圖分類號：R446.5 文獻標志碼：A

Analysis of drug resistance and gene characteristics

of 89 strains of Corynebacterium striatum

Xue Jia-qi1， Wang Xue-bing2， Cui Yao2， Ma Xiao-han2， Xing Huan1， Wang Na1， Liu Ze-liang1， Duan Li-ke1，

Shi Qi-yuan1， Zhou Jun-chen1， Li Juan2， Zhou Hai-jian2， and Dong Ai-ying1

（1 North China University of Science and Technology Affiliated Hospital， Tangshan 063000;

2 State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control， Chinese Center for Disease Control and Prevention，

National Institute for Communicable Disease Control and Prevention， Beijing 102206）

Abstract Objective The drug resistance and genomic characteristics of Corynebacterium striatum isolated from the North China University of Science and Technology Affiliated Hospital in Hebei Province were analyzed to provide references for clinical identification， treatment， prevention， and control. Methods Eighty-nine clinically isolated strains of non-repeating Corynebacterium striatum were collected and identified. Corynebacterium striatum was identified by VITEK2-Compact automatic bacterial instrument combined with 16S rRNA. In vitro drug sensitivity test was performed by the broth dilution method， and whole genome sequencing technology was used for sequencing. Results All strains were sensitive to linezolid and vancomycin， and resistant to ciprofloxacin （89， 100.0%）. A total of 16 drug resistance genes with identity above 90% were detected by whole-genome sequencing， and the drug resistance genes of macrolides and aminoglycosides had a high matching degree with drug resistance phenotypes. At the genomic level， the spread of Corynebacterium striatum had dominant clonal populations. Conclusion Corynebacterium striatum isolated from our hospital carried multiple antibiotic resistance genes simultaneously， and its drug resistance phenotype and drug resistance genotype were highly consistent. Due to the existence of dominant clonal groups， corynebacterium striatum could produce different clonal groups through the acquisition and accumulation of drug resistance genes in the process of evolution.

Key words Corynebacterium striatum; Drug resistance; Drug resistance gene; Whole-genome sequencing

近年來，紋帶棒狀桿菌導(dǎo)致臨床感染的病例屢見不鮮[1-6]，且多為重癥感染甚至危及生命[7]。紋帶棒狀桿菌嚴重的耐藥現(xiàn)象[8]導(dǎo)致患者病程久治不愈，繼發(fā)性呼吸道感染性疾病患率增高[9]。紋帶棒狀桿菌作為一種潛在的院內(nèi)感染菌逐漸走進臨床工作人員的視野[2]。目前對紋帶棒狀桿菌全基因組特征的研究比較少。本研究對89株紋帶棒狀桿菌進行全基因組測序和分析，同時開展耐藥性檢測，對紋帶棒狀桿菌開展耐藥性和種群結(jié)構(gòu)分析。

1 材料方法

1.1 菌株來源

菌株共計89株，全部為紋帶棒狀桿菌臨床分離株，來自河北省唐山市華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院。其中包括2017年10月至2018年1月期間分離的57株，2020年1月至2021年5月期間的32株。

所有納入本研究的紋帶棒狀桿菌判定為致病菌標準：①涂片鏡檢[10-11]：同一患者多份呼吸道標本中檢出同一耐藥表型的紋帶棒狀桿菌經(jīng)革蘭染色直接鏡檢觀察到白細胞吞噬的紋帶棒狀桿菌且每高倍視野白細胞大于30個；②炎癥指標[12]：PCT≥0.5 ng/mL，

或C-反應(yīng)蛋白≥10 mg/L，或WBCgt;10×109/L或WBClt;4×109/L；③臨床癥狀[12]：患者有體溫升高、肺部啰音、胸痛等感染癥狀。依據(jù)藥敏結(jié)果抗菌治療有效；④影像學(xué)指標[13]：胸部X線或CT顯示新出現(xiàn)或進展性的浸潤影、實變影、磨玻璃影。⑤從無菌體液分離到紋帶棒狀桿菌且患者出現(xiàn)發(fā)熱等感染性的臨床癥狀；從尿液標本中分離棒狀桿菌，經(jīng)培養(yǎng)菌落總計數(shù)大于104 CFU/mL。⑥導(dǎo)管尖端分離出的紋帶棒狀桿菌需同時在血培養(yǎng)中檢測出來判為致病。

