幽門螺桿菌感染性慢性胃炎模型小鼠腸道各區域的菌群分布特征及其機制

覃艷春, 黃衍強, 陸 鋼, 黃干榮, 唐華英, 戴園園

（1.右江民族醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學教研室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院燒傷整形與創面修復外科，廣西 百色 533000）

幽門螺桿菌（Helicobacter Pylori，Hp）是人類胃中定植的病原體，可誘發消化性潰瘍等胃腸道疾病［1］，引起上腹疼痛、惡心和噯氣等一系列癥狀，Hp感染介導機體免疫應答，同時促進胃腸黏膜的自噬，進而影響腸道菌群［2］。腸道菌群在人體的代謝、生理和免疫系統中發揮重要作用［3-6］，腸道微生物與腫瘤、糖尿病、帕金森病、神經系統疾病和自閉癥譜系障礙等疾病緊密相關［7-11］。隨著測序技術的發展，國內外學者對Hp 感染與胃腸道微生物群之間關系進行一系列的探索，但多數集中在胃菌群和糞便標本上［12-14］，且尚不清楚糞便樣本在多大程度上反映其他腸道區域的微生物組，Hp 感染后腸道各區域菌群的特征迄今尚未見報道。本研究采用16SrRNA 高通量測序技術，探討Hp 感染性慢性胃炎模型小鼠十二指腸、空腸和結腸腸道菌群種類、特征及菌群差異，為基于腸道菌群根除 Hp感染以預防胃癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器30 只6～8 周齡SPF 級C57BL/6 小鼠，體質量（20.0±2.0）g，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0063。DNA 提取試劑盒（美國OMEGA 公司，貨號：M5635-02），Qubit4.0 DNA 檢測試劑盒（美國ThermoFisher 公司，貨號：Q32854），PCR 擴增試劑盒（中國Yeasen 公司，貨號：10105ES03），DNA 分選磁珠（中國Yeasen 公司，貨號：12601ES56），HE 染色液套裝（中國Servicebio 公司，貨號：G1003）。病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016），正置光學顯微鏡（日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse E100），臺式離心機（美國Thermo Fisher 公司，型號：Pico-21），混勻型干式恒溫器（深圳拓能達科技有限公司，型號：TND03-H-H），凝膠成像系統（上海復日科技有限公司，型號：FR-1000），QubitR 4.0 熒光計（美國ThermoFisher 公司，型號：Q33226），PCR 儀（北京東勝創新生物科技有限公司，型號：ETC 811）。

1.2 Hp 感染性慢性胃炎小鼠模型的建立根據本校黃衍強博士專利（專利號：ZL2019 1 0245354.5）建模，將30 只6～8 周齡C57BL/6 小鼠隨機分為對照組和感染組，每組15 只。感染組小鼠采用臨床分離的Hp 菌株稀釋為1×109CFU·mL－1懸液灌胃，每只0.5 mL，每2 天1 次，共5 次，灌胃前禁食禁水12 h，灌胃結束后禁食禁水4 h，對照組小鼠以等量生理鹽水灌胃；末次灌胃2 周后隨機取3 只模型組小鼠和1 只對照組小鼠進斷頸處死，取胃組織分為2 份，1 份行常規HE 染色，病理檢查分析，1 份行組織勻漿，進行系列稀釋后培養，觀察Hp定植情況，定植1×105CFU·mL－1及以上判定為定植成功。如2 周不能定植，則灌胃2 周后同樣方法觀察胃黏膜定植和炎癥情況。定植成功則判定為模型建立成功。

1.3 樣本采集最后確認感染組有9 只小鼠建模成功。9 只造模成功的小鼠分為S1、S2 和S3 組（每組3 只）；將S1、S2 和S3 組小鼠的十二指腸、空腸和結腸命名為SS1、SS2、SS3，SK1、SK2、SK3，SJ1、SJ2 和SJ3；對照組小鼠同樣的命名為C1、C2 和C3，并將C1、C2 和C3 的十二指腸、空腸和結腸命名為CS1、CS2、CS3，CK1、CK2、CK3，CJ1、CJ2 和CJ3。

