藏北高原鹽湖放線菌Nocardiopsis sp. N85的活性次級代謝產物研究

摘要：目的 對藏北高原當穹錯鹽湖來源放線菌N85進行初步分子鑒定及活性次級代謝產物研究。方法 通過菌株16S rRNA序列比對、系統發育樹構建及全基因組序列分析，初步確定N85的分類地位；以抗菌活性及代謝物豐富度為指標，采用OSMAC策略確定最佳發酵條件；基于HPLC-UV、UPLC-Q-TOF-MS及UNIFI數據庫篩查技術，對活性化合物進行結構預測；通過硅膠柱色譜和反相HPLC分離純化活性成分；經NMR波譜數據分析并與文獻對比確定化合物的結構。結果 菌株N85隸屬于擬諾卡菌屬放線菌，經過OSMAC培養基優化，從菌株粗提物中預測并分離鑒定3個活性產物，分別為萘醌類化合物2-methoxy-1，4-naphthoquinone （1），吡喃酮類化合物norcardiatone A（2）和norcardiatone C（3），其中化合物1為主要活性成分。化合物1～3首次從內陸鹽湖來源放線菌中分離獲得。結論 應用光譜、質譜等多譜學數據分析結合UNIFI數據庫篩查等策略，可快速實現天然產物的早期結構排重，對加速新型抗生素的高效發現具有指導意義。

關鍵詞：鹽湖；擬諾卡菌；次級代謝產物；結構預測；結構鑒定

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：" A

Antibacterial secondary metabolites from the strain Nocardiopsis sp. N85 isolated from a saline lake on the Northern Tibetan Plateau

Zhai Xiao-xu1，2， Liu Di1，2， Sui Li-ying3， Luo Ke-ke2， Zhang Ben-yin4，

Zhang De-jun4， Xue Chun-mei1， Liu Shao-wei2，5 and Sun Cheng-hang2，4，5

（1 College of Biology and Agriculture， Jiamusi University， Jiamusi 154000; 2 Department of Microbial Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences amp; Peking Union Medical College， Beijing 100050; 3 College of Marine and Environmental Sciences， Tianjin University of Science and Technology， Tianjing 300457; 4 College of Eco-Environmental Engineering， Qinghai University， Xining 810016; 5 Beijing Key Laboratory of Antimicrobial Agents， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences amp; Peking Union Medical College， Beijing 100050）

Abstract Objective To investigate the taxonomic status and antibacterial secondary metabolites of an actinobacterial strain N85 isolated from the Dangqiong Co saline lake on the Northern Tibetan Plateau， China. Methods Taxonomic status of strain N85 was preliminary determined through the 16S rRNA gene sequence BLAST， phylogenetic tree construction and whole genome sequence analysis. The optimal fermentation condition was determined by OSMAC strategy with guidance of the antibacterial activity and the metabolites richness. Structures of antibacterial components were predicted by using HPLC-UV， UPLC-Q-TOF-MS and database searching in UNIFI platform. Bioactive metabolites were isolated and purified by using silica gel column chromatography and reversed-phase HPLC. Chemical structures were elucidated and confirmed by NMR spectral analysis and comparison with the data of literature. Results Strain N85 was preliminarily identified as the Nocardiopsis species. A total of three bioactive compounds were isolated and identified from the extract of the strain N85 after media optimization by using the OSMAC strategy. These compounds were 2-methoxy-1，4-naphthoquinone （1）， norcardiatone A （2） and norcardiatone C （3）， and compound 1 was the dominating bioactive component in extract of the strain N85. Compounds 1～3 were obtained from the saline lake-derived actinobacteria firstly. Conclusion Application of the multi-spectral analysis such as mass spectrometry and spectroscopy combined with the UNIFI analysis can quickly identify structures of natural products in early stage， which will contribute to accelerating the efficient discovery of novel antibiotics.

