持留菌的臨床相關(guān)性及防治研究進(jìn)展

摘要：持留菌（persisters）指的是細(xì)菌群體中的一個小亞群，它們可以在致死濃度的抗生素應(yīng)激下進(jìn)入休眠狀態(tài)，躲避抗生素的殺傷，然而這種耐受抗生素的能力并不具備可遺傳性，在抗生素壓力降低或者去除時持留菌便可正常生長并恢復(fù)對抗生素殺菌的敏感性。本文介紹了持留菌的生物學(xué)特性及其與慢性感染等臨床相關(guān)問題的關(guān)系，綜述了TA模塊及SOS反應(yīng)等促進(jìn)細(xì)菌持留形成的分子機制，總結(jié)了現(xiàn)有研究中針對細(xì)菌持留可行的防治手段，以期引發(fā)臨床對持留菌更廣泛的關(guān)注和警惕，且為持留菌的深入研究與防治提供參考。

關(guān)鍵詞：抗生素；持留菌；慢性感染；生物膜；防治策略

中圖分類號：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Advances in clinical relevance and treatment strategies of bacterial persisters

Feng Jia-ni， Li Wei-wei， Zhu Wei-wei， Xue Yun-xin， Wang Dai， and Zhao Xi-lin

（State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics， School of Public Health， Xiamen University，

Xiamen 361102）

Abstract Persisters refer to a small subgroup of bacterial populations that can enter a dormant state under lethal concentrations of antibiotic stress and evade the killing by antibiotics. However， the ability of persisters to tolerate antibiotic killing is not heritable. Persister bacterial cells can resume normal growth when the antibiotic pressure dissipates and regain sensitivity to antibiotic-mediated killing. In this paper， the biological characteristics of persistent bacteria and their relationship with related clinical issues， such as chronic infection， are introduced. The molecular mechanisms of toxin-antitoxin （TA） modules and SOS responses that promote the formation of bacterial persistence are reviewed. Currently available preventive strategies that are feasible for controlling bacterial persistence are also summarized in order to draw broad attention to and remain vigilance on clinical implications of persistent bacteria. Such work is expected to provide guidance for in-depth research and preventive measures of persistent bacteria.

Key words Antibiotics; Bacterial persisters; Chronic infections; Biofilms; Treatment strategies

抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類歷史上的一個高光時刻，它挽救了無數(shù)人的生命。然而，細(xì)菌也進(jìn)化出不同機制如耐藥、耐受及持留來應(yīng)對抗生素壓力，最終導(dǎo)致臨床上抗感染治療失敗。抗生素耐藥性（antibiotic resistance）指的是攜帶可遺傳耐藥機制（如降低藥物與其靶標(biāo)結(jié)合的突變、外排泵表達(dá)的增加、編碼抗生素滅活酶）的細(xì)菌能在高濃度抗生素下生長的能力，且其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）明顯升高[1-2]。除抗生素耐藥性外，還存在其他機制可以幫助細(xì)菌在抗生素殺傷下存活，如抗生素耐受性（antibiotic tolerance）：細(xì)菌能夠暫時承受或減緩高濃度抗生素的殺傷，但是不能增殖，其MIC不發(fā)生改變的特性[3]。與抗生素耐藥/耐受性不同，抗生素持留性（antibiotic persistence）指的是細(xì)菌亞群在高濃度抗生素下存活的能力[4]。持留菌的存在常常是臨床上抗生素治療失敗的原因：臨床大多數(shù)抗生素的殺滅效率主要依賴于細(xì)菌的生理狀態(tài)，而持留菌在致死濃度抗生素的存在下不能增殖但也不會被殺死，而是轉(zhuǎn)換為休眠狀態(tài)。這種生長停滯的休眠狀態(tài)導(dǎo)致持留菌對抗生素不敏感，因此難以被大多數(shù)抗生素徹底清除[5]。當(dāng)抗生素壓力下降或去除時，持留菌又可以恢復(fù)生長，并完全恢復(fù)對抗生素殺菌的敏感性。越來越多的臨床案例如囊性纖維病[6]、結(jié)核病[7]和尿路感染[8]等都證明了持留菌與臨床上抗生素治療失敗的關(guān)系，因此對持留菌形成的探究及防治手段的開發(fā)也愈發(fā)重要。本文綜述了持留菌的特點及臨床相關(guān)性、形成的機制及治療手段，有利于加強人們對持留菌的認(rèn)識，幫助預(yù)防、控制持留菌。

