奧替溴銨抑制革蘭陽性菌生長與生物被膜形成的活性及機制研究

摘要：目的 探究奧替溴銨抑制革蘭陽性菌生長及抑制生物被膜活性和作用機制。方法 采用肉湯稀釋法測定奧替溴銨對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和無乳鏈球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并通過生長曲線分析奧替溴銨對浮游菌生長的影響，殺菌曲線評估奧替溴銨殺菌活性；結(jié)晶紫染色生物被膜含量測定和激光共聚焦顯微鏡檢測奧替溴銨的抗生物被膜活性；定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究奧替溴銨對金黃色葡萄球菌的抗菌機制。結(jié)果 奧替溴銨對革蘭陽性菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性和殺菌活性，MIC90≤12.5 μmol/L，奧替溴銨在1/2×MIC濃度時對細菌生長有顯著的抑制作用；此外，奧替溴銨能夠以劑量依賴形式抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，同時可滅殺成熟生物被膜中的細菌；蛋白質(zhì)組分析顯示奧替溴銨處理能夠顯著抑制細菌初級代謝過程，誘導(dǎo)過氧化應(yīng)激。結(jié)論 奧替溴銨對革蘭陽性菌具有較佳的抗菌活性和抗生物被膜活性，通過抑制細菌初級代謝和引發(fā)過氧化應(yīng)激達到抑菌效果。

關(guān)鍵詞：老藥新用；奧替溴銨；革蘭陽性菌；生物被膜；抗菌活性

中圖分類號：R978.1 文獻標(biāo)志碼：A

Antibacterial and anti-biofilm activities of otilonium bromide and its antibacterial mechanism against Gram-positive bacteria

Wen Ze-wen1，2， Chen Cheng-chun2， Shen Zong-lin2， Deng Xiang-bin1，2， Deng Qi-wen1，2， and Yu Zhi-jian1，2

（1 Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging， School of Biomedical Engineering， Shenzhen University Health Science Center， Shenzhen 518073; 2 Department of Infectious Diseases and Shenzhen Key Laboratory for Endogenous Infections， Huazhong University of Science and Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen 518052）

Abstract Objective This study aims to explore antibacterial and anti-biofilm activities of otilonium bromide and its antibacterial mechanism against Gram-positive bacteria. Methods The MIC of otilonium bromide against Staphylococcus aureus， Staphylococcus epidermidis， Enterococcus faecalis， Enterococcus faecium， and Streptococcus agalactiae was determined by the broth dilution method， and the inhibitory effect of otilonium bromide on the growth of planktonic cells was assessed by growth curve. Crystal violet staining and confocal laser scan microscopy were performed to evaluate the anti-biofilm activity of otilonium bromide. The antibacterial mechanism of otilonium bromide against S. aureus was studied by quantitative proteomics. Results The MIC90 of otilonium bromide against all Gram-positive bacteria tested were all ≤12.5 μmol/L， otilonium bromide significantly inhibited the growth of planktonic cells at subinhibitory concentration of 1/2×MIC concentration. In addition， otilonium bromide could inhibited the biofilm formation of S. aureus in a dose-dependent manner as well as killed bacteria embedded in mature biofilm. Proteomic analysis showed that otilonium bromide significantly inhibited the primary metabolic process and induced oxidative stress response. Conclusion Otilonium bromide exhibited antibacterial and anti-biofilm activities against Gram-positive bacteria， and the antibacterial mechanisms of otilonium bromide against otilonium bromide may be related to disrupting the primary metabolic process and inducing oxidative stress.

