膜穿孔蛋白E 在上皮性卵巢癌組織中的表達水平及其臨床意義

陳猛猛, 陳俊宇, 高 燕, 房正軒, 趙淑華, 鄭晶瑩, 劉淑香

（1.吉林大學護理學院康復治療學教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學第二醫院婦產科，吉林 長春 130021；3.延邊大學藥學院藥劑學教研室，吉林 延吉 133002）

卵巢癌是致死率最高的婦科腫瘤之一，其中上 皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）占所有卵巢癌的80%～90%［1-2］。目前，EOC 的標準治療是腫瘤細胞減滅術聯合以鉑類為基礎的化療，但患者的5 年生存期僅為46%［3］。腫瘤的耐藥及復發是 EOC 病死率高的主要原因，此過程涉及多基因的變化［4］。研究［5-10］顯示：消皮素家族基因表達與泛癌的腫瘤免疫及癌癥藥物敏感性有關，特別是膜穿孔蛋白E（gasdermin E，GSDME）的活化能夠抑制多種腫瘤細胞集落形成和增殖。作為細胞焦亡的最終執行蛋白，GSDME 的表達可能與EOC的發生發展有關，但其表達水平對 EOC 臨床進展影響的研究尚未見相關報道。本研究利用生物信息學數據分析、免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色和Western blotting 法等方法，探討GSDME 在EOC 組織中的表達，分析GSDME 在EOC 發生發展過程中的作用，以期對EOC 臨床治療提供潛在的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 生物信息學數據庫EOC 中GSDME 的差異表 達 數 據 是 來 自 UCSC Xena （https：//xenabrowser.net/datapages/）經Toil 流程統一處理的腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和 基 因 型- 組 織 表（Genotype-Tissue Expression，GTEx）的TPM 格 式RNAseq 數 據。共對515 例非配對樣本進行了差異表達分析，其中包含88 例來自GTEx 數據庫的正常卵巢樣本，427 例 來 自TCGA （https：//portal.gdc.cancer.gov/）的腫瘤樣本。所有的統計分析與可視化均使用R（3.6.3 版本）完成。

1.2 EOC 組織中GSDME 基因表達譜差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗（Wilcoxon rank sum test）對EOC 組織中GSDME 基因的表達譜進行差異分析。采用Shapiro-Wilk normality test 對非配對樣本中GSDME 的表達數據進行正態性檢驗，并使用兩獨立樣本t檢驗對非配對樣本中的數據進行差異分析。分析結果采用ggplot2 ［3.3.3 版本］進行可視化，且認為當P<0.05 時差異有統計學意義。

1.3 EOC 組織中GSDME 單基因差異分析及相關性分析使用Stat 包（3.6.3 版本）對TPM 格式的表達譜數據進行單基因相關性分析，目標分子為GSDME。將閾值設置為Log2差異倍數（fold change，FC）的絕對值|log2（FC）|>1 且滿足P<0.05，篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），利用ggplot2 包（3.3.3 版本）繪制火山圖。將DEGs 輸入STRING 數據庫，利用Cytoscape 軟件進行DEGs 的蛋白- 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡分析，并使用MCODE 插件確定HUB 基因。

1.4 EOC 組織中GSDME 基因富集分析利用單基因差異分析結果，使用ClusterProfiler 包（3.14.3 版本）進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）。使 用 org.Hs.eg.db 包（3.10.0 版本）進行基因ID 轉換；使用GOplot 包（1.0.2 版本）計算Zscore 并對EOC 與富集通路的相關性進行評分，如果結果滿足錯誤發現率（false discovery rate，FDR）<0.25 且P<0.05 條件就為顯著富集。以上結果的可視化使用ggplot2（3.3.3版本）完成。

1.5 EOC 組織中GSDME 免疫浸潤分析使用GSVA 包（1.34.0 版本）對免疫細胞的相對浸潤水平進行分析，免疫浸潤的算法使用ssGSEA，采用Spearman 相關性分析。根據GSDME 的表達水平，將樣本分為低表達組和高表達組，計算在不同的分組中各種免疫細胞浸潤的富集得分。最后利用相對浸潤水平具有顯著統計學意義的免疫細胞（P<0.001）繪制棒棒糖圖，統計分析與可視化通過circlize 包（0.4.12 版本）完成。