1 持留菌的生物學(xué)特性

1942年，Hobby等[9]發(fā)現(xiàn)青霉素可以殺死99%的鏈球菌培養(yǎng)物，然而還有1%的細(xì)菌存活。兩年后，Bigger[10]在研究青霉素的作用機理時發(fā)現(xiàn)及證實了這種現(xiàn)象，并將這1%的細(xì)菌命名為持留菌。然而在隨后幾十年持留菌并沒有引起人們的關(guān)注，直到有研究發(fā)現(xiàn)生物膜中存在著持留菌[11]，而病原體的生物膜形成是臨床上各種慢性疾病治療失敗的重要原因，至此持留菌才廣泛引起了科學(xué)家的關(guān)注。

持留菌具有普遍性、休眠、多藥耐受、不可遺傳、可逆性等多個生物學(xué)特性。革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都能夠形成持留菌[12]。盡管Bigger只在青霉素處理的情況下觀察到持留菌的存在，但是暴露在其他作用機制抗生素（如喹諾酮類抗生素）中的細(xì)菌培養(yǎng)物也會形成持留菌[13]。有研究通過微流體裝置和單細(xì)胞分析，成功證明了青霉素處理下形成的持留菌處于休眠狀態(tài)[14]。休眠是持留菌應(yīng)對抗生素壓力下的主要方式，而抗生素主要通過抑制重要的細(xì)菌過程如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯來發(fā)揮作用。由于持留菌生長停滯，對抗生素不敏感，所以持留菌常表現(xiàn)出多藥耐受性。然而，這種耐受性并不能遺傳，當(dāng)抗生素的壓力撤去后持留菌便在正常環(huán)境下復(fù)蘇，并恢復(fù)對抗生素的敏感性[5，15]。生長恢復(fù)后的細(xì)菌失去了持留菌的特征，表現(xiàn)出與抗生素敏感菌株相同的表型，這也表明持留菌可在持留與非持留之間可逆地改變其生理狀態(tài)[16]。

2 持留菌的臨床相關(guān)性

2.1 持留菌與慢性感染

在沒有抗生素治療的情況下，宿主免疫系統(tǒng)無法徹底清除病原菌時會引起自身的慢性感染。例如：萊姆病（lyme disease， LD）是一種常見的蜱傳疾病，由細(xì)菌伯氏疏螺旋體引起。伯氏疏螺旋體擁有復(fù)雜的抗原變異系統(tǒng)，表面結(jié)合脂蛋白VlsE序列能導(dǎo)致病原體表面抗原的改變，從而阻礙宿主免疫系統(tǒng)的識別[17]。當(dāng)宿主組裝并產(chǎn)生抗體來清除變異病原體時，又有新的變異病原體涌現(xiàn)。這種不斷的變異永遠(yuǎn)比宿主免疫反應(yīng)領(lǐng)先一步，導(dǎo)致宿主免疫無法徹底清除病原菌，導(dǎo)致慢性感染。但即便進(jìn)行了抗生素的規(guī)范治療，仍有10%～15%的萊姆病患者會出現(xiàn)萊姆病綜合征（post-treatment Lyme disease syndrome， PTLDS），患者出現(xiàn)疲憊、疼痛和認(rèn)知困難等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[18]。隨著研究的逐漸深入，研究者發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象可能跟持留菌的存在相關(guān)[19]。