Key words Drug repurposing; Otilonium bromide; Gram-positive bacteria; Biofilm; Antibacterial activity

革蘭陽性菌（包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌等）是社區(qū)感染和院內(nèi)感染的常見病原菌[1]。革蘭陽性菌對抗生素表現(xiàn)出固有耐藥和獲得性耐藥，隨著抗菌藥物的廣泛使用，近年來革蘭陽性菌對頂級抗生素（包括萬古霉素、利奈唑胺、達托霉素等）耐藥的相關(guān)報道逐漸增加，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)[2-3]。如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的檢出率不斷上升，在世衛(wèi)組織抗生素耐藥“重點病原體”清單中處于高度優(yōu)先地位[4]。此外，常見革蘭陽性細菌治療另一難點問題是較高比例容易形成生物被膜，也是臨床治療革蘭陽性菌感染效果不佳的重要原因之一[5]。生物被膜的形成可降低對抗菌藥物的敏感性，并逃避宿主免疫細胞的攻擊和吞噬，當(dāng)抗生素濃度下降時，細菌會增殖重新填充生物膜，并脫落到周圍組織和血液中，導(dǎo)致復(fù)發(fā)，造成慢性感染和遷延不愈[6]。因此，開發(fā)既能抑制細菌生長又能抑制生物被膜形成的新型抗金葡菌感染藥物已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點方向之一[7]。

鑒于全新抗菌藥物研發(fā)面臨周期長，投入大，風(fēng)險高的挑戰(zhàn)，近年來，篩選鑒定已批準臨床藥物的抑菌活性成為新型抗菌藥物研發(fā)的一種新策略[8]。通過這種老藥新用的方法發(fā)現(xiàn)的藥物因具有全面的毒理學(xué)和藥理學(xué)信息，可以降低新藥開發(fā)的成本和時間，加快其在臨床治療中的應(yīng)用[9]。

在對臨床化合物庫的抑菌活性篩選過程中，我們發(fā)現(xiàn)解痙類藥物奧替溴銨（otilonium bromide）對多種革蘭陽性菌表現(xiàn)出廣譜的生長抑制作用。本文深入研究了奧替溴銨對多種革蘭陽性菌的抗菌活性及抗生物被膜活性；通過奧替溴銨對浮游菌生長曲線、殺菌曲線和蛋白質(zhì)組的影響，初步探討奧替溴銨對革蘭陽性菌的作用機制，為奧替溴銨的老藥新用和基于以奧替溴銨為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

本研究中使用的40株金黃色葡萄球菌，包括20株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）和20株MRSA、20株表皮葡萄球菌、20株糞腸球菌、20株屎腸球菌和10株無乳鏈球菌臨床株收集于2015年至2018年華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院不同住院患者。所有臨床菌株都通過Phoenix 100自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，繼代培養(yǎng)后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對所有菌株進行重新鑒定。質(zhì)量控制菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213和SA113均購自ATCC菌株庫。

1.1.2 主要儀器和試劑

微量移液器（德國Eppendorf公司），Phoenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)（美國BD公司），全自動生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)IVD MALDI Biotyper（德國Bruker公司），全自動生長曲線分析儀（芬蘭Bioscreen公司），Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國Thermofisher Scientific公司），激光掃描共聚焦顯微鏡FV3000（日本Olympus公司）。奧替溴銨（美國MedChemExpress公司），結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司），葡萄糖（北京索萊寶科技有限公司），RIPA裂解液（上海翌圣生物科技股份有限公司），Micro BCA 蛋白定量試劑盒 （美國Thermofisher Scientific公司），Complete protease inhibitor cocktail蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司），DTT（大連美侖生物有限公司），破碎珠（美國Biospec公司，貨號：11079101z）。

1.2 方法

1.2.1 微量肉湯稀釋法檢測最低抑菌濃度（MIC）

取過夜培養(yǎng)菌液調(diào)整至1.5×108CFU/mL，用CAMHB培養(yǎng)基1：100稀釋后加入96孔板，每孔100 μL，同時利用CAMHB培養(yǎng)基對藥物進行梯度稀釋后添加100 μL至96孔板。每孔最終含200 μL CAMHB培養(yǎng)基，其中藥物終濃度設(shè)置10個梯度（分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78和0.39 μmol/L），第11孔加入200 μL上述菌液設(shè)為陽性對照，第12孔加入200 μL CAMHB培養(yǎng)基設(shè)為陰性對照。各抗菌藥物的MIC值測定培養(yǎng)條件和時間按照CLSI指南進行， 37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果，以肉眼不能看見菌液沉淀的藥物濃度孔計算為MIC值。