1.6 臨床資料本研究經吉林大學第二醫院病案室和吉林大學第二醫院倫理委員會批準（倫理批號：2018106），查 閱 并 收 集2015 年1 月1 日—2019 年8 月31 日于吉林大學第二醫院婦科住院接受手術治療的所有卵巢癌患者資料，記錄EOC 患者的發病年齡、組織學分型、病理分級、腫瘤大小和腫瘤分期等臨床特征。納入標準：①病理學診斷為EOC；②初次診斷且首次治療方式為早期全面分期手術或腫瘤細胞減滅術；③術后接受以鉑類為基礎的規范化療；④有完整的隨訪資料。排除標準：①既往有其他惡性腫瘤病史；②卵巢轉移癌。選取符合納入標準的 EOC 患者共40 例，收集相對應的病理切片標本。患者年齡為34～77 歲，中位發病年齡53 歲，其中<53 歲者 17 例，≥53 歲者23 例。EOC 組織學分類參照WHO 卵巢癌分類標準，包括漿液性癌25 例、黏液性癌5 例、子宮內膜樣癌6 例、透明細胞癌2 例和漿黏液性癌2 例；其中高級別（低分化）組16 例，低級別（中分化及高分化）組24 例。根據FIGO 分期標準進行腫瘤臨床分期，其中Ⅰ-Ⅱ期19 例，Ⅲ-Ⅳ期21 例。納入的患者中對順鉑耐藥者（含鉑化療后6 個月內出現疾病復發或進展）有18 例，占總樣本量45%。另收集正常卵巢、良性卵巢瘤和交界性卵巢癌病理切片各5 例作為對照。收集EOC 患者新鮮冰凍癌組織和癌旁組織10 對。所有患者均同意參與本研究，并簽訂知情同意書。

1.7 細胞、主要試劑和儀器卵巢癌Skov3 細胞親本株及順鉑（cisplatin，DDP）耐藥株Skov3/DDP獲贈于中國科學院長春應用化學研究所。免疫組織化學染色試劑盒（貨號：G1215-200T，武漢塞維爾生物科技有限公司），兔抗人-DFNA5（GSDME）多克隆抗體（貨號：bs-14286R，北京博奧森生物技術有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（貨號：P0010S，上海碧云天生物技術公司），GAPDH （貨號：AF7021）和山羊抗兔二抗（貨號：S0001）（江蘇親科生物研究中心有限公司）。5300 一體式化學發光成像系統（型號：610T002-7Q，上海勤翔科學儀器有限公司），微量高速冷凍離心機（型號：HR/T16MM，湖南赫西儀器裝備有限公司），酶標分析儀（型號：HBS-1096A，南京德鐵生物科技有限公司）。

1.8 細胞培養及樣本收集37 ℃、5% CO2孵箱內體外培養Skov3 和Skov3/DDP 細胞，培養基為90% 高 糖DMEM + 10% 胎 牛 血 清 + 1% 雙 抗（青霉素+鏈霉素），當細胞貼壁生長達到 90%時，進行細胞傳代培養。細胞傳至第3 代時，棄去皿中培養基并用PBS 緩沖液洗滌，然后用胰酶消化使細胞脫離貼壁狀態，收集細胞用于后續檢測。

1.9 IHC 法檢測EOC 組織中GSDME 表達強度

按照IHC 染色試劑盒使用說明，將GSDME 抗體（1∶200）與收集到組織病理切片進行共孵育并染色。在顯微鏡下觀察組織切片的染色情況。每張切片隨機挑選5 個視野（×100），根據陽性細胞染色的強度及隨機視野中陽性細胞數所占總細胞數的百分比2 項指標進行綜合評分，代表GSDME 表達強度。IHC 陽性細胞染色程度：無色記為0 分，淡黃色記為1 分，棕黃色記為2 分，棕褐色記為3 分；陽性細胞數百分比：<5%記為0 分，5%～24%記為1 分，25%～49%記為2 分，50%～74% 記 為3 分，75%～100%記為4 分。最終2 項評分乘積≤4 分為陰性表達，>4 分為陽性表達。以上所有結果由2 位病理科醫師計算所得。