所有菌株均同VITEK2-Compact全自動細菌鑒定儀和16S rRNA基因測序?qū)Ρ辱b定為紋帶棒狀桿菌。剔除同一感染部位同一患者的重復(fù)菌株。

1.2 全基因組測序

用細菌基因組DNA提取試劑盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit、Promaga公司，美國）提取待測菌株DNA。將所提基因組DNA通過高通量測序（Illumina NovaSeq PE150測序平臺）得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)EDATABOX高性能生物計算工業(yè)一體機拼接成FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲。

1.3 基因組分析

1.3.1 耐藥基因檢索

使用CARD數(shù)據(jù)庫（The Comprehensive Antibiotic Research Database），上傳FASTA序列文件，用RGI

（Resistance Gene Identifier）軟件該數(shù)據(jù)庫目標物種的氨基酸序列與CARD數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)RGI的比對結(jié)果，得到106株紋帶棒狀桿菌攜帶的所有耐藥基因，統(tǒng)計identity在90%以上的注釋到數(shù)據(jù)庫的抗性基因信息。

1.3.2 進化樹構(gòu)建

使用Snippy 2.6（https：//github.com/tseemann/Snippy）和kSNP 3.0[14]鑒定核心單核苷酸多態(tài)性（SNP）。用Burrow-Wheelers aligner[15]和Samtools1.3.1[16]比對不同菌株基因組序列，并使用FreeBayes識別比對中的差異。kSNP分析菌株基因組以及參考基因組C.striatum KC-NA-01（GenBank assembly accession：GCA_00256805.1）。使用內(nèi)部Python腳本確定通過kSNP識別的所有SNP的讀取覆蓋率，用Snippy將每個菌株與參考基因組進行比對。選擇SNP讀取深度＞10，每個SNP的一致性＞90%。使用單核苷酸多態(tài)性在參考基因組上的位置來確定這兩種方法是否都識別了單核苷酸多態(tài)性（在線技術(shù)，https：//wwwnc.cdc.gov/EID/article/23/6/16-1934Techapp1.pdf）。該方法鑒定了89株紋帶棒狀桿菌共有的93，492個核心SNP。

使用RAxML8.2.4[17]根據(jù)89株菌的93492個核心SNP使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用EvolView2[18]可視化和編輯該樹。使用SplitsTree[19]構(gòu)建了89個紋帶棒狀桿菌的NeighborNet樹。

1.4 耐藥性檢測

采用微量肉湯稀釋法，該方法源自美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦，是科研和臨床工作中行之有效的方法。根據(jù)抗生素選擇原則，選擇11類12種抗生素（青霉素PEN、頭孢噻肟CTX、美羅培南MEM、慶大霉素GEN、紅霉素ERY、環(huán)丙沙星CIP、多西環(huán)素DOX、四環(huán)素TET、克林霉素CLI、利福平RIF、萬古霉素VAN、利奈唑胺LZD）。慶大霉素和環(huán)丙沙星采用ATCC25922質(zhì)控菌株，其他藥物采用ATCC49619質(zhì)控菌株。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 89株紋帶棒狀桿菌來源分布

89株紋帶棒狀桿菌主要集中在重癥監(jiān)護病房（48，53.93%）和神經(jīng)外科病房（28，31.46%）。由于收集菌株過程中出現(xiàn)中斷，所以根據(jù)時間連續(xù)性將89株菌株分為兩組。第一組2017年12月檢出的紋帶棒狀桿菌最多（25，43.85%），其中重癥監(jiān)護病房（9株）和神經(jīng)外科病房（10株）檢出最多。紋帶棒狀桿菌在2017年11月（12，21.05%）和2018年1月（14，24.56%）的檢出量次之；第二組在2021年5月（13，40.63%）和2020年7月（12，37.5%）兩個月中紋帶棒狀桿菌檢出量最多，主要也是集中在重癥監(jiān)護病房（9，8）和神經(jīng)外科病房（8，3）。紋帶棒狀桿菌主要標本來源為深部痰標本（81，91.01%），有4株分離自導(dǎo)管尖端，灌洗液、腦脊液、胸水、尿液各1株。

