細胞凋亡相關(guān)基因CD44 在甲狀腺癌組織中的表達及其與腫瘤侵襲和免疫細胞浸潤關(guān)系的生物信息學分析

肖志遠, 宋 冰, 馬鑫雨, 金連輝, 鄭 通, 柴 芳

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，遼寧 錦州 121001）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）是最常見的內(nèi)分泌腫瘤之一，其發(fā)病率位于所有癌癥中的第9 位，但其具體發(fā)病機制目前仍不清楚［1］。凋亡相關(guān)基因CD44 是一種細胞表面蛋白，其表達上調(diào)與腫瘤的細胞增殖、浸潤、血管生成、轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)［2-3］。HU 等［4］研究顯示：CD44 蛋白的表達可能與膀胱癌的進展、轉(zhuǎn)移和預后有關(guān)。既往研究［5-6］表明：生物信息學分析對于闡明眾多差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的功能及評估THCA 發(fā)生發(fā)展的復雜性具有重要意義。本研究旨在應用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和TIMER 數(shù)據(jù)庫分析CD44 mRNA 在THCA 組織及癌旁組織中表達水平的差異，并通過臨床標本驗證（免疫組織化學SABC 法），探討CD44 蛋白與THCA 患者臨床病理特征和腫瘤免疫細胞浸潤的關(guān)系，為THCA的診斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載從 TCGA 數(shù) 據(jù) 庫 （https：//portal.gdc.cancer.gov/）中篩選THCA 相關(guān)的RNA 序列表達譜，得到58 種正常組織和510 種腫瘤組織。從基因集 富 集 分 析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）分 子 特 征 數(shù) 據(jù) 庫 v7.1 的 基 因 集“HALLMARK_ APOPTOSIS”中獲得161 個凋亡相關(guān)基因（apoptosis-related genes，ARGs）［7］。

1.2 ARGs 的選擇采用mRNA 表達譜、limma 軟件包和R 軟件（V3.6.3 版 本）中 的 Wilcoxon 秩 和t檢 驗［|log2FC|>1，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05）］來分析THCA 隊列中表達顯著不同的ARGs。

1.3 THCA 中CD44 mRNA 的差異 表達通過分析TCGA 中CD44 mRNA 的表達數(shù)據(jù)檢測CD44 mRNA 在THCA 中表達。使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析CD44 在THCA 樣本和正常樣本間的鑒別價值。

1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）生物功能富集、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和GSEA 分析及蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析通過GO 富集、KEGG 通路分析和GSEA 分析評估DEGs 的潛在生物學功能，通過R 軟件包（V3.6.3 版本）進行可視化［8-9］。使用STRING 數(shù)據(jù) 庫 （http：//www.string-db.org/）中 的PPI 網(wǎng)絡確定CD44 與所選DEGs 之間的相互作用，并使用 Cytoscape 軟件（www.cytoscape.org/）進行可視化［10-11］。

1.5 CD44 mRNA 表達水平與腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating leukocytes，TILs）的關(guān)系

采用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫Immune Association 模塊中的Gene 分析CD44 mRNA 表達水平與免疫細胞（CD4+T 淋巴細胞、T 淋巴細胞、CD56 細胞、CD8+T 淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞）浸潤豐度的相關(guān)性。基于基因表達譜，通過基因組變異分析推斷出TILs 的相對浸潤豐度。

1.6 CD44 蛋白表達與免疫檢查點基因之間的相關(guān)性采用R 軟件（V3.6.3 版 本）分析THCA 中CD44 蛋白表達與47 個免疫檢查點基因之間的相關(guān)性，結(jié)果使用熱圖可視化。

1.7 臨床資料收集錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2021 年4—9 月行手術(shù)切除的THCA 患者標本，包括腫瘤組織和癌旁配對正常甲狀腺組織（距癌灶2 cm 內(nèi)）110 例，其中男性25 例，女性85 例，年齡（48±12）歲。納入標準：①全部患者未行放療、化療和內(nèi)分泌等針對腫瘤的任何治療；②經(jīng)手術(shù)后病理證實為THCA。排除標準：①并發(fā)橋本甲狀腺炎等甲狀腺相關(guān)疾病；②THCA 家族史。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（批準文號：202233），所有患者均簽署知情同意書。

