二甲雙胍/多西環素復合微球的制備及其抗Ⅱ型糖尿病合并肺感染的初步研究

摘要：目的 制備二甲雙胍/多西環素復合微球（Met/DH-Ms）并優化處方及制備工藝，考察二甲雙胍與多西環素的體外協同抑菌作用，并探究復合微球對Ⅱ型糖尿病合并肺感染的治療效果。方法 采用W/O/W復乳法制備并優化二甲雙胍/多西環素復合微球，棋盤法評價二甲雙胍與多西環素的體外協同抑菌作用，建立Ⅱ型糖尿病合并耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）肺感染模型來評價復合微球在體內的治療作用。結果 制備的復合微球中二甲雙胍與多西環素的最佳包封率分別為 63.19%±2.97%、94.07%±3.55%，且球體圓整，大小均一；二甲雙胍能夠增加MRSA對多西環素的敏感性，復合微球能夠有效改善T2DM合并MRSA肺感染（T2DMamp;MRSA）小鼠的血糖升高、胰島素抵抗及肺部感染情況。 結論 成功制備二甲雙胍/多西環素復合微球并優化了其制備工藝，證實該制劑對T2DM合并MRSA肺感染有良好的治療效果。

關鍵詞：二甲雙胍；多西環素；微球；糖尿病；肺感染

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

A preliminary study on metformin/doxycycline composite microspheres against type 2 diabetes complicated with pulmonary infection

Su Yang1， Yang Ling1， Li Yuan-yuan1， Leng Rui-si1， Zhou Guang-hua2， and Li Chong1

（1 College of Pharmaceutical Sciences， Southwest University， Chongqing 400715;

2 Centers for Disease Control and Prevention， Beibei， Chongqing 400700）

Abstract Objective To prepare the metformin/doxycycline composite microspheres （Met/DH-Ms）， optimize the formulation and preparation process， investigate the synergistic bacteriostatic effect of metformin and doxycycline in vitro， and explore the therapeutic effect of composite microspheres on T2DM with lung infection. Methods Metformin/doxycycline composite microspheres were prepared and optimized by the W/O/W composite emulsion method. The synergistic antibacterial effect of metformin and doxycycline in vitro was evaluated by the checkerboard method. Then， the T2DMamp;MRSA model was established to evaluate the Met/DH-Ms in vivo. Results The better encapsulation efficiency of Met and DH were 63.19%±2.97% and 94.07%±3.55% respectively， and the spheres were round and uniform in size. Met can increase the sensitivity of MRSA to DH， and Met/DH-Ms can effectively improve the situation of elevated blood glucose， insulin resistance， and pulmonary infection in mice with T2DMamp;MRSA. Conclusion Met/DH-Ms were successfully prepared and their process was optimized. It was confirmed that the preparation had a good therapeutic effect on T2DMamp;MRSA lung infection.

Key words Metformin; Doxycycline; Microspheres; Diabetes; Lung infection

目前，糖尿病作為當今世界的多發病、常見病，已成為人類第五大死亡原因。由于糖尿病引起的患者組織修復能力與抵抗力降低，高糖的體內環境為病原菌提供了良好的生長場所，使得糖尿病患者病程中易被感染，最終造成糖尿病患者死亡。據報道[1-2]，糖尿病合并感染的發病率為32.7%～90.5%，肺部為其常見的感染部位之一。金黃色葡萄球菌是環境中廣泛分布的微生物，在人的體表、呼吸道均有金葡菌的定植，故而糖尿病患者肺部極易被金黃色葡萄球菌感染[3-5]。同時，糖尿病合并感染具有發病率高、病情重、不易控制的特點，易誘發高血糖危象而給患者生命健康帶來嚴重影響[6]。因此，若能將抗糖尿病藥物與抗感染藥物聯合，探索一種在治療糖尿病的同時還能控制并治療相關并發感染的復合制劑，對改善糖尿病患者生存質量、提升藥物綜合療效來說具有重要意義。