2.2 耐藥性和耐藥基因分析

2.2.1 耐藥基因分析（圖1）

從基因組檢索的identity在90%以上基因有16種，其中四環(huán)素類耐藥基因有3種，tet（W/N/W）基因（28，31.5%），Corynebacterium striatum tetA基因（25，29.2%）、tet44基因（16，17.9%）；氨基糖苷類耐藥基因有8種，APH（6）-Id基因（71，79.8%）、APH（3''）-Ib基因（51，57.3%）、APH（3'）-Ia基因（39，43.8%）、AAC（6'）-Ib10基因（34，38.2%）、AAC（6'）-Ia基因（5，5.6%）、aadA基因（5，5.6%）、adA21基因（3，3.4%）、aAAC（6'）-Ib3基因（2，2.2%），氯霉素耐藥基因cmx（62，69.7%），大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ErmX（70，78.7%），磺胺類抗生素sul1（44，49.4%）；兩組耐藥基因進行統(tǒng)計學(xué)分析，tet（W/N/W）、tet44、AAC（6'）-Ia、AAC（6'）-Ib10、aadA、APH（3''）-Ib、APH（3'）-Ia等基因P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2.2 耐藥表型分析

參考EUCAST 2021關(guān)于Corynebacterium spp.折點判讀標準[20]，對89株紋帶棒狀桿菌的體外藥敏耐藥性進行統(tǒng)計分析。89株紋帶棒狀桿菌分為10種耐藥表型（表1），其中菌株含量最多的抗菌藥物耐藥表型為MEM-CLI-RIF-CTX-GEN-CIP-ERY-PEN最多（33株菌），其次為MEM-CLI-TET-DOX-CTX-GEN-CIP-ERY-PEN（28株菌）。在本研究中，89株紋帶棒狀對利奈唑胺及萬古霉素都表現(xiàn)為敏感，所有菌株對環(huán)丙沙星全部耐藥，其次為頭孢噻肟（87，97.7%）、美羅培南、克林霉素、紅霉素和青霉素的耐藥率相同（85，95.5%）、慶大霉素（74，83.1%）。97.75%（87/89）的菌株的耐藥表型顯示對3種或3種以上抗菌藥物耐藥，表現(xiàn)出多重耐藥的特征。第二組與第一組相比，除利福平和慶大霉素的耐藥率降低外，其余10種抗菌藥物的耐藥率都有所增加。

2.2.3 耐藥基因和耐藥表型的匹配情況

從基因組檢索的identity在90%以上的耐藥基因與耐藥表型相匹配，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和耐藥表型匹配度最高（92.1%），其次是氨基糖苷類（78.7%），四環(huán)素類耐藥基因與耐藥表型的匹配度只有46%（表2）。

為了探究紋帶棒狀桿菌耐藥基因與耐藥表型匹配的一致性，將菌株的MIC值的分布與耐藥基因的分布情況進行對比，如圖2所示。同是四環(huán)素類抗生素，四環(huán)素與多西環(huán)素的MIC值分布與其攜帶的耐藥基因情況卻不一致。四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素與慶大霉素4種抗生素都存在MIC值在敏感范圍卻有耐藥基因的情況。

2.3 種群結(jié)構(gòu)分析

通過與參考序列C. striatum KC-Na-01進行對比，89株紋帶棒狀桿菌核心基因組中共有93492個SNP。從系統(tǒng)進化樹中可以看出，89株紋帶棒狀桿菌可以分為4個主要的分支。其中cladeB是最大的分支，有38株菌；其次為cladeD，有23株菌；cladeC和cladeA分別有16株及12株菌。系統(tǒng)進化表明，擁有相同PFGE型別的菌株同屬相同的進化分支。最大的3個優(yōu)勢PFGE型別的菌株都在cladeB的進化分支中。結(jié)合進化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)菌株的耐藥表型也同樣存在聚集現(xiàn)象。cladeB菌株出現(xiàn)了聚集性的對利福平耐藥的情況。cladeD與cladeC相比，對多西環(huán)素耐藥的菌株逐漸減少，tet44基因檢出也逐漸減少，tet（W/N/W）基因和tetA基因的檢出比較相像，逐漸增多（圖3）。