1.2.2 殺菌曲線分析

對數(shù)期（A600=0.5）的菌液稀釋100倍，分別與1×MIC，2×MIC和4×MIC奧替溴銨后置于搖床200 r/min孵育。隨后，分別在0、3、6和24 h采集樣品利用無菌生理鹽水進行連續(xù)梯度稀釋，并涂布在TSB平板上37℃孵育，24 h后菌落計數(shù)。菌落計數(shù)以CFU/mL表示。

1.2.3 亞抑菌濃度生長曲線分析

取過夜培養(yǎng)菌液用胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soybean broth，TSB）培養(yǎng)基稀釋1000倍后加入96孔板，添加不同濃度（1/8×MIC，1/4×MIC，1/2×MIC和1×MIC）奧替溴銨后置于全自動生長曲線分析儀中，每間隔1 h測定600 nm波長吸光度（A600）吸光值用于代表浮游菌含量，并繪制生長曲線。

1.2.4 結(jié)晶紫法測定生物被膜

采用結(jié)晶紫染色法檢測生物被膜量的變化，重復(fù)3次，每次設(shè)3個復(fù)孔，取平均值為最終檢測結(jié)果。操作步驟簡述如下，取過夜菌液用含2%葡萄糖的TSB培養(yǎng)基稀釋1000倍于96孔板中，每組3個復(fù)孔，添加不同亞抑菌濃度奧替溴銨，以不添加菌液的空白培養(yǎng)基作為陰性對照，溶劑DMSO為陽性對照。于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后，輕柔吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS沖洗3次，室溫下晾干。甲醇固定15 min，1%結(jié)晶紫染液染色15 min，無菌水沖洗3次至對照孔為無色，室溫下晾干。每孔加入200 μL無水乙醇溶解，震蕩1 min于酶標(biāo)儀測定570 nm吸光值。

1.2.5 激光共聚焦觀察生物被膜中活菌數(shù)量的檢測

采用玻璃平皿法構(gòu)建生物被膜，通過激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜中的活菌變化，步驟簡述如下：在底部鑲嵌玻璃的培養(yǎng)碟中接種MRSA臨床株YUSA145，然后放入錫箔盒中包好靜置于37℃培養(yǎng)24 h，用無菌0.9% NaCl洗3次后，加入含不同濃度奧替溴銨的TSBG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無菌PBS洗滌后，然后加入Live/Dead染液，室溫下靜置染色30 min，隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 蛋白質(zhì)組樣品制備

指數(shù)生長期（A600約為0.5）的MRSA臨床株YUSA145加入奧替溴銨至最終濃度為6.25 μmol/L （1/2×MIC），對照組用相同體積的溶劑DMSO處理，每組設(shè)置3個重復(fù)。然后將細菌在37℃培養(yǎng)箱200 r/min孵育2 h。之后菌液在4℃，5000 r/min離心10 min收集菌體。用預(yù)冷PBS洗滌3次后，將細菌懸浮在添加蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解緩沖液（1% Triton X-100，1%脫氧膽酸鹽，0.1% SDS）中。懸浮液用直徑為0.1 mm的玻璃珠破壁3×1 min后，在4℃，12000 g離心20 min，收集上清用BCA法進行蛋白濃度測定。取100 μg蛋白質(zhì)用10 mmol/L DTT在70℃下還原1 h，然后在室溫黑暗中用50 mmol/L碘乙酰胺烷基化15 min。接著用100 μL 0.5 mol/L碳酸氫銨脫鹽3次，使用Amicon超離心過濾器（lt;10 kDa cut-off））。以總蛋白1：50的比例添加胰蛋白酶在37℃下消化過夜，然后凍干保存在-80℃待質(zhì)譜分析。

1.2.7 Nano LC-MS/MS定量蛋白質(zhì)

已消化的蛋白樣本重新溶解于30 μL 0.1%的甲酸中，取其中4 μL注入到一個液相色譜（LC）系統(tǒng)，液相色譜系統(tǒng)由UltiMate 3000 RSLC nano液相色譜，C18柱（100 μm×20 mm，3μm）和C1分離柱（75 μm×