Key words Saline lake; Nocardiopsis sp.; Secondary metabolites; Structure prediction; Structure elucidation

近年來細菌耐藥形勢日益嚴重，尋找新型的抗菌藥物迫在眉睫[1]。長期以來，微生物尤其是放線菌來源的次級代謝產物一直是微生物藥物的重要來源。為從以往研究較少或尚未開發的放線菌資源中發現新“菌”新“素”，研究者勘探的腳步，從熱帶亞熱帶的沿海紅樹林[2]，到南北極的苔原[3]，從黑暗高壓的深海[4-5]，到極旱高溫的沙漠[6-7]，幾乎踏遍了所有可及的地球生態環境。其中，陸源高鹽生態環境（如鹽湖、鹽田、鹽堿地等）中的放線菌資源，由于其生存環境惡劣，抗逆能力強，具有獨特的耐高滲生理結構及多樣的代謝調控機制，成為極端環境生命研究的新熱點[8-9]。藏北高原又稱羌塘高原（Qiangtang Plateau），位于西藏岡底斯山和念青唐古拉山以北，昆侖山和唐古拉山以南的阿里、那曲地區（含當雄縣），面積遼闊，占青藏高原總面積的1/4，平均海拔高達4500 m，被稱之為“世界屋脊之屋脊”[10-11]。作為中國湖泊分布最密集地區，藏北高原鹽湖數量眾多，類型豐富，面積1 km2以上的各類鹽湖251個[12]。然而，由于高寒缺氧、干旱缺水、空氣稀薄、陽光輻射強烈、生存環境惡劣等原因，造成該地區人跡罕至、樣品采集困難，因此對藏北高原鹽湖微生物資源的藥用價值研究極少[13-14]，尤其在微生物次級代謝產物的研究方面更是空白。

本實驗室前期在對藏北高原鹽湖底泥放線菌資源勘探及抗菌活性篩選的過程中，從當穹錯（Dangqiong Co）鹽湖底泥分離獲得一株具有抗細菌活性的菌株N85，經16S rRNA序列系統發育分析鑒定其為擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）放線菌。擬諾卡菌屬是放線菌綱（Actinomycetes）鏈孢囊菌目（Streptosporangiales）擬諾卡菌科（Nocardiopsidaceae）的模式菌屬，廣泛分布于海洋、鹽湖、荒漠等鹽堿環境中[15-16]。據報道，天然高鹽環境下的擬諾卡菌具有豐富的物種多樣性和新穎性，能夠產生多種活性獨特的次級代謝產物，結構涵蓋吡喃酮類、肽類、環內酯類、吡喃萘醌類、芳香雜環類、含氯芳香類、三聯苯類、香豆素類、駢四苯二醌類等多種類型[17-19]，是發現新型微生物藥物的一類重要放線菌資源。

如何對菌株活性代謝產物進行早期、快速、準確地結構鑒別和化合物排重，一直是新型天然產物高效發現的關鍵問題。近年來，超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry， UPLC-Q-TOF-MS）已經成為天然藥物中活性成分快速分離和鑒定的有力手段[20-21]。UNIFI是Waters公司開發的一款科學信息系統軟件，具有自動離子流提取、預測分子式、在線/自建數據庫檢索等功能，可實現化學成分快速靶向分析，在中藥分析、化學藥分析、生化藥分析、食品檢測和環境監測等領域應用廣泛[22-23]，但在微生物活性天然產物的早期排重和新抗生素的快速發現領域還應用甚少。

本研究將UPLC-Q-TOF-MS技術與UNIFI數據分析方法相結合，應用到Nocardiopsis sp. N85活性次級代謝產物的研究中。首先，以抗菌活性及代謝物豐富度為指標，運用單菌株多產物策略（OSMAC）確定菌株發酵條件；然后建立UPLC-Q-TOF-MS分析方法，基于全信息串聯質譜數據采集模式（MSE），全面采集菌株N85的代謝物質譜數據；同時檢索、收集、整理所有關于擬諾卡菌屬化合物的文獻報道，建立該屬次級代謝產物的“In-house”虛擬質譜數據庫；再利用UNIFI平臺，通過在線及自建數據庫對活性化合物進行靶向結構預測；最后通過NMR數據對預測產物進行結構確證。希望通過本研究，能為微生物來源新型活性天然產物的高效挖掘提供一些參考和啟示。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料及試劑