89株紋帶棒狀桿菌菌株中，兩組菌株分布在四個克隆群中，第一組主要分布在cladeB中，第二結(jié)組主要分布在cladeD中。結(jié)合分離時間我們可以發(fā)現(xiàn)，克隆群在醫(yī)院中持續(xù)存在，并且隨著時間的變化，優(yōu)勢克隆群也由cladeB發(fā)展為cladeD（圖4）。

3 討論

紋帶棒狀桿菌今年來作為一種新興的多重耐藥菌，是潛在的院內(nèi)感染菌。在本研究中，臨床分離的紋帶棒狀桿菌主要來自于呼吸道標本（81，92.05%），提示臨床呼吸道感染應(yīng)為紋帶棒狀桿菌感染的重點防控部位。由于課題組自身的原因，菌株收集過程出現(xiàn)中斷，所以將89株紋帶棒狀桿菌菌株根據(jù)時間連續(xù)性分為兩組。兩組紋帶棒狀桿菌在時間和病房都有集中檢出的現(xiàn)象，主要存在重癥監(jiān)護病房和神經(jīng)外科病房。

89株紋帶棒狀桿菌均至少對1種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥。與Hahn以及Campanile等[2]曾經(jīng)報道的多重耐藥紋帶棒狀桿菌的結(jié)果相符。在本研究中，88株紋帶棒狀對利奈唑胺及萬古霉素都表現(xiàn)為敏感，所有菌株對環(huán)丙沙星全部耐藥，其次為頭孢噻肟，美羅培南、克林霉素、紅霉素和青霉素、慶大霉素，對利福平、四環(huán)素、多西環(huán)素的耐藥率在50%以下）。與Alibi等[21]報道的紋帶棒狀桿菌慶大霉素耐藥率低的結(jié)果不同，本研究對氨基糖苷類抗生素的敏感性并不好。第二組與第一組相比，除利福平和慶大霉素的耐藥率降低外，其余10種抗菌藥物的耐藥率都有所增加。提示臨床醫(yī)生治療紋帶棒狀桿菌感染時應(yīng)避開這些耐藥率比較高的抗菌藥物，使用萬古霉素和利奈唑胺。

全基因組測序共檢出identity在90%以上的耐藥基因16種，與耐藥表型做匹配分析發(fā)現(xiàn)，89株紋帶棒狀桿菌氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因與耐藥表型匹配度較高。細菌的耐藥性通常是由編碼基因決定的，所以在已知耐藥基因的情況下可以推斷耐藥表型，希望可以解決臨床培養(yǎng)時間長延誤患者治療的情況。但是進一步地分析發(fā)現(xiàn)，耐藥表型為敏感的菌株也可以攜帶耐藥基因，耐藥表型為中介或耐藥的菌株可能不攜帶耐藥基因。可能是因為紋帶棒狀桿菌的耐藥基因數(shù)據(jù)庫并不完善，并且細菌的耐藥機制有很多種，單單用基因推斷表型的誤差比較大，還需要進一步探索。

通過基因組測序分析，89株紋帶棒狀桿菌在進化樹中主要分為4個分支，這表明院內(nèi)紋帶棒狀桿菌的感染是由多個該病原菌的克隆群在院內(nèi)傳播導(dǎo)致的。cladeC和cladeD的菌株主要集中在重癥監(jiān)護病房和神經(jīng)外科病房。這就有可能是醫(yī)院內(nèi)獲得感染所導(dǎo)致的結(jié)果。推斷紋帶棒狀桿菌在重癥監(jiān)護病房和神經(jīng)外科病房的傳播途徑可能是通過病人與醫(yī)療工作者或患者之間或者經(jīng)過污染物以及環(huán)境來傳播[22]，具體的傳播途徑還需要進一步的研究來確認。不同克隆群一直在院內(nèi)存在，不同時間段克隆群出現(xiàn)遷移的現(xiàn)象。

綜上，對于長期入住ICU和神經(jīng)外科病房的患者，在呼吸道標本中反復(fù)分離出紋帶棒狀桿菌時，應(yīng)該引起醫(yī)護人員的重視。利用全基因組測序聯(lián)合分析紋帶棒狀桿菌的耐藥性，為臨床快速獲知細菌的耐藥情況提供新的工具。

參 考 文 獻

Werth B J， Hahn W O， Butler-wu S M， et al. Emergence of high-level daptomycin resistance in Corynebacterium striatum in two patients with left ventricular assist device infections[J]. Microb Drug Resist， 2015， 22（3）： 233-237.