二甲雙胍（metformin，Met）是目前全球應用最廣泛的臨床一線降糖藥，其良好的療效及安全性已經得到充分證實，主要被用于治療非胰島素依賴型（II型）糖尿病。多西環素（doxycycline，DH）是以土霉素為原料研制的一種半合成廣譜四環類抗生素，主要用于治療敏感的革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌所致的呼吸道感染，肺炎、慢性支氣管炎、和泌尿系統感染等[7]。但對于較為嚴重的細菌感染或耐藥菌株感染，特別是金黃色葡萄球菌這種高頻率耐藥發生菌，單一用藥常常難以獲得較好的療效，故主張同時使用兩種及以上抗菌藥物進行治療，即抗菌藥物聯合治療。相關研究表明，二甲雙胍在一定濃度下對多種革蘭陽性和革蘭陰性細菌、真菌等均具有抗菌性能[8-10]。近年來，有研究人員發現其還能與多種抗生素聯用，降低細菌對現有抗生素的耐藥性，如二甲雙胍能夠使左氧氟沙星及氯霉素對MRSA的MIC分別從10 μmol/L和130 μmol/L降低至1 μmol/L和10.5 μmol/L[11]，可作為潛在輔助抗菌劑來對抗多藥耐藥細菌。因此，選用了經典抗生素多西環素與二甲雙胍聯用，設想二甲雙胍在治療糖尿病的同時能夠輔助并增強多西環素的抗菌效果，從而達到糖尿病與感染雙重治療目的。然而，二甲雙胍與多西環素具有高度水溶性，進入胃腸道后會迅速溶解，對胃腸道中的黏膜組織產生強烈刺激作用，本研究將其制成緩釋微球，能夠使藥物緩慢釋放，從而減少胃腸道副作用，延長作用時間。綜上所述，本文擬篩選出合適的二甲雙胍/多西環素復合微球制備處方，對其制備工藝進行對比優化，并評價其體內體外的聯用效果。

1 試劑與儀器

1.1 試劑與動物

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA，北碚區疾病預防控制中心）；鏈脲佐菌素（streptozotocin [STZ]，南京草本源生物科技有限公司）；高糖高脂飼料（35 kcal%高熱量飼料，重慶金喜鵲科技發展有限公司）； 鹽酸二甲雙胍（metformin [Met]，重慶葆光生物技術有限公司）；鹽酸多西環素（doxycycline hydrochloride [DH]，重慶阿米達生物技術有限公司）；乙基纖維素（ethyl cellulose [EC]，型號：M9，黏度：9.0 cPa·s，國藥集團化學試劑有限公司）；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol [PVA]，醇解度：87.0～89.0 mol%，黏度：20.5～24.5 mPa·s，上海阿拉丁試劑有限公司）；胰島素測定試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；昆明小鼠（SPF級，雄性，18～22 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。

1.2 儀器

TB-215電子分析天平（美國丹佛儀器公司）；JY92- II 超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XHF-D 高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RV10旋轉蒸發儀 （IKA， Germany）；BT-9300HT 型激光粒度分布儀（丹東百特儀器有限公司）；電熱恒溫培養箱DH-420（北京歐尼斯科技發展有限公司）；安穩免調碼血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 微球的制備[12-13]

精密稱取10 mg Met、1 mg DH和40 mg明膠，加適量蒸餾水，室溫放置使明膠溶脹，加熱攪拌溶解藥物，得內水相；另稱300 mg EC加 3 mL二氯甲烷使其完全溶解，得油相； 稱取適量PVA，加蒸餾水攪拌溶解，得外水相。將內水相加到油相中，探式超聲得初乳。所得初乳快速加入外水相中，高速剪切分散，得復乳。所得復乳溶液于37℃減壓旋蒸去除二氯甲烷，然后以8000 r/min的速度離心10 min，棄去上清液后，向沉淀中加入適量蒸餾水洗去微球表面的PVA，離心，室溫風干得到 Met /DH復合緩釋微球。