1.10 Western blotting 法檢測EOC 組織和癌旁組織及細胞中GSDME蛋白表達水平采用含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解緩沖液裂解收集的組織和細胞樣本，充分裂解并離心后收集蛋白上清液，通過BCA 蛋白試劑盒定量。將與Loading 混合后的蛋白質懸液（約含蛋白質20 μg）加載到SDS-PAGE凝膠上進行電泳，然后轉移至PVDF 膜上。室溫下，PVDF 膜在5%非脂肪牛乳中封閉2 h，加入GSDME（1∶1 000）和GAPDH （1∶10 000）一抗，在4℃環境下過夜。第2 天用TBST 洗滌，將膜與二抗（1∶20 000）在室溫避光環境下孵育2h，然后加底物發光并使用上海勤翔凝膠成像及分析系統進行成像及定量分析。

1.11 統計學分析采用 R 3.6.3 統計軟件進行統計學分析，繪圖使用 Graphpad prism 5 軟件。IHC和Western blotting 的量化結果符合正態分布且方差齊性，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。臨床病例信息分類以百分比（%）表示，采用χ2檢驗分析GSDME 表達強度與EOC 患者臨床參數的關系。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EOC 組織中GSDME 差異表達在EOC 中，GSDME 的差異表達分析結果見圖1A。與正常卵巢組織比較，EOC 組織中GSDME mRNA 表達水平明顯降低（P<0.05）。臨床相關性分析顯示：與Ⅰ-Ⅱ期比較，Ⅲ-Ⅳ期EOC 組織中GSDME mRNA 表達水平差異無統計學意義（P>0.05，見圖1B）；與G1-G2 期比較，G3-G4 期EOC 組織中GSDME mRNA 表達水平明顯降低（P<0.05，見圖1C）。

圖1 GSDME 相關差異基因表達圖Fig.1 Diagrams of GSDME-related differential genes expression

2.2 EOC 組織中GSDME 單基因差異及相關基因對EOC 組織中GSDME 進行單基因差異分析，結果見圖2，滿足|log2FC）>1 且滿足P<0.05 閾值的基因789 個。在該閾值下，高表達（log2FC 為正值）基因460 個，低表達（log2FC 為負值）基因329 個。利用789 個DEGs 構建PPI 網絡圖（圖3），互作頻率最高的基因有纖連蛋白1（fibronectin 1，FN1）、催乳素誘導蛋白（prolactin induced protein，PIP）、分泌珠蛋白家族2A 成員1 （secretoglobin family 2A member 1，SCGB2A1）、成纖維細胞生長因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）和神經生長因子受體（nerve growth factor receptor，NGFR）等。基 于PPI 網 絡 分 析 結 果，使 用MCODE 插件確定了8 個HUB 基因，分別是鉀電壓門控通道亞家族A 成員1 （potassium voltagegated channel subfamily a member 1，KCNA1）、鈣電壓門控通道亞單位α1c （calcium voltage-gated channel subunit alpha1 C，CACNA1C）、鈣電壓門控通道輔助亞單位γ2 （calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 2，CACNG2）、陽離子通道精子相關輔助亞單位δ （cation channel sperm associated auxiliary subunit delta，CATSPERD）、鈣 電 壓 門 控 通 道 亞 單 位α1g（calcium voltage-gated channel subunit alpha1 G，CACNA1G）、鈉電壓門控通道α 亞單位1（sodium voltage-gated channel alpha subunit 1，SCN1A）、鈉通 道 上 皮1 亞 單 位β （sodium channel epithelial 1 subunit beta，SCNN1B）和鈣電壓門控通道亞單位α1I （calcium voltage-gated channel subunit alpha1 I，CACNA1I）（圖2）。

圖2 GSDME 單差異基因分析所得火山圖(A)和HUB 基因互作網絡圖(B)Fig.2 Volcano plot diagram(A) and HUB gene interaction network diagram(B) obtained by GSDME single differential gene analysis

圖3 GSDME 相關差異基因構成的PPI 網絡圖Fig.3 PPI interaction network diagram of GSDME-related differential genes