PCR擴增儀（Veriti 96），美國賽默飛世爾公司；高壓蒸汽滅菌器（SQ810C），雅馬拓科技貿易（上海）有限公司；恒溫培養箱（ZDP-2120）及搖床（ZHWY-211C），上海智城分析儀器制造公司；離心機（Centrifuge 4-16KS），德國Sigma公司；旋轉蒸發儀（N-1100），東京理化器械株式會社；高效液相色譜儀（LC-20AT），島津企業管理（中國）有限公司；高分辨液質聯用分析儀（Acquity UPLC I-Class串聯Xevo G2-XS QTOf），美國Waters公司；核磁共振儀（Bruker AV Ⅲ-600NMR），布魯克（北京）科技有限公司；PCR試劑，北京全式金生物技術有限公司；柱色譜硅膠，青島海洋化工有限公司；半制備柱（Agilent Zorbax SB-C18，9.4 mm× 250 mm，5 μm），安捷倫科技（中國）有限公司；分析柱（Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm× 150 mm，5 μm），安捷倫科技（中國）有限公司；高分辨液質聯用色譜柱（Acquity UPLC BEH C18，2.1 mm× 100 mm，1.7 μm），美國Waters公司；色譜純甲醇和乙腈，迪馬科技有限公司；其余分析純試劑如乙酸乙酯、甲醇等試劑均購自北京市通廣精細化工公司。

1.2 菌株

放線菌Nocardiopsis. sp. N85由本實驗室分離自藏北高原當穹錯（Dangqiong Co）鹽湖底泥（31°35′24″N， 86°47′24″E），現保存于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所微生物化學室。活性測試的檢定菌為金黃色葡萄球菌ATCC25923和枯草芽胞桿菌CPCC 100029，均保存于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所微生物化學室。

1.3 培養基

本研究中使用的所有培養基配方見表1。

1.4 方法

1.4.1 基于16S rRNA基因序列的分子鑒定及系統發育分析

采用Chelex-100法[24]提取基因組DNA。菌株的16S rRNA基因片段采用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系及反應程序按照文獻方法進行[25]。PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。將測序結果提交到EzBioCloud網站[26]進行菌株相似性比對，下載有效發表的相近種的16S rRNA序列，采用MEGA 7.0軟件中ClustalW[27]進行多序列比對，并在Phylogeny中采用鄰接法[28]依照Kimura-2-parameter模型[29]進行聚類分析，構建系統發育樹。

1.4.2 基因組測序及序列分析方法

收集少量菌體以無菌水沖洗2～3次后，送至深圳華大基因股份有限公司完成基因組框架圖的測定。菌株N85與近源模式種在基因組水平上的親緣關系采用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）和數字化DNA雜交值（digital DNA-DNA hybridization，dDDH）進行評價。使用ChunLab的ANI Calculator（https：//www.ezbiocloud.net/tools/ani）[30]計算ANI值，Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http：//ggdc.dsmz.de/ggdc.php）[31]計算dDDH值。采用NCBI prokaryotic genome annotation pipeline（PGAP）[32]進行基因組注釋；利用antiSMASH 6.0（https：//antismash.secondarymetabolites.org/）[33]在線工具對菌株N85中的次級代謝產物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）進行預測分析。

1.4.3 鹽濃度、溫度及pH耐受實驗

將菌株N85接種于分別含有0、1、2、3、5、7、9、10、13和15% NaCl的ISP2瓊脂培養基上，30℃培養14 d，觀察并記錄生長狀況；獲得最適鹽濃度后，將菌株接種于含3% NaCl的ISP2瓊脂培養基上，分別于4、10、15、20、25、28、30、37、40和42℃培養14 d，觀察并記錄生長狀況；配制含3% NaCl的ISP2培養基，調節培養基的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，置30℃培養14 d，觀察并記錄菌株生長狀況。

1.4.4 OSMAC發酵培養，產物粗提取及抑菌活性測定

選取五種不同成分培養基（表1，M1～M5）對菌株N85進行OSMAC培養發酵。挑取適量菌體接種于含100 mL液體培養基的500 mL錐形瓶中，28℃、

180 r/min條件下搖床震蕩培養培養5～7 d。發酵液經5000 r/min離心15 min后去除菌體，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取2次。合并萃取相減壓濃縮后，用

1 mL甲醇溶解備用。

參照文獻[25]，采用紙片擴散法測定菌株發酵液粗提物的抑菌活性，檢定菌為金黃色葡萄球菌ATCC 25923和枯草芽胞桿菌CPCC 100029。將含有粗提物的濾紙片貼在檢定菌平板上，37℃培養24 h后觀察和測量抑菌圈的大小。

1.4.5 HPLC指紋圖譜的建立

5種培養基培養下的菌株發酵粗提物用甲醇溶解后，微孔濾膜過濾，應用HPLC色譜以相同的條件進行梯度洗脫分析。色譜條件如下：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm× 150 mm，5 μm；流動相為甲醇-水；洗脫條件為20%～100%甲醇梯度洗脫0～