1.4 樣品的擴增建庫與上機信息采集樣品的擴增建庫和上機信息采集由生工生物工程（上海）股份有限生物公司完成。

1.5 信息分析方法Illumina HiseqTM得到的原始圖像數據文件經堿基識別 （base calling）分析轉化為原始測序序列，首先根據overlap 關系進行拼接，區分樣本后對序列質量進行質控和過濾，然后進行操作單元分類（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析和物種分類學分析。基于OTU 聚類分析結果，進行OTU 主成分分析 （principal component analysis，PCA）；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析；在上述分析的基礎上，為了解微生物群落的豐度和多樣性，對同腸段組間進行多樣性分析 （Alpha 多樣性），包括ace 指數、chao 指數、shannon 指數和simpson 指數等統計學分析指數和采用STAMP 軟件可獲得差異有統計學意義物種，組間比較采用Welch’st-test。利用未觀測狀態重建的群落系統發育研究（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUSt）進行基于京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫的功能預測。

1.6 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。Alpha 多樣性分析采用t檢驗，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，樣本間Welch’st-test 分析使用錯誤發現率（false discovery rate，FDR）評估差異的顯著性。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 OTU 聚類分析本研究共得617 309 條序列數，基于有效序列數據以超過97%相似性進行聚類，共注釋5 327 個OTU，每個樣本OTU 統計結果見表1。

表1 樣本 OTU 統計Tab.1 OTU statistics of samples

2.2 2 組樣本間物種分布韋恩圖以OTU 水平為例，樣本間物種分布韋恩圖見圖1，對照組和感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸的OTU 數目為211 個，對照組小鼠十二指腸、空腸和結腸中特有的OTU 數目分別為6、0 和2 個，感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸中特有的OTU數目分別為6、4和96 個。

圖1 各組樣本間OTU 物種分布韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of species distribution among samples in various groups

2.3 OTU PCA 分析通 過R （v3.6.0）語 言ade4 進行統計分析并作圖（圖2），橫坐標第一主成分最大反映樣品間差異的特征值為46.17%；縱坐標第二主成分對最大反映樣品間差異的特征值為24.94%。對照組和感染組小鼠腸道各區域大部分分散存在，有部分重合，主成分的離散差距越近，樣本物種組成越相似。

圖2 各組OUT 的PCA 分析Fig.2 PCA analysis on OUT in various groups

2.4 微生物種群相對豐度圖和優勢物種Heatmap圖使用R（3.6.0）語言檢測樣本在不同分類水平上的群落結構，檢測出各分類等級的優勢菌群豐度和優勢物種，見圖3 和4。豐度圖以門為例見圖3A、以屬水平為例見圖4A，將在所有樣本中豐度占比均小于一定比例 （1%）的物種歸為其他，其余的作為優勢物種進行分析；使用R 語言的gplots package 進行優勢物種Heatmap 分析，以門為例見圖3B、以屬水平為例見圖4B。對照組和感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸中在門、綱、目、科和屬的優勢菌均有差異。

在門水平上（圖3B），18 個樣本共包含7 個門：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門、Candidatus-Saccharibacteria菌門和軟壁菌門。厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和疣微菌門在對照組小鼠十二指腸依次占71.14%、22.01%、3.23%、0.85% 和0.01%；在 空 腸 依 次 占 75.90%、16.94%、3.59%、1.77% 和 0.01%；在 結 腸 依 次 占 49.86%、46.08%、2.23%、2.62%和0.29%；在感染組小鼠十二指腸依次占85.04%、10.29%、1.68%、0.85% 和1.11%，在空腸中依次占50.67%、37.30%、3.07%、2.66%和1.90%，在結腸依次占31.47%、60.50%、0.94%、1.71%和0.03%。