250 mm，2 μm）。流動相A和B分別由0.1%甲酸和含0.1%甲酸的80%乙腈組成。洗脫系統(tǒng)的流速為300 nL/min，前5 min為5% B，其后85 min從5%到38% B線性梯度增加，在接下來的2 min從38%到95% B增加，維持3 min 95% B。液相色譜系統(tǒng)與配備納米噴霧電離（NSI）接口的Q Exactive Plus質(zhì)譜聯(lián)用。質(zhì)譜1掃描的質(zhì)量范圍為300～1500 m/z，分辨率為70000，相應(yīng)的質(zhì)譜2分辨率為17500，最大采集時間為50 ms。所有的多電荷離子被用來觸發(fā)MS-MS掃描，然后進行30 s的動態(tài)排除。排除了單電荷前驅(qū)離子和不確定帶電狀態(tài)的離子。

1.2.8 定量蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)分析

利用Proteome Discoverer 2.4和Sequest HT與金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus （Strain NCTC 8325/PS 47）的Uniprot蛋白組比對搜庫進行蛋白鑒定和定量。在至少兩個技術(shù)重復(fù)中，表達變化1.5倍（Plt;0.05）以上確定上調(diào)和下調(diào)的蛋白。將差異表達蛋白上傳到OMICSBEAN數(shù)據(jù)庫（http：//www.omicsbean.com）進行基因本體（Gene Ontology，GO）注釋，包括生物過程、細胞成分、分子功能和KEGG通路分析。利用STING對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network）進行了分析。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪制圖像。Plt;0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 奧替溴銨對革蘭陽性菌的抑菌活性

利用微量肉湯稀釋法測定奧替溴銨對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和無乳鏈球菌的MIC值結(jié)果顯示，奧替溴銨對多種革蘭陽性菌具有較佳的抑菌活性，MIC值主要分布在1.56 μmol/L ≈0.88 μg/mL）到12.5 μmol/L（≈7.0 μg/mL）之間（表1）。其中，對表皮葡萄球菌抑制效果極佳，MIC90僅為

3.13 μmol/L。生長曲線分析表明，在1/2×MIC濃度下，奧替溴銨會顯著抑制金黃色葡萄球菌浮游菌的生長，但不影響最大生長水平，而濃度達到1×MIC時，浮游菌的生長完全被抑制（圖1）。這些結(jié)果初步表明奧替溴銨具有作為抗革蘭陽性菌感染藥物的潛力。

為了研究奧替溴銨對革蘭陽性菌抗菌活性的時間和劑量依賴效應(yīng)，并與抗生素利奈唑胺和萬古霉素的活性進行比較，進行了殺菌曲線分析。如圖2所示，奧替溴銨在2×MIC在觀察到對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌有較好的殺菌效果，在4×MIC濃度下對金黃色葡萄球菌臨床株（包括MRSA臨床株YUSA80和MRSA臨床株YUSA145）和糞腸球菌臨床株都表現(xiàn)出有較強的殺菌作用，在6 h內(nèi)細菌計數(shù)降低到檢測下限，殺菌效果強于4×MIC利奈唑胺和萬古霉素。

2.2 奧替溴銨表現(xiàn)出抗生物被膜活性

以金黃色葡萄球菌（MSSA和MRSA各6株）為對象研究奧替溴銨的抗生物被膜活性，用結(jié)晶紫染色對生物被膜半定量分析，當(dāng)奧替溴銨為1/4×MIC時，所有被檢測的金黃色葡萄球菌株，無論是MSSA還是MRSA，形成的生物被膜生物量顯著減少（圖3a）。當(dāng)奧替溴銨濃度在1/2×MIC時，所有MSSA的生物被膜形成被抑制50%以上，表明奧替溴銨顯著抑制了金黃色葡萄球菌生物膜的形成。用激光共聚焦顯微鏡進一步觀察奧替溴銨對成熟生物膜的影響，SYTO9和PI分別可將活細胞和死細胞染為綠色和紅色。當(dāng)奧替溴銨濃度為4×MIC時，與對照組相比，死亡細胞的比例（紅色）顯著增加（圖3b），說明奧替溴銨可減少成熟生物被膜中的細菌數(shù)量。綜上所述，奧替溴銨具有較佳的抗生物被膜活性。