2.2 微球制備工藝優化

采用復乳法制備微球的影響因素較多，本文主要對內水相與油相比例、外水相濃度、復乳剪切速度進行單因素考察，以微球粒徑及兩種藥物的包封率為指標，篩選出較優制備工藝。

2.2.1 內水相與油相比例考察

按“2.1”項下方法制備微球，研究內水相與油相比例對微球的影響。分別選擇內水相與油相比例為1：20、1：30、1：40（V/V），以包封率、微球粒徑為指標，考察內水相與油相比例對微球質量的影響。

2.2.2 外水相PVA濃度考察

按“2.1”項下方法制備微球，在最佳內水相與油相比例的條件下，研究外水相PVA濃度對微球的影響。分別選擇PVA濃度為1%、2%和3%，以包封率、微球粒徑為指標，考察PVA濃度對微球質量的影響。

2.2.3 復乳剪切速度考察

按“2.1”項下方法制備微球，在內水相與油相比例、外水相PVA濃度最佳的條件下，進行復乳剪切速度考察。復乳剪切的速度分別為：6000 r/min→7500 r/min；5000 r/min→8000 r/min；6500 r/min→8000 r/min。剪切時間為：0.4 min→0.1 min。以包封率、微球粒徑為指標，考察復乳剪切速度對微球質量的影響。

2.3 微球的表征

2.3.1 粒徑的測定

取適量微球于離心管中，加入純水稀釋混勻，將所得微球混懸液溶液置于粒徑測定的樣品池內，然后使用激光粒度分析儀測定相應粒徑。

2.3.2 形貌表征

通過掃描電鏡來觀察復合微球的微觀表面形態。取干燥后的微球適量，輕輕涂在導電膠上，將微球的表面噴金使其帶上導電性用于掃描電鏡觀察，最后通過掃描電鏡對微球的形態和表面特征進行成像評價。

2.3.3 包封率測定

總藥物的測定：取1 mL旋蒸除去二氯甲烷后的制劑，加入1 mL乙醇，超聲溶解EC，再加1mL蒸餾水混勻，50℃～60℃加熱使明膠溶解，6000 r/min，15 min離心，取上清液進高效液相色譜儀測定；游離藥物的測定：取1 mL制劑，于6000 r/min離心15 min，取上清液加適量蒸餾水稀釋，同法測定藥物含量。

二甲雙胍色譜條件：色譜柱：CAPCELL PAK SCX UG80 S5（4.6 mm×150 mm， 5μm）；柱溫：40℃；檢測波長：233 nm；流速：1 mL/min；流動相：2.3% NH4H2PO4（pH 4.4）；進樣量：20 μL。

多西環素色譜條件：色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm；5 μm）；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；流動相：醋酸鹽緩沖液（0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.1 mol/L乙二胺四醋酸鈉-三乙胺[100： 10： 1]，用氨水調節pH至8.8）-乙腈（85：15）；進樣量：20 μL。

2.4 體外釋放[12，14-15]

稱取一定質量的微球，用1 mL人工胃液稀釋后放入透析袋中，將透析袋兩端扎緊，放入盛有30 mL人工胃液連蓋離心管中，將其置于恒溫氣浴振蕩器內（37℃±0.5℃），以100 r/min的轉速振搖，投入樣品后計時開始，分別于0.2、0.5、1和2 h取樣2 mL，并立即補足相應釋放介質，2 h后將透析袋轉至同等體積的人工腸液中繼續振搖，于3、4、6、8、10、12、24、36、48和72 h取樣并補足釋放介質。采用雙波長紫外分光光度法分別在280 nm及233 nm測定吸光度，其中280 nm測定結果為DH吸光度，Met在此波段無吸收；233 nm處DH與Met吸收重疊，但多西環素在此波長處與280 nm波長處具有等吸收點，因此233 nm吸光度減去280 nm吸光度，得Met吸光度，即可計算Met含量。最后計算累積釋放率，并繪制累積釋放曲線。