2.3 EOC 組織中GSDME 功能富集和免疫浸潤情況對GSDME 進行功能富集分析，結果見圖4。圖4 為GSEA 可視化結果，統計分析結果表明：GSDME 與細胞因子及其受體互作、免疫調節及反應和G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR）細胞質核糖體蛋白合成等通路及功能呈正相關關系，而與線粒體中電子傳遞系統、反應體mRNA 合成和robo 受體反應組信號傳導相關通路呈負相關關系（表1 和2）。GO 和KEGG 富集分析結果顯示：GSDME 與免疫相關通路的活化（循環免疫球蛋白介導的體液免疫反應通路、補體激活通路和白細胞遷移通路）及mRNA 剪接位點的選擇和識別等有關（表3 和圖5A）。

圖4 EOC 組織中GSDME 的GSEA 通路富集圖Fig.4 GSEA pathway enrichment diagram of GSDME in EOC tissue

表1 與GSDME 表達呈正相關關系的GSEA 基因集Tab.1 GSEA gene sets positively correlated with GSDME expression

表2 與GSDME 表達呈負相關關系的GSEA 基因集Tab.2 GSEA gene sets negatively correlated with GSDME expression

表3 GO/KEGG 富集分析結果Tab.3 Results of GO/KEGG enrichment analysis

免疫浸潤分析顯示：EOC 組織中GSDME 的表達與18 種免疫細胞的腫瘤浸潤呈正相關關系，包括巨噬細胞、效應記憶型T 細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞、中性粒細胞和記憶型T 細胞等；與4 種免疫細胞浸潤呈負相關關系（圖5B）。

圖5 EOC 組織中GSDME 的GO/KEGG 富集分析圖（A）和免疫浸潤分析圖（B）Fig.5 GO/KEGG enrichment analysis diagram(A) and immune infiltration analysis diagram(B) of GSDME in EOC tissue

2.4 GSDME 與相關通路標志物的關系GSDME的表達水平與淋巴細胞活化相關蛋白5（kelch like family member 5，KLHL5）、CD4、CD80 和CD86等免疫標志物分子的表達水平呈明顯正相關關系（圖6A～6E；r≥0.3，P<0.01）；與細胞色素C 氧化酶亞單位5B（cytochrome C oxidase subunit 5B，COX5B）、ATP 合酶膜亞基F（ATP synthase membrane subunit F，ATP5MF）、泛素-細胞色素C 還原酶復合體裝配因子3（ubiquinol-cytochrome C reductase complex assembly factor 3，UQCC3）和線粒體編碼NADH-泛醌氧化還原酶核心亞單位3（mitochondrially encoded NADH-ubiquinone oxidoreductase core subunit 3，MT-ND3）等線粒體呼吸鏈輔酶標志物分子的表達水平呈明顯負相關關系（圖6F～6J；r≤－0.3，P<0.01）。

圖6 GSDME 的分子間相關性分析Fig.6 Analysis on intermolecular correlations of GSDME

2.5 GSDME 蛋白在不同類型EOC 組織中的表達水平利用IHC 染色法檢測正常卵巢、良性卵巢瘤、交界性卵巢瘤、低級別和高級別卵巢漿液性癌組織中GSDME 蛋白的表達。結果顯示：與正常卵巢比較，EOC 組織中GSDME 蛋白表達水平明顯下調，且腫瘤惡性程度越高GSDME 蛋白表達水平越低。見圖7 和8。

圖7 IHC 染色檢測不同級別和類型EOC 組織中GSDME 的表達情況（Bar=50 μm）Fig.7 Expressions of GSDME in different grades and types of EOC tissues detected by IHC staining（Bar=50 μm）

圖8 各種組織中GSDME 蛋白表達水平Fig.8 Expression levels of GSDME proteins in various kinds of tissues

2.6 GSDME 蛋白在DDP 耐藥組和DDP 敏感組EOC 組織中的表達水平DDP 敏感組中GSDME蛋白呈高水平表達，且明顯高于DDP 耐藥組（P<0.05）。見圖9 和10。

圖9 IHC 法檢測DDP 敏感及耐藥EOC 組織中GSDME 的表達（×200）Fig.9 Expressions of GSDME in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant EOC tissues detected by IHC method（×200）

圖10 DDP 敏感組和DDP 耐藥組EOC 組織中GSDME 表達水平Fig.10 Expression levels of GSDME in EOC tissue in DDP sensitive group and DDP resistant group