銅綠假單胞菌是囊性纖維病（cystic fibrosis， CF）患者呼吸道感染中最常見的機會致病菌，該病原體能夠通過多種方式包括分泌外毒素、形成生物膜、逃避宿主免疫系統(tǒng)及獲得多種抗生素耐藥性來適應(yīng)環(huán)境，且其鞭毛系統(tǒng)能幫助其在不同生態(tài)位中定植，從而在患者體內(nèi)持續(xù)多年存在并引起慢性感染，最終導(dǎo)致患者肺部功能下降甚至死亡[20]。然而研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離出來銅綠假單胞菌并不總有耐藥性[21]，因此有研究者懷疑CF患者慢性感染可能是持留菌存在的結(jié)果。Mulcahy等通過分析14名CF患者早期感染和晚期感染的分離株，發(fā)現(xiàn)與早期分離株相比，14株晚期分離株有10株顯示出hip高持留表型[6]。這是首次直接證明了持留菌與慢性感染的關(guān)系。此后，陸續(xù)有研究從念珠菌病、尿路感染、結(jié)核分枝桿菌感染等臨床相關(guān)疾病的慢性感染患者身上分離出持留菌[22-24]，這些發(fā)現(xiàn)證明了持留菌在慢性感染中的關(guān)鍵作用。

2.2 持留菌與生物膜感染

革蘭陽性菌和革蘭陰性菌病原體都可以產(chǎn)生生物膜，且生物膜一旦形成，細(xì)菌就能在生物膜里躲避各種抗生素的殺傷。這也導(dǎo)致臨床抗感染治療困難及各種感染復(fù)發(fā)，如植入裝置感染、尿路感染、結(jié)核病等疾病的出現(xiàn)[25]。早期研究在測試銅綠假單胞菌生物膜對氧氟沙星的劑量反應(yīng)時就發(fā)現(xiàn)，即便抗生素濃度非常高，也無法根除一小部分細(xì)菌[26]。近年來有研究者發(fā)現(xiàn)使用環(huán)丙沙星處理銅綠假單胞菌生物膜模型1 h后，細(xì)菌會調(diào)動嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)相關(guān)基因spoT、relA、編碼蛋白酶Lon的基因和毒素-抗毒素基因的過表達(dá)，誘導(dǎo)一部分細(xì)菌向持留表型轉(zhuǎn)變。且盡管經(jīng)過24 h的抗生素治療，環(huán)丙沙星破壞了生物膜基質(zhì)，也殺死了大多數(shù)敏感細(xì)菌，但少量持留細(xì)菌仍然沒有被根除，一旦抗生素水平下降，持留菌便會重新填充生物膜，最終導(dǎo)致抗感染治療失敗[27]。在真菌中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，用兩性霉素B處理白色念珠菌形成的生物膜發(fā)現(xiàn)膜中真菌大部分群體被殺死，而一小部分群體仍然存在，且不受高濃度抗菌藥物的影響[28]。除實驗室菌株外，Kaviar等[29]通過以91株臨床分離糞腸桿菌形成的生物膜為研究對象，分析發(fā)現(xiàn)其中3株分離株為持留菌，與非持留菌分離株相比，持留菌分離株顯示出更高水平的生物膜相關(guān)基因表達(dá)和生物膜形成能力，并且由持留菌形成的生物膜對萬古霉素具有更強的耐受性。這些結(jié)果說明生物膜結(jié)構(gòu)中存在持留菌是治療失敗和感染復(fù)發(fā)的主要因素之一。

2.3 持留菌與耐藥性

除了與持續(xù)性感染相關(guān)聯(lián)，細(xì)菌持留已被證明能為細(xì)菌耐藥性的發(fā)展鋪平道路。有研究證明細(xì)菌持留性跟耐藥性的進(jìn)化在天然分離株或?qū)嶒炇业拇竽c埃希菌菌株中都呈正相關(guān)，持留菌可以通過提高生存率和突變率來促進(jìn)耐藥性的發(fā)展[30]。