25 min；流速為1 mL/min；檢測波長為200～600 nm。

1.4.6 UPLC-Q-TOF-MS數據采集

N85菌株經M4培養基發酵后的粗提物經適量甲醇溶解后，稀釋至濃度約1 mg/mL。應用Waters公司的ACQUITY UPLC I-Class串聯Xevo G2-XS QTof質譜系統采集MSE模式數據，進行UPLC-Q-TOF-MS分析。色譜條件如下：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱，2.1 mm×

100 mm，1.7 μm；流動相A：0.1% 甲酸-水溶液；流動相B：乙腈；梯度條件：0～18 min，10%～90%B；18～20 min，90%～90%B；流速，0.3 mL/min。質譜設定條件如下，離子化模式：ESI源，正離子下的靈敏度模式；掃描質量范圍：200～2000 Da；電離電壓，2.0 kV；錐孔電壓，40 V；離子源電壓補償，80 V；離子源溫度，100℃；脫溶劑溫度，260℃；錐孔氣流速，50 L/h；脫溶劑流速，600 L/h。應用MassLynx V4.1軟件進行儀器控制和數據采集及分析。

1.4.7 擬諾卡菌化合物數據庫的建立與UNIFI分析

通過檢索中國知網（CNKI）、SciFinder、PubMed、Springer等數據庫，檢索、收集、整理迄今發表的擬諾卡菌屬所有化合物信息，將化學結構保存成.mol格式的文件，導入UNIFI軟件中，建立擬諾卡菌次級代謝產物數據庫（228個化合物），包括化合物中英文名稱、分子式、化學結構式、碎片離子信息等。收集MSE模式采集的菌株N85的質譜數據導入UNIFI平臺。按照采用UNIFI的篩查應用解決方案步驟，使用微生物天然產物數據庫NPAtlas（https：//www.npatlas.org/）[34]和擬諾卡菌化合物自建庫進行化合物檢索匹配。

1.4.8 菌株N85的放大發酵及活性代謝產物的分離純化

挑取少量新鮮菌體接種于含100 mL M4液體培養基的500 mL錐形瓶中，28℃、180 r/min條件下搖床震蕩培養2～3 d后作為種子液。種子液轉接于含

1 L M4液體培養基的5 L錐形瓶中進行二級發酵6～

7 d即可收獲。發酵獲得的10 L發酵液經4500 r/min離心20 min后，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮獲得粗提物2.2 g。將粗提物與200～300目的正相硅膠粉充分研磨混合后干法上樣于硅膠柱，以二氯甲烷：甲醇（100：1、 50：1、25：1、15：1、9：1、4：1、2：1、1：1、0：1，V/V）作為洗脫液進行硅膠柱層析。各部分洗脫液經薄層色譜（TLC）檢測和抗菌活性測試后，在25：1的洗脫部分獲得活性組分A。將組分A進行HPLC制備，色譜條件如下：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18，250 mm×9.4 mm，5 μm； 流速

2 mL/min；流動相為乙腈-水；洗脫程序為35%～90%乙腈0～30 min線性梯度洗脫。最終制備獲得化合物1（1.8 mg），2（0.9 mg）和3（1.2 mg）。

2 結果

2.1 菌株分子鑒定及系統發育分析

將菌株N85的16S rRNA序列信息（GenBank NO. OQ509849， 1520 bp）上傳至EzBioCloud網站進行比對，下載相似性較高的有效發表菌株序列，采用鄰接法構建進化樹（圖1）。結果顯示，菌株N85隸屬于擬諾卡菌屬（Nocardiopsis），與有效發表菌株Nocardiopsis flavescens CGMCC 4.5723T的16S rRNA基因序列相似性最高（99.2%），并在系統發育樹中與N. flavescens CGMCC 4.5723T聚為穩定的一簇。使用ANI值和dDDH值評估菌株N85和N. flavescens基因組之間的進化距離，結果顯示二者的ANI值和dDDH值分別為85.2%和29.2%。一般來講，ANI值≥ 95%[35]，dDDH值≥ 70%[36]被界定為同一物種。因此，菌株N85與N. flavescens是兩個不同的種，但二者的親緣關系最近。菌株N85的具體分類地位有待應用多相分類學鑒定方法進一步研究。