2.3 奧替溴銨對金黃色葡萄球菌的抗菌作用機制

為了分析奧替溴銨對金黃色葡萄球菌的抗菌作用機制，我們采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析金黃色葡萄球菌1/2×MIC濃度奧替溴銨脅迫下的蛋白質(zhì)組差異。通過LC-MS/MS分析，總共鑒定出1315個蛋白（匹配肽段≥1，F(xiàn)DRlt;0.01）。我們將表達變化（FC）gt;1.5且Plt;0.05作為截斷值確定顯著差異表達蛋白，火山圖顯示共有53個差異表達蛋白，其中25個表達上調(diào)，28個表達下調(diào)（圖4a）。為了分析奧替溴銨對金黃色葡萄球菌生理功能及代謝通路的影響，我們使用Omicsbean數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行了基因本體論（gene onotology，GO）注釋分析，根據(jù)差異蛋白參與的生物過程對其進行分組，如圖4b所示，對奧替溴銨做出響應(yīng)的蛋白質(zhì)類別和功能主要富集在有機物與有機酸代謝過程、蛋白折疊與代謝、氧化還原過程和酮酸代謝過程。KEGG分析顯示差異蛋白參與的代謝通路富集于微生物代謝環(huán)境應(yīng)激、氯烷烴與氯烯烴降解、丙酮酸代謝、脂肪酸合成與降解和萘降解途徑。

利用STING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了差異表達蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示表達下調(diào)蛋白之間相互作用主要集中在乙醇脫氫酶、醛醇脫氫酶AdhE、乙醛脫氫酶、甲酸脫氫酶、硝酸還原酶、同化硝酸還原酶、4-羥基二吡啶酸合成酶、丙酮酸氧化酶和甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，這些蛋白質(zhì)主要參與的代謝路徑為微生物環(huán)境應(yīng)激、脂肪酸降解和丙酮酸代謝。表達上調(diào)蛋白富集于蛋白質(zhì)生物合成過程，包括核糖體組分蛋白如RplE、RpsH、RplR和RplN，Clp蛋白酶亞基ClpB和ClpC，分子伴侶蛋白DnaK和GroL， 精氨酸- tRNA連接酶，核糖體成熟因子RbfA和折疊蛋白PrsA。初級代謝過程相關(guān)蛋白如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，乙酰輔酶A羧化酶亞基AccD，琥珀酸-輔酶A連接酶亞基SucD，甘油激酶和天冬氨酸-半醛脫氫酶Asd（圖5b）。