2.7 癌旁組織、EOC 組織和Skov3 細胞中GSDME蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與癌旁組織比較，EOC 組織中GSDME 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。與親本株Skov3 細胞比較，耐藥株Skov3/DDP 細胞中GSDME 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖11 和12。

圖11 Western blotting 法檢測不同組織中GSDME 蛋白表達電泳圖（A)和直條圖(B)Fig.11 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of GSDME proteins in different kinds of tissues detected by Western blotting method

圖12 Western blotting 法檢測不同細胞中GSDME 蛋白表達電泳圖（A)和直條圖(B)Fig.12 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of GSDME proteins in different cells detected by Western blotting method

2.8 不同臨床病理特征EOC 患者癌組織中GSDME 表達水平本研究納入的40 例行盆腔淋巴結清掃術和（或）腹主動脈旁淋巴結清掃術的EOC 患者，其臨床特征與GSDME 的關系見表4。病理分級高級別者占比60% （24/40），低級別者占 比40% （16/40），在 病 理 分 級 高 級 別 者 中GSDME 低表達者占比明顯高于病理分級低級別者中的GSDME 低表達者（χ2＝6.077，P<0.05）。

表4 GSDME 蛋白表達與EOC 患者臨床特征的關系Tab.4 Relationship between GSDME protein expression and clinical characteristics of EOC

3 討 論

作為卵巢惡性腫瘤的主要病理類型，EOC 具有易復發和易耐藥的特性，也是患者死亡的重要原因。研究［11-13］顯示：GSDME 在腫瘤患者化療過程中介導了細胞焦亡，并能通過調控Caspase3 及抑癌基因p53 的表達來增強腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性。

為了探討GSDME 對EOC 發生發展的影響，本研究首先檢索TCGA 和GTEx 數據庫中EOC 的表達譜數據，結果顯示：在EOC 組織中GSDME mRNA 表達水平低于正常卵巢組織，且病理組織分級越高表達越低，提示GSDME 可能參與了EOC 的發生發展。應用單基因差異分析和PPI 分析，檢索到8個與腫瘤發生發展有密切關系的HUB基因。研 究［14-17］顯 示：CACNA1C、CATSPERD、CACNA1G 和SCN1A 等基因是泛癌發生發展的相關基因。在卵巢癌的發展與轉移中會出現KCNA1基因的過表達［18-19］。GSDME 的低表達可能與EOC患者的基因突變、腫瘤的增殖和轉移等有關。本研究中功能富集分析結果顯示：GSDME 的表達和免疫相關通路呈正相關關系，與調控線粒體呼吸鏈功能的通路呈負相關關系。因線粒體呼吸鏈的正常運轉是維持線粒體功能的基礎［20-22］，故研究者猜測當GSDME 處于高水平表達時，可能會增強腫瘤的免疫殺傷作用，控制腫瘤的增長，使能量需求降低。為了驗證上述猜測，本研究進行了免疫浸潤及分子相關性分析，結果顯示：GSDME 高表達會促使免疫功能的增強，增加腫瘤微環境中免疫細胞的浸潤。腫瘤細胞本身可以通過某些基因或者通路的表達異常，從而抑制免疫細胞浸潤到腫瘤微環境，促使免疫治療原發性和適應性耐藥［23-25］，因此本文作者推測GSDME 的表達可能與EOC 耐藥存在關聯。

本研究中IHC 法檢測結果顯示：GSDME 表達強度會隨著EOC 惡化程度的增高而降低，且GSDME 表達強度在順鉑敏感組和耐藥組中有顯著差異。本研究應用Western blotting 法檢測EOC 組織及細胞中GSDME 蛋白的表達水平，結果顯示：GSDME 蛋白在EOC 組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，在耐藥株Skov3/DDP 細胞中表達水平明顯低于親本株。以上結果表明：GSDME 參與了EOC 的發生發展，且其低水平表達與EOC 的耐藥有關。本研究對GSDME 在40 例EOC 樣本中的表達情況與患者各項臨床病理特征的關系進行分析，結果顯示：GSDME 的表達與EOC 患者的發病年齡、分期、病灶大小、病理類型和腹水量無關，與病理分級有關。

綜上所述，GSDME 與EOC 的發生發展有密切關聯。GSDME 的低表達可能是EOC 進展及產生耐藥的重要原因之一。GSDME 可以作為EOC的分子標志物及新的治療靶點。