2.2 全基因組序列及次級代謝產物生物合成基因簇分析

菌株N85基因組（GenBank NO. JARBUT000000000）全長6.50 Mbp，G+C含量為71.6%，含5665個ORF開放性閱讀框，5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA 各有1個，tRNA共有62個，其他的nc RNA有48個。經antiSMASH軟件預測分析其基因組序列，發現該菌株可能含有14個潛在的次級代謝產物生物合成基因簇（表2），主要包含聚酮類（T1PKS）、非核糖體多肽類（NRPS）、萜烯類（terpene）、羊毛硫肽類（lanthipeptide）、四氫嘧啶類（ectoine）和嗜鐵素（siderophore）等已知基因簇；同時還存在部分未知同源基因簇的序列，隸屬于羊毛硫肽類（lanthipeptide）、套索肽類（lassopeptide）和丁內酯類（butyrolactone）化合物。

2.3 菌株N85的培養耐受特征

在添加不同NaCl濃度的ISP2培養基上的生長狀況表明，菌株N85可耐受鹽濃度范圍為0～10%，最適鹽濃度為3%。在添加了3% NaCl濃度的ISP2培養基上，菌株N85的溫度生長范圍在10℃～40℃之間，最適生長溫度為28℃～30℃。該菌株可耐受的pH為6～9之間，最適pH為7～8。根據以上結果，確定菌株N85的最適發酵溫度為28℃～30℃，發酵鹽濃度為3%，pH為7～8。

2.4 不同培養基發酵產物的抑菌活性及HPLC指紋圖譜分析

采用5種不同培養基（M1～M5）對菌株N85進行液體培養發酵，對發酵液粗提物進行抗金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的抑菌活性測定。活性檢測結果如圖2A所示，菌株N85在5種培養基中均不同程度地產生了抑菌活性物質，其中，M4培養基發酵產物的抑菌活性最為顯著，抑菌圈直徑分別可達15 mm （枯草芽胞桿菌）和18 mm （金黃色葡萄球菌）。HPLC指紋圖譜可以反映不同培養基發酵產物中化合物的豐富程度，結果如圖2B所示，M4培養基發酵條件下得到的產物更加豐富，并且在保留時間8.5～10 min的范圍內出現明顯不同的產物峰。因此，本研究選擇M4培養基對N85進行進一步發酵培養。

2.5 HPLC-UV及UPLC-Q-TOF-MS分析N85發酵產物的活性成分

為初步探究該菌株的活性次級代謝產物，采用HPLC-UV技術對發酵液粗提物進行分時段餾分收集與抗金黃色葡萄球菌活性檢測，采用UPLC-Q-TOF-MS技術對活性成分進行質譜分析。ESI離子源正離子檢測模式下樣品的總離子圖 （total ion chromatography，TIC）見圖3A。結果顯示，該菌株的主要活性成分為峰1（保留時間tR4.88 min），同時峰2（tR 9.63 min）也顯示極微弱的活性。HR-ESI-MS圖譜（圖3B）顯示峰1的準分子離子峰為m/z 189.0488 [M+H]+和m/z 211.0359 [M+Na]+，確定其分子量為188，MassLynx分析軟件計算推測分子式為C11H8O3。紫外光譜（圖3C）顯示1在209、250、278、340和412 nm處有特征吸收峰。將峰1的原始質譜數據導入UNIFI軟件中，使用NPAtlas和擬諾卡菌化合物自建庫進行檢索匹配，結果顯示峰1應為萘醌類化合物，結構可能為1a或者1b （圖3H）。活性組分2 （tR 9.63 min）在正離子模式下顯示m/z 209.1094 [M+H]+和m/z 231.0926 [M+Na]+的準分子離子峰 （圖3D），經計算分子式為C12H16O3，分子量為208，該化合物在228和328 nm處有特征性紫外吸收 （圖3E）。經UNIFI軟件檢索，鑒定化合物2應為吡喃酮類化合物，結構可能為2a或2b （圖3H）。TIC圖中另顯示一主成分峰3 （tR 10.19 min），該化合物在224和303 nm處有特征性紫外吸收 （圖3G），提示應也含有吡喃酮的母核結構。HR-ESI-MS圖譜（圖3F）顯示峰3的準分子離子峰為m/z 211.1268 [M+H]+和m/z 233.1059 [M+Na]+，確定其分子量為210，分子式為C12H18O3，UNIFI軟件檢索鑒定化合物3可能為norcardiatone C，結構如圖3H（3）所示。