3 討論

耐藥革蘭陽性菌的出現(xiàn)導(dǎo)致傳統(tǒng)抗生素治療失效，給臨床治療革蘭陽性菌感染帶來嚴重的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要探索具有新型抗菌機制、打破細菌耐藥障礙的創(chuàng)新高效抗菌藥物。因為不需要經(jīng)過大量的藥理學(xué)優(yōu)化程序，“老藥新用”即藥物的重新利用已經(jīng)成為一種有吸引力的新型抗菌藥物開發(fā)新策略[10]。為了篩選對革蘭陽性菌具有抗菌活性的臨床藥物，對FDA批準的臨床藥物文庫進行了篩選，發(fā)現(xiàn)奧替溴銨表現(xiàn)出抑菌活性并對此進行了進一步的鑒定。奧替溴銨是一種季銨鹽衍生物，具有解痙活性，臨床上廣泛用于治療腸易激綜合征（IBS）患者[11]。本文的結(jié)果表明，奧替溴銨對臨床分離的多種革蘭陽性菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和無乳鏈球菌具有較佳的抗菌活性，特別是表皮葡萄球菌，MIC90僅為3.13 μmol/L，奧替溴銨對MRSA和利奈唑胺中介及耐藥糞腸球菌等臨床耐藥菌表現(xiàn)出較強的抑制作用。與MSSA相比，MRSA的本質(zhì)區(qū)別在于其通過基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer， HGT）方式獲得了葡萄球菌染色體mec基因盒（Staphyloccoccal cassette chromosome mec，SCCmec），SCCmec編碼的mecA或mecC基因賦予其對甲氧西林耐藥和β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥[12]。此外，SCCmec通常還編碼有其它抗性基因，并可通過促進耐藥基因的基因水平轉(zhuǎn)移等機制，使MRSA對氯霉素類、林可霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素以及喹諾酮類抗生素都存在不同程度的耐藥[13]。奧替溴銨對MSSA和MRSA的MIC50和MIC90相同，說明其抗菌作用機制可打破MRSA的耐藥屏障。有研究顯示在口服80 mg劑量的情況下，奧替溴銨的最大血漿濃度可達4.37 μg/mL[14]。此外，在口服240 mg劑量奧替溴銨的情況下，未觀察到明顯的毒副作用[15]，意味著在安全劑量下，奧替溴銨的血漿濃度可超過大部分革蘭陽性菌株的MIC值，具有較好的臨床應(yīng)用前景。小鼠腹腔感染模型也證實了奧替溴銨對金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抗菌活性[16]。革蘭陽性菌生物被膜的形成是導(dǎo)致慢性感染的重要毒力因素[17]，傳統(tǒng)抗生素中只有少數(shù)幾個對生物被膜有效。奧替溴銨對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有較強的抑制作用，更重要的是，奧替溴銨還可以穿透成熟生物膜，殺死成熟生物膜中的細菌，這些結(jié)果表明奧替溴銨在臨床生物被膜相關(guān)革蘭陽性菌抗感染治療中具有潛在應(yīng)用價值。最近，有研究顯示多種口服藥物可被腸道微生物代謝，導(dǎo)致藥物的生物利用率降低，如糞腸球菌可將帕金森病的常用藥物左旋多巴降解為多巴胺[18]。因此，通過口服奧替溴銨調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善藥物治療效果，可進一步擴大奧替溴銨的臨床應(yīng)用場景。

闡明抗菌化合物的作用機制既有利于療效改進的優(yōu)良衍生物的改造，又可為新型抗菌化合物的開發(fā)提供新的靶標(biāo)。在本文中，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步研究了奧替溴銨的抗菌機制，奧替溴銨對金黃色葡萄球菌多個代謝路徑產(chǎn)生影響，例如多種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白包括乙醇脫氫酶、醇醛脫氫酶和乙醛脫氫酶的表達被抑制，提示著奧替溴銨脅迫造成細菌生產(chǎn)的還原力下降，氧化還原失衡。氧化應(yīng)激能夠促進6-磷酸葡萄糖進入磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的氧化分支，磷酸戊糖途徑產(chǎn)生5-磷酸核糖和NADPH，NADPH在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，因為它既提供了回收氧化谷胱甘肽的還原力，又可為以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的抗氧化系統(tǒng)提供能量[19-20]。確實，在奧替溴銨處理后我們觀察到磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶表達上調(diào)。同時，抗氧化系統(tǒng)蛋白硫醇過氧化物酶和ClpP蛋白酶相關(guān)亞基表達也上升[21]。硫醇過氧化物酶是一種細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，其作用是維持細胞中活性氧水平的穩(wěn)定性。其表達上調(diào)說明奧替溴銨暴露使細菌處于過氧化應(yīng)激狀態(tài)，有研究顯示ROS的產(chǎn)生可能是抗生素發(fā)揮抗菌活性背后的一個機制[22]。研究顯示ClpP蛋白酶同樣在氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮著重要作用[21]。無乳鏈球菌ClpP蛋白酶缺乏的突變體對氧化脅迫比野生型更敏感[23]。此外，蛋白質(zhì)合成和分選系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達被奧替溴銨激活上調(diào)，可能是由于細菌初級代謝被抑制，蛋白合成處于緊缺狀態(tài)，為了應(yīng)對蛋白質(zhì)合成受阻的狀態(tài)，細菌加速了核糖體的更新及周轉(zhuǎn)，保證維持生命活動基本蛋白質(zhì)的生物合成。在奧替溴銨處理后，Clp蛋白酶clpB、clpC和分子伴侶蛋白DnaK表達上調(diào)，clpL表達下調(diào)，說明奧替溴銨可能引起細菌蛋白酶系統(tǒng)紊亂，DnaK在多種細菌包括大腸埃希菌，李斯特菌和艱難梭菌中都已被證明影響生物被膜形成[24-26]；另有多項研究結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌Clp ATP酶對生物被膜形成有重要影響[27-29]，同時DnaK伴侶系統(tǒng)可與ClpB相互作用協(xié)同分解蛋白質(zhì)聚集體，影響細菌休眠、抗生素耐藥、氧化應(yīng)激和生物被膜形成[30-32]，且蛋白質(zhì)是葡萄球菌生物膜中的主要成分之一。因此，奧替溴銨的抑制生物被膜形成活性可能與蛋白酶系統(tǒng)功能紊亂相關(guān)，然而，具體機制仍需進一步確認。