累積釋放率計算公式如下：

累積釋藥量（Qn）=Cn×V0+（C1+C2+C3+…+Cn-1）×V

其中：Qn表示第n個取樣點的累積釋藥量；Cn表示第n個取樣點的藥物濃度；V0表示釋放介質的總體積；V表示每次取樣的體積。

2.5 體外抑菌實驗

采用棋盤法進行測定。每孔菌濃度為1×107 CFU/mL，藥物A（Met）沿著橫坐標稀釋，藥物B（DH）沿著縱坐標稀釋。即表1中數據從右到左表示藥物A（Met）的濃度逐漸降低，數據從上到下表示藥物B（DH）的濃度逐漸降低。同時設置陰性對照（只加培養基），陽性對照（加菌液+培養基），如表1：32/10表示DH濃度為32 μg/mL，Met濃度為10 mg/mL。各孔加好后，于37℃恒溫培養箱中培養24 h，用酶標儀測定A600，兩藥協同指數用FIC指數（FIC index， FICI）表示，FICI= MICab /MICa + MICba /MICb =FICa +FICb，其中MICa是抗菌藥物A單獨的MIC，MICab是抗菌藥物A與B組合的MIC，MICb是抗菌藥物B單獨的MIC，MICba是抗菌藥物B與A組合的MIC。FICa 是抗菌藥物A的FIC指數，FICb是抗菌藥物B的FIC指數，協同作用定義為FICI≤0.5。

2.6 模型的建立

2.6.1 Ⅱ型糖尿病模型（T2DM）的建立

SPF級的6周齡雄性小鼠，體重（25±2） g。實驗小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。分籠飼養，濕度55.1%，溫度22.6℃，12 h晝夜循環。所有有關動物的實驗過程均在西南大學藥學院動物實驗中心的監督、指導下完成，符合實驗動物倫理學要求。

將小鼠隨機分為模型組和對照組，模型組飼喂高熱量飼料4周，然后連續3 d按40 mg/kg腹腔注射1% STZ檸檬酸鹽緩沖液；對照組飼喂普通飼料4周，連續3 d注射檸檬酸鹽緩沖液，配好的STZ溶液在5 min中內注射完畢，并時刻置于冰水浴中備用（每次注射前均禁食12～16 h）。注射完成一周后，測量小鼠空腹血糖（fasting blood-glucose， FBG），以FBG≥11.1 mmol/L并持續一周作為造模成功標準[16-17]。

2.6.2 T2DM合并MRSA肺感染模型（T2DMamp;MRSA）建立

挑取復蘇好的MRSA單菌落于滅菌的MH液體培養基中37℃振蕩培養12～16 h，完成后5000 r/min離心5 min，經PBS重懸，備用。選取成功建立的糖尿病模型小鼠，體質量在45 g左右，血糖在20～25 mmol/L之間，小鼠腹腔注射70 μL10%水合氯醛，待麻醉后吸取50 μL菌液（細菌數量為1×108 CFUs）緩緩滴入一側鼻孔中，造模24 h后開始給藥。

2.7 藥效實驗

將T2DMamp;MRSA小鼠隨機分為4組：①模型組（T2DMamp;MRSA）；②二甲雙胍微球組（Met-Ms）；③ 多西環素微球組（DH-Ms）；④ 復合微球組（Met/DH-Ms）；另增設空白對照組（Control）。其中，模型組與空白對照組灌胃生理鹽水，其余各治療組的Met或DH灌胃劑量分別為60 mg/kg和10 mg/kg，每天一次，連續給藥3周。分別在0周（開始給藥）、1周、2周、3周時測定各組小鼠的體重及空腹血糖。一個月給藥完成后，小鼠禁食12 h但不禁水，然后眼球取小鼠全血，于4℃下10000 r/min離心10 min，取上清按照胰島素測定試劑盒說明書測定小鼠空腹胰島素（Fasting insulin，FINS）。另外，根據文獻方法[18]計算胰島素抵抗評價指數（HOMA-IR）。

取全血后，對小鼠進行解剖，取其肺部進行稱重，按照3 mL/g tissue加入無菌PBS，勻漿，隨后稀釋到適宜倍數，取30 μL涂在MH固體平板上，37℃恒溫培養24 h后，對平板上的菌落進行計數。

