弗氏鏈霉菌泰樂菌素還原酶基因編輯及其對泰樂菌素發酵產物的影響

摘要：目的 對弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）泰樂菌素還原酶（tylosin reductase，SFR）進行改造以抑制其對泰樂菌素（tylosin）的還原作用，提高泰樂菌素發酵產量和產品質量。方法 在前期對泰樂菌素還原酶編碼基因第642位堿基進行定點突變形成終止密碼子的基礎上，對該基因642位后堿基進行敲除；對基因敲除菌株的生長以及發酵產物中泰樂菌素（A組分）和雷諾菌素（relomycin，D組分）含量進行分析。結果 獲得了泰樂菌素還原酶基因部分序列敲除的弗氏鏈霉菌菌株M1-d1；該菌株培養過程中生長狀態及穩定期生物量與原始菌株基本一致，菌落形態正常；泰樂菌素發酵產物中敲除菌株A組分相對含量較原始菌株相比增加了10.08%，而D組分相對含量較原始菌株減少68.75%。結論 弗氏鏈霉菌泰樂菌素還原酶基因部分序列敲除不影響菌體正常生長，但能夠抑制泰樂菌素還原酶對A組分的還原作用，提高泰樂菌素發酵產物中A組分含量，顯著降低D組分含量。

關鍵詞：弗式鏈霉菌；泰樂菌素還原酶；泰樂菌素；雷諾菌素

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Gene editing of tylosin reductase from Streptomyces fradiae and its effect on tylosin fermentation products

Jiang Yu-ting， Zhu Hui， Jia Chen-bo， Yue Si-jun， and Su Jian-yu

（Key Laboratory of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China， College of Life Sciences， Ningxia University， Yinchuan 750021）

Abstract Objective For the purpose of inhibiting reduction activity of tylosin reductase and improving yield and product quality in tylosin fermentation， the tylosin reductase of Streptomyces fradiae was modified in this study. Methods On the basis of a single base mutation of the 642th base in tylosin reductase gene that lead to forming a termination codon， the bases after the 642th position in the gene were knocked out. Then， the growth and fermentation of the gene knockout strains were performed. The contents of tylosin （A） and renomycin （D） in the product were analyzed. Results The Streptomyces fradiae strain M1-d1 with sequence knockout after the 642th base of tylosin reductase gene was obtained. The growth state and biomass in the stable phase of the strain were basically the same as the original strain， and the colony morphology was normal. Compared with the original strain， the relative content of component A in the knockout strain increased by 10.08%， while the relative content of component D in the fermentation product decreased by 68.75%. Conclusion The partial sequence knockout of tylosin reductase gene did not affect the growth of Streptomyces fradiae， but inhibited the tylosin reductase activity on component A. As a result， content of component A in tylosin fermentation product was increased while the component D was decreased significantly.

Key words Streptomyces fradiae; Tylosin reductase; Tylosin; Relomycin

泰樂菌素是Hamill等[1]于1960年從弗氏鏈霉菌培養物中提取分離出來的十六元大環內酯類抗生素。泰樂菌素對革蘭陽性菌、厭氧菌及支原體具有抑菌作用，用于治療牛肝膿腫[2]、豬鏈球菌病[3]以及雞鴨等家禽支原體感染疾病[4]。泰樂菌素的主要生產菌為弗氏鏈霉菌，又稱星海灣鏈霉菌（Streptomyces xinghaiensis）。弗氏鏈霉菌泰樂菌素發酵產物中含有泰樂菌素（A組分）、脫碳霉糖泰樂菌素（B組分）、大菌素（C組分）及雷諾菌素（D組分）等4種主要成分[5]。雖然4種組分均有一定抗菌活性，但其中活性最高的為A組分[6]，A組分的含量是衡量泰樂菌素發酵產品合格與否的標準之一[7]。4種組分中，脫碳霉糖泰樂菌素和大菌素是泰樂菌素合成的前體物質，而雷諾菌素是泰樂菌素的還原產物。在弗氏鏈霉菌的發酵過程中，當泰樂菌素大量積累時，部分泰樂菌素會在泰樂菌素還原酶的作用下被還原為雷諾菌素[8]。泰樂菌素還原酶隸屬于醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKRs）超家族，是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴型還原酶，具有廣泛的底物特異性[9]，可還原具有毒性的羰基化合物，也可將醛類轉化為無毒的醇類，以達到解毒的作用[10]。泰樂菌素還原酶將泰樂菌素還原為雷諾菌素嚴重影響了成品的質量，又因其在菌體生長過程中起重要作用，將該酶編碼基因敲除將嚴重影響菌體生長[11]。因此，在保證該酶基本活性的情況下抑制其對泰樂菌素的還原具有重要的研究意義。