4 結(jié)論與展望

本文研究顯示奧替溴銨對革蘭陽性菌表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，能夠顯著抑制生物被膜的形成并有效殺死成熟生物被膜中的細菌。此外，通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析了與奧替溴銨抑制金葡菌生長密切相關(guān)的差異表達蛋白及代謝路徑，這些結(jié)果提示奧替溴銨具備治療革蘭陽性菌感染的可能性。然而，奧替溴銨的MIC相比臨床常用抗生素仍然偏高，可能限制其臨床應(yīng)用，而在奧替溴銨的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步改造獲得抗菌活性更佳的衍生物，需要確認奧替溴銨的關(guān)鍵藥效基團。因此，進一步鑒定奧替溴銨發(fā)揮抗金黃色葡萄球菌活性的直接作用靶標(biāo)，對推動基于奧替溴銨的抗菌藥物的發(fā)展具有重要意義。

參 考 文 獻

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2020年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志， 2021， 21（4）： 377-387.

Davies J， Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2010， 74（3）： 417-433.

Huemer M， Mairpady Shambat S， Brugger S D， et al. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives[J]. EMBO reports， 2020， 21（12）： e51034.

Tacconelli E， Carrara E， Savoldi A， et al. Discovery， research， and development of new antibiotics： The WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis[J]. Lancet Infect Dis， 2018， 18（3）： 318-327.

Mohammed Y H E， Manukumar H M， Rakesh K P， et al. Vision for medicine： Staphylococcus aureus biofilm war and unlocking key’s for anti-biofilm drug development[J]. Microb Pathog， 2018， 123： 339-347.

劉明君， 張永利， 萬獻堯. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物被膜研究進展[J]. 中華內(nèi)科雜志， 2020， 59（6）：" 473-476.

Xu L， She P， Chen L， et al. Repurposing candesartan cilexetil as antibacterial agent for MRSA infection[J]. Front Microbiol， 2021， 12： 688772.

盛苗苗， 蔣澄宇. 精確醫(yī)學(xué)為老藥新用及聯(lián)合用藥帶來新契機[J]. 生命科學(xué)， 2015， 27（3）： 322-326.

Corsello S M， Bittker J A， Liu Z， et al. The drug repurposing hub： A next-generation drug library and information resource[J]. Nature medicine， 2017， 23（4）： 405-408.

Nosengo N. Can you teach old drugs new tricks？[J]. Nature， 2016， 534（7607）： 314-316.

Forte E， Pizzoferrato M， Lopetuso L， et al. The use of anti-spasmodics in the treatment of irritable bowel syndrome： focus on otilonium bromide[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2012， 16（1）： 25-37.

Lee A S， De Lencastre H， Garau J， et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Nat Rev Dis Primers， 2018， 4： 18033.

Lakhundi S， Zhang K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus： Molecular characterization， evolution， and epidemiology[J]. Clin Microbiol Rev， 2018， 31（4）： e00020-18.