Hahn W O， Werth B J， Butler-wu S M， et al. Multidrug-resistant Corynebacterium striatum associated with increased use of parenteral antimicrobial drugs[J]. Emerg Infect Dis， 2016， 22（11）： 1908-1914.

Renom F， Garau M， Rubí M， et al. Nosocomial outbreak of Corynebacterium striatum infection in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Clin Microbiol， 2007， 45（6）： 2064-2067.

Martín M C， Melón O， Celada M M， et al. Septicaemia due to Corynebacterium striatum： Molecular confirmation of entry via the skin[J]. J Med Microbiol， 2003， 52（Pt 7）： 599-602.

Fernández-ayala M， Nan D N， Fari?as M C. Vertebral osteomyelitis due to Corynebacterium striatum[J]. Am J Med. 2001， 111（2）： 167.

Moore K， Hall V， Paull A， et al. Surface bacteriology of venous leg ulcers and healing outcome[J]. J Clin Pathol， 2010， 63（9）： 830-834.

Navas J， Fernández-martínez M， Salas C， et al. Susceptibility to aminoglycosides and distribution of aph and aac（3）-xi genes among Corynebacterium striatum clinical isolates[J]. Plos One， 2016， 11（12）： e0167856.

Verroken A， Bauraing C， Deplano A， et al. Epidemiological investigation of a nosocomial outbreak of multidrug-resistant Corynebacterium striatum at One Belgian University Hospital[J]. Clin Microbiol Infect， 2013， 20（1）： 44-50.

Nhan T， Parienti J， Badiou G， et al. Microbiological investigation and clinical significance of Corynebacterium spp. in respiratory specimens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2012， 74（3）： 236-241.

孫敬， 陳會， 余理智， 等. 痰液培養(yǎng)定植菌與病原菌判斷方法的探討[J]. 江西醫(yī)學(xué)檢驗， 2006， （6）： 485-488.

Rea-neto A， Youssef N C M， Tuche F， et al. Diagnosis of ventilator-associated pneumonia： A systematic review of the literature[J]. Crit Care， 2008， 12（3）： 143-153.

于翠香， 王西艷. 《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機相關(guān)性肺炎診斷和治療指南（2018年版）》解讀[J]. 中國醫(yī)刊， 2021， 56（9）： 951-953.

Torres A， El-ebiary M， Padró L， et al. Validation of different techniques for the diagnosis of ventilator-associated pneumonia. Comparison with immediate postmortem pulmonary biopsy[J]. Am J Respir Crit Care Med， 1994， 149： 324-331.

Gardner S N， Slezak T， Hall B G. Ksnp3.0： Snp detection and phylogenetic analysis of genomes without genome alignment or reference genome[J]. Bioinformatics， 2015， 31（17）： 2877-2878.

Li H， Durbin R. Fast and accurate short read alignment with burrows-wheeler transform[J]. Bioinformatics， 2009， 25（14）： 1754-1760.

Li H. A statistical framework for snp calling， mutation discovery， association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data[J]. Bioinfor-matics， 2011， 27（21）： 2987-2993.

Stamatakis A. Raxml version 8： A tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies.[J]. Bioinformatics， 2014， 30（9）： 1312-1313.

He Z， Zhang H， Gao S， et al. Evolview V2： An online visualization and management tool for customized and annotated phylogenetic trees[J]. Nucleic Acids Res， 2016， 44（W1）： W236-241.

Huson D H， Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies[J]. Mol Biol Evol， 2006， 23（2）： 254-267.

李耘， 鄭波， 呂媛， 等. 中國細菌耐藥監(jiān)測研究2019-2020革蘭陽性菌監(jiān)測報告[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2022， 38（4）： 369-384.

Alibi S， Ferjani A， Boukadida J， et al. Occurrence of Corynebacterium striatum as an emerging antibiotic-resistant nosocomial pathogen in a Tunisian Hospital[J]. Sci Rep， 2017， 7（1）： 9704.

Lax S， Gilbert J A. Hospital-associated microbiota and implications for nosocomial infections.[J]. Trends Mol Med， 2015， 21（7）： 427-432.