總而言之，持留菌在導(dǎo)致臨床上各種慢性疾病及細(xì)菌耐藥的發(fā)展中有關(guān)鍵作用，因此對持留菌的深入探究可為持續(xù)性感染及耐藥菌感染治療提供理論基礎(chǔ)。此外，在模擬藥物敏感型人類腫瘤細(xì)胞系對各種抗癌藥物的反應(yīng)時，研究始終能監(jiān)測到一小部分可逆的“耐藥”細(xì)胞，這些細(xì)胞亞群能短暫地呈現(xiàn)出可逆的藥物耐受狀態(tài)，以保護群體免受致命壓力的根除[31]。基于持留菌與腫瘤的耐受亞群存在相似之處，對持留菌的探究也可能為耐藥腫瘤細(xì)胞的臨床研究提供參考。

3 持留菌形成機制

基于細(xì)菌持留對臨床抗感染治療的不利影響，了解持留菌產(chǎn)生的機制就十分必要。持留菌的形成十分復(fù)雜且尚未完全研究清楚，各種因素都可能引起細(xì)菌的應(yīng)激從而介導(dǎo)持留的形成。下面將從TA模塊、SOS反應(yīng)、（p）ppGpp等來綜述持留菌的形成機制。

3.1 TA模塊

隨著對細(xì)菌持留現(xiàn)象研究的逐漸深入，毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）模塊被證明是影響細(xì)菌持留形成的重要因素。目前已報道的TA模塊可分為6類，且廣泛地存在于細(xì)菌中，它由兩個基因組成：一個編碼干擾細(xì)胞基本過程的蛋白質(zhì)（毒素），另一個編碼抑制毒素活性的RNA或蛋白質(zhì)（抗毒素）[32-33]。在正常情況下，毒素與抗毒素結(jié)合導(dǎo)致毒素失活，細(xì)菌的復(fù)制和代謝正常進(jìn)行。然而在壓力條件下，TA模塊中毒素的積累或毒素與抗毒素的不平衡會導(dǎo)致細(xì)菌的生長停滯和持留形成[33]。多種TA系統(tǒng)如hipBA[34]、MazEF[35]、mqsRA[36]和tisAB/istR[37]等被報道與病原菌持留的形成有關(guān)。上文提到在喹諾酮類藥物處理銅綠假單胞菌生物膜模型時會促進(jìn)細(xì)菌重組修復(fù)跟毒素-抗毒素基因的過表達(dá)，誘導(dǎo)一部分細(xì)菌向持留轉(zhuǎn)型[27]。

3.2 SOS反應(yīng)

SOS反應(yīng)被證明與持留菌的形成相關(guān)。氧化應(yīng)激、抗生素、紫外線等壓力下會引起細(xì)菌DNA損傷，產(chǎn)生單鏈DNA，激活RecA蛋白，促進(jìn)LexA阻遏蛋白的自裂解，導(dǎo)致SOS相關(guān)調(diào)控基因的去阻遏，各種參與同源重組和修復(fù)的蛋白基因表達(dá)來修復(fù)DNA損傷，細(xì)菌死亡率降低，持留菌生成[38-39]。氟喹諾酮類藥物能夠作用于細(xì)菌的解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶來誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂導(dǎo)致細(xì)菌死亡[40]。其中RecA和RecB蛋白對于修復(fù)大腸埃希菌中的雙鏈DNA斷裂修復(fù)至關(guān)重要。在大腸埃希菌中，與野生型菌株相比，ΔrecA和ΔrecB在環(huán)丙沙星處理6h后持留菌數(shù)量大大降低，ΔrecA減少了40倍，ΔrecB最高減少了103倍[41]。此外，SOS反應(yīng)能夠參與TA模塊介導(dǎo)的細(xì)菌持留，在DNA損傷和SOS反應(yīng)誘導(dǎo)下，tisAB/istR模塊中TisB蛋白過量表達(dá)，通過降低質(zhì)子動力和ATP水平，介導(dǎo)細(xì)菌代謝降低，進(jìn)入休眠狀態(tài)，形成持留菌[37]。