本實驗室前期對泰樂菌素還原酶編碼基因進行編輯，將其第642位鳥嘌呤突變為腺嘌呤，形成一個終止密碼子，提前終止多肽鏈翻譯，突變后的泰樂菌素還原酶依舊保留與NADPH的結合能力和還原活性，但與泰樂菌素的親和力下降，對泰樂菌素的催化效率降低72.7%[12]。由于單堿基突變不穩定，且該突變無法通過設置選擇壓力進行保持，在生產過程中出現泰樂菌素產量和組分發生波動。為了避免這一不利因素，本研究對泰樂菌素還原酶基因單堿基突變后的基因序列進行敲除，簡化泰樂菌素還原酶基因序列，構建保留部分醛酮還原酶活性，但泰樂菌素還原作用極大降低的穩定的弗氏鏈霉菌工程菌株，為提高泰樂菌素發酵產量和產品品質提供新的策略和生產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與質粒

Streptomyces xinghaiensis（fradiae）CICC 11034，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，產泰樂菌素；Streptomyces fradiae M1，CICC 11034菌株的泰樂菌素還原酶單堿基突變菌株，其特征為泰樂菌素還原酶編碼基因第642位鳥嘌呤突變為腺嘌呤，本實驗室構建保存；E. coli Top10，本實驗室保存；E. coli ET12567（pUZ8002），中間宿主菌，用于大腸埃希菌-鏈霉菌接合轉移，本實驗室保存；pCRISPomyces-2-RecA，攜帶RecA基因的鏈霉菌基因編輯骨架質粒，含安普霉素抗性基因，本實驗室保存。

1.1.2 培養基

改良高氏1號培養基：購自青島博奧生物有限公司。WL-50培養基：酵母提取物1 g，可溶性淀粉5 g，氯化鈉2.5 g，硫酸鎂3.6 g，L-丙氨酸0.2 g，L-精氨酸0.2 g，L-天冬酰胺0.5 g，氯化鎂4.8 g，pH=7.5。TSB培養基：酵母粉5 g，胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，pH自然。發酵培養基：棉籽餅粉1.5%，玉米蛋白粉1.5%，玉米粉2%，甜菜堿0.06%，豆油3%，（NH4）2HPO4 0.05%，CaCO3 0.2 %。

1.1.3 主要試劑

限制性內切酶XbaI、BbsI購于NEB（北京）有限公司；2×Taq Plus Master Mix、T4 DNA連接酶購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒購于OMEGA bio-tek公司；氨普霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素、奈啶酸鈉鹽、甘油、 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；Tylosin 購自Toronto Research Chemicals。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9基因敲除質粒的構建