3 結果與討論

3.1 微球的制備與優化

3.1.1 內水相與油相比例考察

結果如表2，研究內水相與油相比例對微球的影響，分別選擇內水相與油相比例為1：20、1：30、1：40，當內水相與油相的體積比為1：40時，二甲雙胍、多西環素有最佳包封率，粒徑為（10.06±0.82） μm，微球粒徑分布較均勻，綜合考慮選擇內水相與油相較優比例為1：40。

3.1.2 外水相PVA濃度考察

結果如表3，以內水相與油相比例1：40為前提，研究外水相PVA濃度對微球的影響。分別選擇PVA濃度為1%、2%和3%，當外水相PVA濃度為1%時，微球對二甲雙胍及多西環素有較佳包封率43.38%±3.12%及90.67%±1.85%，微球粒徑為（11.23±0.93） μm；而當外水相PVA濃度為2%和3%時，粒徑相較于1%更小，但Met包封率均較低，因此選擇外水相PVA較優濃度為1%。

3.1.3 復乳剪切速度考察

在內水相與油相比例為1：40，PVA濃度為1%的條件下，考察制備復乳時剪切速度變化對Met/DH微球粒徑與包封率的影響。結果如表4所示，當剪切速度為5000 r/min→8000 r/min，剪切時間為0.4 min→" " 0.1 min時，Met及DH均有較佳的包封率，且微球粒徑較均勻，微球沉積速度較慢，選擇該參數為較優復乳剪切速度。

綜上所述，Met/DH-Ms較優制備工藝為內水相與油相比例1：40、外水相PVA濃度1%、復乳剪切速度5000 r/min→8000 r/min，剪切時間0.4 min→ 0.1 min，該工藝制備得到復合微球中Met的包封率為63.19%±2.97%，DH的包封率為94.07%±3.55%。將干燥后的復合微球使用激光粒度分布儀進行粒徑的測定。結果如圖1A所示，制備得到的Met/DH-Ms粒徑為（11.73±2.22） μm，且粒徑分布集中均一。另外，圖1B顯示了掃描電鏡下微球的形態，由圖可看出，所得復合微球呈比較規則的球形，大小較為均一，球體圓整，且表面較為致密，無裂縫。

3.2 體外釋放

通過動態透析法測定Met/DH-Ms的體外釋放情況，制劑體外累積釋放率如圖2所示。前2 h在人工胃液中，復合微球中的Met及DH累積釋放度均在30%以下，在胃液中釋放度較低，表明復合微球在胃液中具備一定的穩定性；2 h后將其轉移到人工腸液，24～72 h累積釋放度均達到80%及以上。Met/DH-Ms顯示出一定的緩釋效果，可能是乙基纖維素形成了一個物理屏障，延緩了Met和DH的釋放。Met/DH-Ms的緩釋作用一定程度上能夠減少藥物在體內遞送過程中的滲漏和藥物釋放過快引起的不良反應。

3.3 體外抑菌實驗

Met與DH聯用對MRSA的藥敏試驗如表5及圖3所示，0.6～2.5 mg/mL 的Met與DH聯用時最小能使DH的MIC降至1 μg/mL，此區間FICI先減小后增大，均小于0.5，對MRSA表現出明顯的協同抗菌作用。在Met濃度為1.25 mg/mL時，DH的MIC值為2 μg/mL，此時FICI最小，兩者協同作用最佳，同時證明了Met能夠增加MRSA對DH的敏感性，提高DH抑菌效果。

3.4 動物模型的建立

3.4.1 一般狀態觀察

對照組小鼠在整個過程中攝食飲水量和尿量保持相對穩定，小鼠毛發光澤，精神狀態良好；而模型組小鼠在注射STZ 2周后出現多飲、多食和多尿情況，后期出現毛發稀疏，粗糙，欠光澤等現象。

3.4.2 小鼠造模前后體重、血糖的變化

體重變化結果如表6及圖4A，對照組小鼠體重在整個過程中呈緩慢上升趨勢，但由于高糖高脂飼料的飼喂，模型組小鼠在注射STZ前與注射STZ后1周小鼠體質量均顯著高于對照組，而由于糖尿病的發生發展，模型組小鼠在2～7周時體重下降明顯，且在第7周時顯著低于對照組。