3.3 胞內(nèi)信號（p）ppGpp

（p）ppGpp是一種胞內(nèi)信號，其能夠直接抑制RNA聚合酶、參與翻譯過程的幾種酶以及GTP生物合成，導(dǎo)致細(xì)菌翻譯抑制和生長停滯，對細(xì)菌在多種抗生素殺傷、營養(yǎng)匱乏等應(yīng)激下的生存至關(guān)重要[42-43]。過去的許多研究發(fā)現(xiàn)，（p）ppGpp的存在與細(xì)菌持留現(xiàn)象相關(guān)。例如在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境下GTP酶Obg介導(dǎo)的細(xì)菌持留依賴于 （p）ppGpp，其中（p）ppGpp激活I(lǐng)型TA模塊hokB-sokB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致HokB毒素水平的升高，膜去極化，介導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入休眠狀態(tài)[44]。Liu等[45]通過對15個常見的持留相關(guān)基因敲除株與（p）ppGpp的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)ΔdnaK和ΔrecA在慶大霉素和氨芐西林作用下依賴于（p）ppGpp影響持留菌的形成，而其他基因與（p）ppGpp在細(xì)菌持留形成過程中表現(xiàn)出協(xié)同、拮抗等不同的關(guān)系。

3.4 其他機制

除上述機制外，還有許多因素被證明能夠促進(jìn)持留菌的產(chǎn)生，如持留菌可以由細(xì)菌分泌到細(xì)胞外的代謝物刺激形成。吲哚作為細(xì)菌間的信號分子控制著細(xì)菌的生理過程，如生物膜形成、耐藥性、毒力等[46]。氧氟沙星的刺激下會導(dǎo)致無法合成海藻糖的大腸埃希菌ΔotsA突變體內(nèi)氧化應(yīng)激和吲哚的過度產(chǎn)生[47]，從而導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素的耐受和持留菌的生成。此外，一種群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）分子群體感應(yīng)肽信息素可以向變形鏈球菌細(xì)菌群體發(fā)出壓力信號，使其產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膽?yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)持留菌的形成[48]。

多種外界環(huán)境因素被報道與促進(jìn)持留菌的形成相關(guān)，如營養(yǎng)匱乏：氮饑餓的條件下大腸埃希菌的（p）ppGpp合成增加，對環(huán)丙沙星耐受的持留菌數(shù)量增多[49]。除了營養(yǎng)變化，pH、滲透壓、氧化應(yīng)激和抗生素壓力等都是觸發(fā)持留形成的關(guān)鍵因素。滲透壓對于細(xì)菌維持正常的細(xì)胞形態(tài)、正常生長和分裂具有重要作用。與無滲透壓對照組相比，許多化學(xué)物質(zhì)的添加（如亞硝酸鈉、尿素等）會影響大腸埃希菌培養(yǎng)物中的持留菌數(shù)量。此外還發(fā)現(xiàn)與無緩沖液的對照組相比，當(dāng)細(xì)菌處于高酸性環(huán)境（pH≤5）時，其持留菌的形成顯著降低[50]。用過氧化氫處理大腸埃希菌培養(yǎng)物或通過向培養(yǎng)基中添加水楊酸鹽產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species， ROS）也會導(dǎo)致持留菌增加[51]。

4 持留菌的防治

由于持留菌處于休眠狀態(tài)，對抗生素的殺傷不敏感，因此近年來針對持留菌的防治策略主要從直接破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)、促進(jìn)持留菌復(fù)蘇來恢復(fù)對藥物敏感性、藥物聯(lián)合、干擾持留的形成等這幾方面入手。