Zhao Y R， Ding L， Fan H W， et al. Determination of the unstable drug otilonium bromide in human plasma by LC-ESI-MS and its application to a pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B， 2010， 878（28）： 2896-2900.

Sutton J A， Kilminster S G， Mould G P. The clinical pharmacology of single doses of otilonium bromide in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 1997， 52（5）： 365-369.

Zhou L， She P， Tan F， et al. Repurposing antispasmodic agent otilonium bromide for treatment of Staphylococcus aureus infections[J]. Front Microbiol， 2020， 11： 1720.

Schilcher K， Horswill A R. Staphylococcal biofilm development： structure， regulation， and treatment strategies[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2020， 84（3）： e00026-19.

Maini Rekdal V， Bess E N， Bisanz J E， et al. Discovery and inhibition of an interspecies gut bacterial pathway for Levodopa metabolism[J]. Science， 2019， 364（6445）： eaau6323.

Mullarky E， Cantley L C. Diverting glycolysis to combat oxidative stress. In： Nakao K， Minato N， Uemoto S， editors. Innovative medicine： basic research and development[M]. Tokyo： Springer， 2015： 3-23.

Christodoulou D， Link H， Fuhrer T， et al. Reserve flux capacity in the pentose phosphate pathway enables Escherichia coli's rapid response to oxidative stress[J]. Cell systems， 2018， 6（5）： 569-578.e7.

Michel A， Agerer F， Hauck C R， et al. Global regulatory impact of ClpP protease of Staphylococcus aureus on regulons involved in virulence， oxidative stress response， autolysis， and DNA repair[J]. J Bacteriol， 2006， 188（16）： 5783-5896.

Van Acker H， Coenye T. The role of reactive oxygen species in antibiotic-mediated killing of bacteria[J]. Trends Microbiol， 2017， 25（6）： 456-466.

Nair S， Poyart C， Beretti J L， et al. Role of the Streptococcus agalactiae ClpP serine protease in heat-induced stress defence and growth arrest[J]. Microbiology， 2003， 149（Pt 2）： 407-417.

Van Der Veen S， Abee T. HrcA and DnaK are important for static and continuous-flow biofilm formation and disinfectant resistance in Listeria monocytogenes[J]. Microbiology， 2010， 156（Pt 12）： 3782-3790.

Arita-Morioka K， Yamanaka K， Mizunoe Y， et al. Novel strategy for biofilm inhibition by using small molecules targeting molecular chaperone DnaK[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2015， 59（1）： 633-641.

Jain S， Smyth D， O'hagan B M G， et al. Inactivation of the dnaK gene in Clostridium difficile 630 Δerm yields a temperature-sensitive phenotype and increases biofilm-forming ability[J]. Scientific reports， 2017， 7（1）： 17522.

Frees D， Chastanet A， Qazi S， et al. Clp ATPases are required for stress tolerance， intracellular replication and biofilm formation in Staphylococcus aureus[J]. Mol Microbiol， 2004， 54（5）： 1445-1462.

Liu Q， Wang X， Qin J， et al. The ATP-dependent protease ClpP inhibits biofilm formation by regulating Agr and cell wall hydrolase Sle1 in Staphylococcus aureus[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2017， 7： 181.

Ju Y， An Q， Zhang Y， et al. Recent advances in Clp protease modulation to address virulence， resistance and persistence of MRSA infection[J]. Drug Discov Today， 2021， 26（9）： 2190-2197.

Yamanaka T， Furukawa T， Matsumoto-Mashimo C， et al. Gene expression profile and pathogenicity of biofilm-forming Prevotella intermedia strain 17[J]. BMC Microbiol， 2009， 9： 11.

Pu Y， Li Y， Jin X， et al. ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance[J]. Molecular Cell， 2019， 73（1）： 143-156.e4.

Peyrusson F， Nguyen T K， Najdovski T， et al. Host cell oxidative stress induces dormant Staphylococcus aureus persisters[J]. Microbiol Spectr， 2022， 10（1）： e0231321.