泰樂菌素還原酶在NCBI中基因編號為SFRA RS09010，因此將其編碼基因暫稱為sfr基因，并將sfr基因642位單堿基突變位點后剩余的354 bp基因稱為sfr基因敲除片段。以溫度敏感型質粒pCRISPomyces-2-RecA為骨架，構建sfr基因敲除片段的CRISPR/Cas9系統，在敲除片段的上下游各選取1 kb的同源臂，采用Overlap PCR進行連接，兩端引入XbaI酶切位點和保護堿基；分別對質粒pCRISPomyces-2-RecA和同源臂進行XbaI酶切，質粒去磷酸化后，利用T4連接酶將同源臂和質粒16℃ 過夜連接；連接液轉入E. coli Top10感受態細胞中，涂布到含50 μg/mL安普霉素的LB平板上，37℃過夜培養，檢測篩選出陽性克隆進行PCR和酶切驗證，并測序。

sfr基因敲除片段sgRNA序列分別為5'-ATCCGCAAGGAGCAGGAGGG-3'和5'-GCCAGTTGGTCCGCCGTGCG-3'，將其串聯并由來源于pCRISPomyces-2-RecA強啟動子的兩個拷貝驅動，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用Golden Gate一步組裝法將合成的sgRNA片段插入到已連接同源臂的骨架載體中，連接產物轉入E. coli Top10感受態細胞中，進行藍白斑篩選，PCR檢測同源臂篩選出陽性克隆，測序驗證。將構建好的敲除質粒轉化至E. coli ET12567感受態中。

1.2.2 質粒屬間接合轉移

敲除質粒通過接合轉移到鏈霉菌中。將含有敲除質粒的E. coli ET12567與Streptomyces fradiae M1的孢子懸液按照10：1混合，涂布到WL-50培養基平板上，28℃下培養16～18 h，覆蓋終濃度為300 μg/mL的安普霉素和終濃度為200 μg/mL的萘啶酮酸混合溶液1 mL，培養7 d左右，挑取單菌落進行分離。接合子在含有萘啶酮酸和安普霉素的WL-50培養基上傳代3次，以保證基因敲除效率。

1.2.3 基因敲除質粒消除及驗證

刮取F3接合子孢子，制備孢子懸液，分別涂布于30 μL到含有萘啶酮酸和安普霉素的WL-50平板上以及無抗性的WL-50平板上，分別在2℃和37℃下培養10 d。以出發菌株做陰性對照。

1.2.4 接合子基因敲除結果驗證

在sfr基因敲除片段的上下游同源臂之外400 bp 處設計驗證引物，通過PCR檢測目的基因敲除情況，若目的片段成功敲除，PCR條帶大小應為2800 bp，若目的片段未被敲除，PCR條帶大小則應為3154 bp。將產物送樣測序，通過對測序結果進行比對，進一步確定目的基因是否被成功敲除。將sfr基因缺失片段成功敲除的菌株命名為Streptomyces fradiae M1-d1。

1.2.5 菌種培養

孢子培養：供試菌株接種于改良高氏一號斜面培養基培養4～5 d。種子培養：TSB液體培養基分裝于500 mL三角瓶中，裝液量120 mL；刮取斜面培養基上供試菌株孢子，接入培養基中，200 r/min、28℃ 振蕩培養48 h，作為種子液。

1.2.6 搖瓶培養

TSB液體培養基分裝于500 mL三角瓶中，裝液量120 mL，按10%接種量接入種子液，150 r/min 、28℃搖振培養7 d。培養液用濾紙過濾，得到新鮮菌絲體，去離子水清洗3次。將帶有菌絲體的濾紙置于105℃烘箱中烘至恒重，測定菌絲體干重。

1.2.7 發酵驗證

10 L全自動發酵罐（無錫宜欣），發酵液消前體積6.5 L，消后體積7.5 L。種子液以15%接種量接種于培養基中，26℃發酵172 h，期間通氣量控制在0.8～0.9 vvm，攪拌轉速100～300 r/min，保持發酵液溶氧濃度在30%以上。

1.2.8 泰樂菌素組分檢測

取發酵液30 mL，4℃、3000 r/min離心10 min。取上清液10 mL轉移到另一個離心管中，加入20 mL乙腈，水平搖床上搖振30 min，4℃、10000 r/min離心10 min，將提取液溶劑層倒出，加水稀釋至100 mL，0.45 μm微濾膜過濾，HPLC檢測泰樂菌素組分。色譜條件：島津LC-20AG色譜系統，C18色譜柱，以90：10（v：v）的乙腈-水為流動相，流速1.00 mL/min；進樣量20 μL，檢測波長292 nm。泰樂菌素A組分與D組的相對保留時間約為：泰樂菌素D 0.8，泰樂菌素A1。