4.1 直接殺死休眠的持留菌

抗生素的殺菌能力強烈依賴于細(xì)菌的代謝狀態(tài)，而持留菌能夠暫時終止或者延遲各種細(xì)胞代謝活動，對致死濃度的抗生素具有耐受性，因此需要采取其他的策略來代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素進(jìn)行殺菌。盡管持留菌處于休眠狀態(tài)，細(xì)菌仍需要如細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)屏障來維持細(xì)菌的生存，因此可以通過直接破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)屏障的功能來殺死持留菌。抗持留分子1-（（2，4-二氯苯乙基）氨基）-3-苯氧基丙烷-2-醇（SPI009）能夠迅速損傷細(xì)菌的內(nèi)外膜，殺死處于持留狀態(tài)的革蘭陰性和革蘭陽性病原體[52]。同理，超短肽類藥物能夠引起分枝桿菌的膜損傷，顯著降低小鼠肺部的細(xì)菌載量[53]。硼霉素能夠使膜電位去極化、細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低和蛋白質(zhì)泄露，殺死持留的結(jié)核分枝桿菌，對其他的革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌和糞腸桿菌也表現(xiàn)出較好的生長抑制和殺菌活性[54]。電化學(xué)處理后細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增加，介導(dǎo)銅綠假單胞菌細(xì)胞膜通透性改變，從而增強妥布霉素對持留菌的根除[55]。此外，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的抗癌藥物順鉑（順式-二氨二氯合鉑）能形成DNA交聯(lián)，通過與生長無關(guān)的機制根除大腸埃希菌K-12的持留菌[56]。

4.2 促進(jìn)持留菌的代謝或增加抗生素內(nèi)流

由于大多數(shù)抗生素通過破壞細(xì)菌的DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的合成來進(jìn)行殺菌，因此刺激持留菌的代謝可以增強抗生素的活性。研究表明脂肪酸信號分子順式-2-癸烯酸能夠刺激銅綠假單胞菌和大腸埃希菌持留菌的代謝，使細(xì)菌從休眠狀態(tài)進(jìn)入代謝狀態(tài)，從而恢復(fù)持留菌對抗生素的敏感性[57]。除了添加外源物質(zhì)刺激持留菌的代謝，脈沖式給藥也可促進(jìn)持留菌從休眠狀態(tài)到活性狀態(tài)的過渡：在使用阿莫西林或頭孢曲松處理伯氏疏螺旋體培養(yǎng)物處理后，去除殘留的抗生素，存活的持留菌在新鮮培養(yǎng)基中復(fù)蘇，再讓其暴露在抗生素中再進(jìn)行同樣的步驟。經(jīng)過反復(fù)處理4輪后，阿莫西林處理后的培養(yǎng)物持留菌明顯減少，而頭孢曲松處理的培養(yǎng)物中細(xì)菌被完全根除[19]。這種脈沖式給藥實驗表明該方法可用于常規(guī)抗生素治療疾病來達(dá)到清除病原體的目的。

改變細(xì)胞膜的通透性或者破壞細(xì)胞膜能使抗生素更易流入細(xì)胞，從而提高抗生素濃度來進(jìn)行殺菌。快速冷凍會導(dǎo)致持留菌的細(xì)胞膜不穩(wěn)定，激活機械敏感離子通道McsL，從而增加細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的攝取，增強了抗生素的殺菌效果[58]。卡那霉素與富含脯氨酸的P14LRR抗菌肽的偶聯(lián)物P14KanS通過選擇性地破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜及生物膜，增加抗生素內(nèi)流，提高抗生素的殺傷效率[59]。