圖3 門水平上的微生物種群分布柱狀圖（A）和豐度熱圖（B）Fig.3 Histogram of distribution （A）and heat map of abundance （B）of microbial population at phylum level

上述優勢菌中的放線菌門多數為益生菌，與對照組比較，感染組小鼠腸道十二指腸、空腸和結腸的放線菌門含量分別低1.55%、0.52%和1.29%。在屬水平上（圖4B），18 個樣本包含21 種優勢菌屬：乳酸菌屬、葡萄球菌屬、Clostridium_ⅩⅣa菌屬、Turicibacter菌屬、阿克曼菌屬、雙歧桿菌屬、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、巴 恩 斯 氏菌屬、脫硫弧菌屬、另枝菌屬和支原體等。

圖4 屬水平上的微生物種群分布柱狀圖（A）和豐度熱圖（B）Fig.4 Histogram of distribution （A）and heat map of abundance （B）of microbial population at genus level

2 組小鼠十二指腸、空腸和結腸中有11 種優勢菌屬，其在各組的豐度比率見表2。上述優勢菌中乳酸菌屬和雙歧桿菌屬多數菌株為益生菌，與對照組比較，感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸中乳酸菌屬豐度比率明顯降低；十二指腸和結腸中雙歧桿菌屬的豐度比率不同程度降低。支原體為感染過程相關的主要菌種，對照組小鼠未檢測到支原體；感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸均有不同豐度比率的支原體。

表2 2 組樣本中11 個菌屬的豐度比率Tab.2 Ratios of abundances of 11 kinds of samples of bacterial in two groups （η/%）

2.5 Alpha 多樣性分析對照組和感染組樣品多樣性統計分析（t檢驗）結果見表3。shannon 指數中小鼠十二指腸和空腸段菌群的多樣性比較差異有統計學意義（P<0.05），感染組細菌的多樣性降低；simpson 指數中小鼠腸道各區域差異菌群的多樣性比較差異有統計學意義（P<0.01），對照組和感染組其他指數細菌的多樣性比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表3 對照組和感染組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性統計Tab.3 Alpha diversity statistics of intestinal microflora of mice in control group and infection group

2.6 2 組小鼠腸道各區域樣本間Welch’st-test 分析分別在各分類等級通過統計學方法檢驗2 組樣本間微生物群落豐度的差異，并使用FDR 評估差異的顯著性。對照組與感染組在門水平和屬水平上Welch’st-test 差異分析結果分別見圖5 和6。圖5和6 中間所示為95%置信度區間內物種分類豐度的差異比例，最右邊的值為P值，以P<0.05 為差異有統計學意義，用紅色標識。此結果與微生物種群相對豐度圖和優勢物種熱圖相符合。

圖5 各組小鼠腸道菌群在門水平Welch’st-test 上差異分析結果Fig.5 Difference analysis results of Welch’st-test of intestinal microflora of mice in various groups at phylum level

2.7 功能豐度熱圖采用 R 語言的gplots package軟件，同時利用PICRUSt 算法，基于KEGG 代謝通路數據庫對每組樣品中的信息繪制功能預測，豐度Heatmap 組間重復性良好，主要富集功能在細菌三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結合盒B 亞家族、多糖運輸系統滲透酶蛋白和能量耦合因子（energy coupling factor，ECF）亞家族RNA聚合酶sigma-70 因子、ABC 結合盒（ATP-binding cassette，ABC）-2 型轉運系統ATP 結合蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶（EC：5.4.2.1）、抗生素運輸系統ATP 結合蛋白、磷酸甘油酸變位酶、多糖運輸系統滲透酶蛋白、乳糖操縱子調節蛋白、乳糖阻遏蛋白基因調節家族轉錄調控因子和多糖運輸系統底物結合蛋白等，見圖7。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬水平Welch’st-test 上差異分析結果Fig.6 Difference analysis results of Welch’st-test of intestinal microflora of mice in various groups at genus level