2 結果與分析

2.1 sfr基因642位突變位點后片段的敲除

2.1.1 同源臂的插入

在sfr基因敲除片段的上下游分別設計長1 kb的同源臂序列及其引物，PCR擴增，得到上下游同源臂片段（圖1A）。膠回收擴增產物，稀釋至相同濃度，采用Overlap PCR進行上下游同源臂連接，獲得同源臂（圖1B）。

將同源臂與質粒pCRISPomyces-2-RecA通過 XbaI酶切位點進行連接，經PCR和酶切驗證，得到與預期大小2000 bp一致的同源臂片段（圖2），測序結果與同源臂序列完全一致，表明同源臂插入成功，獲得重組載體 pCR-Δds。

2.1.2 sgRNA的插入

sgRNA片段與質粒pCR-Δds連接，經藍白斑篩選后，挑取白色單菌落進行PCR驗證，目的條帶大約在3360 bp，與預期大小一致（圖3）。PCR產物測序結果與sgRNA序列完全一致，表明sgRNA成功插入，基因敲除質粒pCR-Δds-sgRNA構建成功。

構建好的質粒轉化至E. coli ET12567感受態中，使用sgRNA檢測引物進行菌落PCR驗證，得到

3360 bp大小的片段（圖4），表明敲除質粒pCR-Δds-sgRNA已經成功轉化至E.coli ET12567感受態細胞中，得到菌株ETpCR-Δds-sgRNA。

2.1.3 敲除質粒屬間接合轉移及質粒消除

菌株ETpC-Δds-sgRNA與Streptomyces fradiae M1孢子混合進行敲除質粒pCR-Δds-sgRNA的接合轉移。經抗性篩選和PCR驗證獲得陽性接合子。在含有萘啶酮酸和安普霉素平板上傳代培養3次的陽性接合子進行質粒消除，結果表明，37℃條件下，接合子在無抗性平板上可以正常生長產生孢子（圖5A），在安普霉素終濃度為10 μg/mL的抗性平板上則無法正常生長（圖5B），而28℃條件下，接合子在抗性平板上能正常生長（圖5C），表明37℃培養可消除接合子中游離的敲除質粒，37℃下能在無抗性平板上正常生長的菌株即為質粒消除菌株。

將消除敲除質粒后的菌株接種到至TSB液體培養基中培養，提取基因組，進行PCR驗 證。

sfr基因642位突變位點后片段成功敲除的菌株，其PCR條帶長度應為2800 bp，泳道1、3、6、7、8的條帶與預期長度相符，即為成功敲除的菌株；sfr基因缺失片段未成功敲除的菌株，PCR條帶長度為3154 bp，泳道2、4、5、條帶與其相符，為未敲除成功的菌株（圖6）。

對敲除成功的sfr基因進行測序，與Streptomyces fradiae M1的sfr基因進行序列比對。結果表明，敲除菌株sfr基因第642位堿基后的354 bp序列已成功敲除，得到的工程菌株命名為Streptomyces fradiae M1-d1。

2.2 供試菌生長特性

搖瓶培養條件下，原始菌株S. fradiae CICC 11034、sfr基因單堿基突變菌株S. fradiae M1和sfr基因354 bp序列敲除菌株S. fradiae M1-d1的生長過程無明顯差異。3株菌在進入穩定期后最終菌體干重分別為10.913 g/L，11.238 g/L和11.087 g/L（圖7），3株菌生物量之間并無顯著差異，表明敲除部分sfr基因對菌體的正常生長并無影響。