4.3 藥物聯(lián)合治療

持留菌形成機制的復(fù)雜性也對單一靶點的抗生素帶來了巨大挑戰(zhàn)。藥物聯(lián)合療法能夠利用已知藥物，降低開發(fā)的新藥成本，且有利于藥物不同靶點之間的協(xié)同作用，從而達(dá)到根除持留菌的目的。盡管持留菌處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞膜的完整性對其維持正常的生理也極為重要。抗菌肽能夠靶向細(xì)菌的細(xì)胞膜來破壞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而使藥物能夠輕松穿過持留菌的膜屏障。例如黏菌素與阿米卡星的聯(lián)合使用可以通過改變持留菌的細(xì)胞膜電位及形態(tài)來治療鮑曼不動桿菌感染[60]。持留菌可以產(chǎn)生生物膜來保護細(xì)菌免受抗生素的殺傷，而黏菌素與紅霉素的組合可以清除銅綠假單胞菌形成的生物膜，提高抗生素的治療效果[61]。此外，其他具有生物活性或者低細(xì)胞毒性的化合物也可以作為佐劑與抗生素聯(lián)合使用，提高抗生素的殺菌效率[62]。半胱氨酸的加入增強了異煙肼對結(jié)核分枝桿菌的殺傷作用，可能是半胱氨酸在氧化成胱氨酸的過程中產(chǎn)生大量的ROS造成的[63]。合成的類視黃醇CD437和CD1530能夠破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，與慶大霉素具有協(xié)同作用，能夠殺滅持留的金黃色葡萄球菌[64]。

4.4 干擾與細(xì)菌持留形成的相關(guān)因子

隨著對持留菌形成機制研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)可以通過干擾持留形成的過程，來減少持留菌生成的數(shù)量。毒素-抗毒素系統(tǒng)常常被認(rèn)為與持留菌的形成相關(guān)，前期的研究發(fā)現(xiàn)，3種中鏈不飽和脂肪酸乙酯：反式-2-癸烯酸乙酯、反式-2-辛烯酸乙酯和順式-4-癸烯酸乙酯在與環(huán)丙沙星或者氨芐西林抗生素聯(lián)合使用時都能夠通過調(diào)節(jié)抗毒素蛋白HipB來降低持留菌的生成[65]。葉酸能參與到許多生物代謝途徑如氨基酸、蛋白質(zhì)、嘌呤和嘧啶等的合成，對細(xì)菌維持正常的生理功能極為重要[66]。葉酸拮抗劑的添加擾亂了細(xì)菌正常的葉酸代謝，降低了在氨芐西林或氧氟沙星抗生素下形成的持留菌數(shù)量[67]。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)對細(xì)菌激活生存策略如進(jìn)入靜止期、生成孢子或者生物膜的形成都至關(guān)重要，而（p）ppGpp的積累能誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)。化合物Relacin能夠抑制RelA的合成酶活性，影響革蘭陽性菌進(jìn)入靜止期并導(dǎo)致細(xì)菌死亡[68]。細(xì)菌能通過群體感應(yīng)過程中的信號分子來調(diào)節(jié)毒力基因的表達(dá)及生物膜的形成，其中2-氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone， 2-AA）由QS調(diào)節(jié)因子MvfR通過pqsABCDE操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行控制合成。2-AA通過能響應(yīng)群體信號的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞翻譯相關(guān)基因的表達(dá)來介導(dǎo)細(xì)菌持留。MvfR拮抗劑M64能夠降低2-AA的合成，降低銅綠假單胞菌形成持留菌的能力。當(dāng)M64與環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時能夠徹底清除小鼠體內(nèi)的感染，且防止細(xì)菌的重新定植[69-70]。

5 展望

本文主要闡述了持留菌與臨床疾病之間的聯(lián)系、其形成機制及對持留菌的防治手段（圖1）。雖然近年來對持留菌的研究已經(jīng)有了不少突破，但目前仍有較多領(lǐng)域有待進(jìn)一步推進(jìn)。例如，如何快速確認(rèn)哪種機制介導(dǎo)了臨床菌株的持留形成，這有助于防治策略的制定；環(huán)境中的微生物種類往往并不單一，微生物組與某類細(xì)菌的持留是否存在聯(lián)系；細(xì)菌自身的代謝停滯導(dǎo)致持留的產(chǎn)生，反之宿主代謝微環(huán)境是否會影響細(xì)菌持留的產(chǎn)生或防治；細(xì)菌持留會增加抗生素耐藥性，而特定針對持留菌的療法是否有助于抵擋抗生素耐藥危機？對于這些問題的深入探究，有助于推動抗持留菌藥物及其他防治策略的開發(fā)，對未來根除持留菌，成功治療慢性感染有重大意義。

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