血糖變化如表7及圖4B，模型組小鼠注射STZ后血糖明顯上升，與同期對照組相比差異顯著。模型組注射STZ后1～2周血糖一直呈上升趨勢，而在2～7周期間血糖基本平穩，表明在STZ注射兩周后，小鼠血糖基本達到穩定，可用于進行后續相關實驗。

3.5 Met/DH-Ms治療T2DM合并MRSA肺感染效果評價

3.5.1 體重變化

結果如表8及圖5，如前所述，對照組小鼠體重0～3周期間呈緩慢上升趨勢，但由于高糖高脂飼料的飼喂，糖尿病小鼠在初期的體質量顯著高于對照組；造模后，除對照組小鼠外，其余小鼠體重均呈下降趨勢，3組給藥組小鼠下降速度均緩于T2DMamp;MRSA組。其中，DH-Ms與Met-Ms組小鼠體重變化速度相似，這可能是因為兩組分別對肺感染和糖尿病有改善作用；而Met/DH-Ms組小鼠體重變化最小，可能是由于該制劑同時治療了糖尿病與肺感染，初步證明了Met/DH-Ms對T2DMamp;MRSA小鼠有較好的治療效果。

3.5.2 血糖變化

結果如表9及圖6，各組糖尿病合并肺感染小鼠初期血糖均顯著高于對照組，在給藥1周后，Met-Ms與Met/DH-Ms兩組血糖就顯示出明顯低于模型組，隨著治療時間的延長，這兩組小鼠的血糖一直在緩慢下降，而DH-Ms則未顯示出對糖尿病有治療作用。

3.5.3 FINS與HOMA-IR

如表10及圖7所示，模型組小鼠與對照組小鼠相比，FINS和HOMA-IR值顯著增加；Met-Ms與Met/DH-Ms較模型組小鼠 FINS及HOMA-IR水平顯著減少，差異具有統計學意義，說明Met-Ms與Met/DH-Ms能夠降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血清胰島素水平，改善該疾病的胰島素抵抗情況；DH-Ms與模型組小鼠的FINS 水平及HOMA-IR值相比無顯著性差異。

3.5.4 肺部菌落負荷

在給藥30 d后，小鼠肺組織內菌落的生長數量統計如表11及圖8所示。從菌落生長情況可知除Met-Ms組外，其余治療組的細菌生長數量明顯少于未治療組，其中療效最佳的為Met/DH復合微球，未治療組的細菌負荷量約為 （5.25±0.24）Lg CFU/克組織，而Met/DH復合微球細菌負荷量僅為（3.37±0.15）Lg CFU/克組織，比未治療組的細菌負荷量少兩個數量級，證明Met/DH復合微球對糖尿病小鼠的肺部MRSA感染具有較好的療效且優于DH-Ms單用時的效果。

4 結論

本文設計并制備了Met/DH復合微球，對其制備處方及工藝進行優化，最終得出：內水相與油相比例1：40、PVA濃度1%、復乳剪切速5000 r/min→8000 r/min，剪切時間0.4 min→0.1 min時制備Met/DH-Ms，可得到Met與DH包封率均較高，粒徑較好且分布均勻的復合微球。另外，通過棋盤法考察了Met與DH在體外聯用時的協同抑菌效果，結果表明，在Met濃度為1.25 mg/mL時，DH的MIC值為2 μg/mL，此時FICI最小，兩者協同作用最佳，Met可以提高MRSA對DH的敏感性。最后，通過建立T2DM合并MRSA肺感染小鼠模型，來模擬Ⅱ型糖尿病患者病程中發生的感染情況，灌胃Met/DH-Ms后，小鼠的血糖升高、胰島素抵抗及肺部感染情況得到明顯改善。綜上，本研究成功制備了Met/DH復合微球，驗證了Met與DH在體外具有顯著的協同抑菌作用，并證實Met/DH復合微球對T2DM合并MRSA肺感染有良好的治療效果。

參 考 文 獻

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