2.6 化合物1～3的NMR結構確證

化合物1：黃色粉末；ESI-MS m/z 189 [M+H]+；分子式 C11H8O3；1H NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 8.13 （1H， dd， J = 7.7， 1.3 Hz， H-5）， 7.87 （1H， d， J = 7.6 Hz， H-8）， 7.70 （1H， td， J = 7.6， 1.3 Hz， H-6）， 7.59 （1H， td， J = 7.9， 1.0 Hz， H-7）， 5.98 （1H， s， H-3）， 4.02 （3H， s， 2-OCH3）; 13C NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 179.7 （C-4）， 179.6 （C-1）， 168.9 （C-2）， 135.1 （C-6）， 132.2 （C-4a）， 131.7 （C-7）， 130.6 （C-8a）， 129.3 （C-5）， 124.9 （C-8）， 103.3 （C-3）， 57.0 （2-OCH3）。該化合物的波譜數據與文獻報道[37-38]基本一致，故鑒定化合物1為2-methoxy-1，4-naphthoquinone，結構如1a所示。

化合物2：黃色粉末；ESI-MS m/z 209 [M+H]+；分子式C12H16O3；1H NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 7.05 （1H， s， H-4）， 5.69 （1H， d， J = 6.4 Hz， H-2’）， 4.74 （1H， m， H-3’）， 2.11 （3H， s， H-3a）， 2.06 （3H， s， H-5a）， 1.96 （3H， s， H-1’a）， 1.33 （3H， d， J = 6.4 Hz， H-4’）; 13C NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 163.7 （C-2）， 157.5 （C-6）， 144.1 （C-4）， 138.5 （C-2’）， 128.2 （C-1’）， 123.3 （C-3）， 110.1 （C-5）， 64.5 （C-3’）， 23.0 （C-4’）， 16.9 （C-5a）， 16.6 （C-3a）， 15.2 （C-1’a）。該化合物的波譜數據與文獻報道[39]基本一致，故鑒定化合物2為norcardiatone A，結構如2a所示。

化合物3：黃色粉末；ESI-MS m/z 211 [M+H]+；分子式C12H18O3；1H NMR （600 MHz， CDCl3） δH： 7.19 （1H， s， H-4）， 4.42 （2H， dd， J = 12.2， 9.8 Hz， H-5a）， 3.49 （1H， s， 5a-OH）， 2.87 （1H， m， H-1’）， 2.08 （3H， s， H-3a）， 1.72 （1H， m， H-2’）， 1.50 （1H， m， H-2’）， 1.29 （1H， m， H-3’）， 1.23 （3H， d， J = 6.8 Hz， H-1’a）， 1.22 （1H， m， H-3’）， 0.88 （3H， t， J = 7.3 Hz， H-4’）; 13C NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 164.5 （C-6）， 164.0 （C-2）， 143.1 （C-4）， 123.0 （C-3）， 114.1 （C-5）， 59.9 （C-5a）， 36.8 （C-2’）， 34.6 （C-1’）， 21.0 （C-3’）， 19.2 （C-1’a）， 16.6 （C-3a）， 14.1 （C-4’）。該化合物的波譜數據與文獻報道[39]基本一致，故鑒定化合物3為norcardiatone C。