圖7 各組功能預測熱圖(以KEGG 功能注釋為例)Fig.7 Heat map of function prediction in various groups(KEGG function annotation as an example)

3 討 論

胃腸道菌群與其自身宿主相互作用，對健康和疾病發展產生深遠影響。放線菌是公認的生物合成工廠［15］，其可產生廣泛的次級代謝產物，能產生約 70% 的自然抗生素，放線菌有益于宿主的健康［16］。現代高通量測序技術的發展和生物信息學的進步，為研究胃腸道微生物組的多樣性和復雜性開辟了一個獨立于培養方法的領域，使人類能夠深入了解胃腸道微生物［17］。Hp 定植明顯影響胃部微環境，進而影響胃部微生物群，并可能與腸道微生物群變化相關，Hp 和腸道菌群之間的相互作用可能在Hp 相關的致癌性和胃外表現中起作用。

本研究對健康和Hp 感染性慢性胃炎C57BL/6小鼠的十二指腸、空腸和結腸中內容物樣本進行16SrRNAV3-V4 區信息采集，樣本的序列數平均為34 294 條。從物種注釋分析和物種熱圖分布的結果顯示：除了未經分類的細菌，與對照組比較，感染組小鼠樣本中腸道菌群豐度為空腸>十二指腸>結腸。該變化趨勢與美國學者MARTINEZGURYN 等［18］報道的正常腸道菌群豐度為十二指腸>空腸>結腸的結論不一致，可能是Hp 感染導致了上述變化。

為了明確組間菌群種類和豐度差異，本研究在對照組和感染組小鼠腸道各區域菌群中進行OTU PCA 分析、Alpha 多樣性參數比較和Welch’st-test分析，與對照組比較，感染組小鼠十二指腸、空腸和結腸放線菌門豐度明顯降低，提示Hp 感染后能產生自然抗生素，還能產生各種酶制劑（蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等）、維生素和有機酸，放線菌門生長可能因此受到抑制。與對照組比較，感染組小鼠十二指腸和結腸菌群的乳桿菌屬及雙歧桿菌含量明顯降低，空腸的乳桿菌屬含量明顯降低，說明感染Hp 后小鼠腸道菌群的乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度減少。本研究結果與YIN 等［19］報道的長期感染Hp 蒙古沙鼠十二指腸微環境可能不適合乳酸桿菌繁殖的結論一致。一些研究者認為Hp 感染后乳酸桿菌和雙歧桿菌在動物體內豐度減少，是由于慢性Hp 感染小鼠后會誘發胃炎，壁細胞完全萎縮，導致胃內pH 值明顯升高（胃酸過少），是胃泌素血癥、低氯酸鹽血癥和“酸性屏障”破壞共同影響所致［20］；也有研究者［21］推測可能是神經內分泌途徑的影響，如在Hp 感染和誘導免疫病理過程中，在胃中釋放的介質（胃泌素、生長抑素、細胞因子和低質子濃度等因素）到腸道中發揮作用，影響了腸道菌群的多樣性和豐度。Hp 感染和胃酸過少的患者偶爾會出現非特異性的腸道癥狀，如不規則的排便、脹氣或其他不明原因的腹痛［22-23］，可能是由于菌群失調而出現的癥狀。

通過PICRUSt 功能預測，KEGG 二級代謝通路分析表明：初級和次級代謝物質的運輸、轉錄、壞死性凋亡、免疫應答、炎癥反應、氧化還原反應、脂質的相關代謝和糖代謝等的基因通路豐度比較高。本課題組下一步需要對上述主要功能進行相關研究驗證。

綜上所述，對照組和Hp 感染性慢性胃炎小鼠十二指腸、空腸和結腸的腸道菌群優勢菌均存在差異，其中放線菌門、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度明顯降低，支原體豐度明顯升高，本研究結果為今后基于微生物組干預Hp 感染治療和根除Hp 提供了新的方向。