2.3 泰樂菌素組分差異分析

S. fradiae和S. fradiae M1-d1菌株泰樂菌素發酵產物HPLC檢測結果表明，S. fradiae M1-d1發酵液中泰樂菌素A組分峰相對面積為84.1%，較S. fradiae CICC 11034發酵液中泰樂菌素A組分相對峰面積76.4 %提高了10.08%，而S. fradiae M1-d1發酵液中泰樂菌素D組分相對峰面積為3.5%，較S. fradiae CICC 11034發酵液中泰樂菌素D組分相對峰面積11.2%下降了68.75%（圖8）。S. fradiae M1-d1發酵產物中泰樂菌素A組分相對含量增加，D組分相對含量顯著降低。

3 討論

酶蛋白一級結構的變化，會導致蛋白質在盤曲折疊時的空間結構以及活性位點發生改變，并直接影響了該酶對底物的結合能力和催化活性。因此，對蛋白質以及結構進行定向改造，可以有效改變酶的催化效率。Qiu[12]等將Km AKR Variant Ⅲ 中Tyr28突變為Ala，Thr63突變為Met，提高了底物與活性位點的結合概率，增強了酶的熱穩定性和催化活性。Li等[13]通過將醛酮還原酶Km AKR M5 中Ala306替換為Pro，Thr302替換為Ser，Asn替換為Lys，Ser196替換為Cys，引入額外的氫鍵，增加疏水相互作用，從而使酶的相對活性增加了79.7%，催化效率增加了34.7%。本研究中對泰樂菌素還原酶編碼基因片段的部分敲除，導致了該酶蛋白質構象的改變，使其與泰樂菌素的結合能力下降，從而在一定程度上抑制了該酶對泰樂菌素的還原作用。

一級結構的變化還會影響酶蛋白的穩定性。在來源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶中引入帶正電荷的精氨酸，通過加強蛋白質內部的疏水堆積，提高靜電相互作用的強度，使得葡萄糖氧化酶內部結構更加緊湊，從而提高了酶的熱穩定性[14]。結構的變化還可改變酶蛋白活性位點使其pH依賴性發生改變[15]。前期研究表明，編碼基因642位鳥嘌呤突變為腺嘌呤、形成終止密碼子的泰樂菌素還原酶突變蛋白，其熱穩定性下降，對金屬離子和酸堿的敏感性增加[11]，提示了泰樂菌素還原酶在改變空間構象以后，其蛋白結構穩定性會發生變化，多肽鏈中氨基酸殘基數量減少，可能使得酶蛋白結構變得松散，從而降低酶的穩定性，酶的活性位點也會因為氨基酸殘基的缺失而改變對酸堿的敏感性。

本研究中，出發菌株S. fradiae CICC 11034泰樂菌素發酵產物中D組分占比為11%，泰樂菌素還原酶并未將泰樂菌素（A組分）大量還原為雷諾菌素（D組分），這可能是與該酶對泰樂菌素的催化活性較低有關[11]。而構建的工程菌株盡管顯著降低了對泰樂菌素的還原作用，但其泰樂菌素發酵產物中仍然有3.5%左右的D組分，表明經過改造的泰樂菌素還原酶并未完全喪失對泰樂菌素的還原作用。研究表明，泰樂菌素還原酶的最適作用溫度為30℃，最適pH值為7.0，當溫度上下浮動5℃時，其相對酶活降低約30%，pH值上下變動1個單位時，相對酶活降低超過30%，且該酶對金屬離子和有機溶劑比較敏感[11]。而來源于超嗜熱菌Thermotoga sp.和Thermotoga maritima中的2種醛酮還原酶TADH1和TADH2也表現出對多種金屬離子敏感，Zn2+可使TADH1酶活性下降66%[16]。因此，在泰樂菌素發酵生產中，可以通過適當調節發酵溫度和pH值來抑制改造后的泰樂菌素還原酶的活性，繼而阻止泰樂菌素向雷諾霉素的還原過程，達到進一步提高泰樂菌素產量和產品質量的目的。

參 考 文 獻

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