3 討論

本文以藏北高原當穹錯鹽湖底泥來源的稀有放線菌Nocardiopsis sp. N85為研究對象，基于HPLC-UV、UPLC-Q-TOF-MS信息采集及UNIFI數據庫篩查技術對其活性次級代謝產物進行了早期預測，并通過NMR波譜數據解析對預測化合物進行了有效驗證。結果表明，應用光譜、質譜等多譜學數據采集結合UNIFI數據庫檢索策略，可對目標化學成分進行快速定性分析，實現化合物早期結構排重，減少后期分離的盲目性和耗時性，對加速新型天然產物的高效發現具有指導意義。為提高化合物預測的準確性，減少假陽性結果，該策略使用應注意以下問題：①UNIFI系統的快速分析建立在與數據庫關聯的基礎上，因此全面、完善的化合物庫支撐是關鍵。但目前已公開的天然產物數據庫，尤其是微生物次級代謝產物數據庫，很難全面覆蓋所有已發表的化合物數據。此時可通過自建虛擬數據庫的途徑彌補上述不足。本研究運用UNIFI系統建立了擬諾卡菌屬代謝產物庫，可以更加全面、準確、有針對性地分析鑒定該屬菌株產生的化合物。因此，采用UNIFI自建庫方法建立不同種屬（尤其是稀有放線菌屬）化合物的虛擬數據庫，可以進一步提高微生物來源化合物的排重效率。②該策略對結構相似的同分異構體難以區分。如本研究中采用UNIFI平臺對tR 4.88 min色譜峰1進行分析，結果匹配出兩個相似結構1a和1b，其質譜裂解方式也極其相似，無法確定準確結構。因此，UPLC-Q-TOF-MS結合UNIFI平臺的分析方法對于結構相似的同分異構體的鑒定還需要通過與對照品或者NMR文獻數據比較等方法進一步驗證。③結構類似物的早期鑒定可加入以質譜碎片峰特征性關聯為基礎的分子網絡技術（molecular networking），借助免費開放的GNPS內部數據庫（Global Natural Products Social Molecular Networking， http：//gnps.ucsd.edu）[40]在線比對，快速排重和識別結構類似的化合物。本研究也曾嘗試構建N85的代謝分子網絡，但發現由于該菌株的產物分子量多數較小（MW300以下），構建的分子網絡混雜大量的碎片離子和背景離子，反而給化合物的篩選解析造成困擾。因此，分子網絡策略更有利于較大分子量化合物（MW400以上）的聚類解析。目前，本課題組已將該策略成功運用于新型鏈陽菌素類抗生素[41]、amicoumacin類抗生素[42]以及棘霉素類抗生素[43]的發現。

本研究從Nocardiopsis sp. N85的代謝粗提物中共分離鑒定3個活性化合物，分別為萘醌類化合物2-methoxy-1，4-naphthoquinone （MNQ， 1），吡喃酮類化合物norcardiatone A （2）和norcardiatone C（3）。化合物2-methoxy-1，4-naphthoquinone （1）為菌株N85的主要抑菌活性產物，以往報道其大多來源于鳳仙花屬（Impatiens）[38， 44-45]和獐牙菜屬（Swertia）[46]植物，在放線菌Streptomyces屬[37]和Nocardiopsis屬[47]的次級代謝產物中也有報道產生。研究顯示MNQ具有廣泛的生物藥理活性，包括抗真菌[48]、抗細菌[49]、抗腫瘤[38]、止癢[50]、抗炎和抗過敏[51]活性等。2020年Chen等[52]報道MNQ可通過刺激嗅鞘細胞增殖、提高吞噬活性等作用在神經系統損傷治療中發揮潛力。Norcardiatone A （2）和norcardiatone C （3）是魯春華

等[39]2010年從紅樹植物內生菌Nocardiopsis sp. A00203中分離得到的吡喃酮衍生物，其中norcardiatone A對HeLa細胞顯示較弱的細胞毒性。文獻檢索發現，化合物1～3以往報道均由海洋來源放線菌產生，在本研究中首次從內陸鹽湖來源放線菌中分離獲得。本研究結果豐富了鹽湖放線菌來源的次級代謝產物庫，間接提示我國豐富而特有的鹽湖微生物資源具有潛在的藥用價值，值得進一步深入挖掘和開發。

應用antiSMASH解析Nocardiopsis sp. N85的全基因組序列，發現該菌株具有多種類型次級代謝產物的生物合成基因簇，包括非核糖體肽類、I型聚酮類、萜烯類、羊毛硫肽類、 套索肽類、丁內酯類、嗜鐵素等，同時存在有未知產物的基因簇，表明該菌株可能具有合成新型化合物的潛力。然而，本研究分析發現除了化合物1～3可能由相應的聚酮合酶途徑合成外，大多數基因簇的表達產物并未在該菌株中明確探測到。分析原因可能是在現有的實驗室培養條件下，菌株多數基因簇處于“沉默”狀態不表達或表達量極低。雖然本研究應用了OSMAC策略對發酵培養基進行了優化，但設置的培養基種類和數量遠遠不夠；另外可通過改變鹽離子組成和鹽濃度（尤其是鹵鹽），在培養基中添加不同種類的小分子相容性溶質、酶抑制劑及生長因子，模擬自然環境中微生物間相互作用應用共培養策略等來激活或提高其“沉默”基因簇的表達。今后可在本研究基礎上進一步對該菌株的培養條件進行全面優化，深入挖掘其代謝合成潛能，以期發現更多類型的活性天然產物。

參 考 文 獻

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