1.8 主要試劑和儀器兔 抗 人CD44 （貨 號：WL03521，中 國Wanleibio 公司），HRP-標記山羊抗兔IgG（貨號：111-035-003，美 國Jackson Immuno Research 公司），DAB 顯色液（貨號：DAB-1031，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），顯微鏡（型號：Eclipse Ci-L，日本尼康儀器有限公司），顯微鏡拍照系統(tǒng)（型號：Nikon DS-F12，日本尼康儀器有限公司），微波爐（型號：P70D20N1P-G5，中國格蘭仕集團有限公司）。

1.9 免疫組織化學SABC 法檢測CD44 蛋白表達情況

將所收集的110 例THCA 組織及癌旁組織進行免疫組織化學檢測，采用10%甲醛溶液固定組織，常規(guī)脫水、透明和蠟塊包埋，以厚度為4 μm 連續(xù)切片，微波修復，3%過氧化氫孵育，血清封閉。依次添加一抗（4 °C 過夜）和二抗，DAB 顯色后，蘇木精復染后常規(guī)脫水透明中性膠封口。PBS 緩沖液取代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：免疫組織化學檢測結(jié)果由2 位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法獨立閱片。判定為陽性的結(jié)果是胞漿中具有棕黃色的顆粒沉淀。按照著色強度確定分級：無著色為0 級，淺黃色為1 級，黃色為2 級，棕黃色為3 級。根據(jù)細胞染色比例計分：陽性細胞的數(shù)目占全部細胞的數(shù)目百分率≤9%計為0 分，10%～25% 計為1 分，26%～50%計為2 分，51%～74%計為3 分，≥75%計為4 分。著色強度乘以陽性細胞百分率大于3 為陽性，其結(jié)果分為4 級：0～2 分（－），3～4 分（+），6～8 分（?），9～12 分（?）。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用R 軟件（V3.6.3 版本）進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析和繪圖，采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。TCGA-THCA 中CD44 mRNA表達水平和免疫細胞浸潤的關(guān)聯(lián)性指標不符合正態(tài)分布，組間比較采用Wilcoxon 檢驗。利用pROC包（1.17.0.1 版本）對ROC 曲線進行CD44 臨界值檢測，用ggplot2 包（3.3.0 版本）進行可視化。采用 Pearson 相關(guān)分析法分析CD44 mRNA 與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中THCA 與CD44 的相關(guān)性

2.1.1 THCA 組織中DEGs 的表達水平 按照篩選條件，共獲得32 個差異表達的DEGs，其中基因表 達 上 調(diào)（GPX1、CDKN1A、TGFB2、BAX、BCL2L1、CD44、ANXA1、PMAIP1、CCND2、F2R、CLU、TNFRSF12A、CCND1、ERBB3、BID、LGALS3、IGFBP6、CCNA1、TIMP1 和EREG）20 個，表 達 下 調(diào)（BMP2、AVPR1A、DCN、JUN、CTH、EGR3、IL6、CD69、ATF3、CD38、TGFBR3 和HGF）12 個，橙色代表表達上調(diào)基因，藍色代表表達下調(diào)基因，黑色代表無差異基因，568 個樣本中32 個差異表達基因熱圖見圖1。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中THCA 組織中DEGs 的表達Fig.1 Expression of DEGs in THCA tissue in TCGA Database

2.1.2 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 mRNA 表達水平 THCA 患者癌組織（n=58）中CD44 mRNA 表達水平明顯高于癌旁組織（n=58）（P<0.001）。非配對數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：THCA 患者癌組織（n=510）中CD44 mRNA 的表達水平明顯高于癌旁組織（n=58）（P<0.001）。見圖2。

圖2 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 mRNA 表達水平Fig.2 Expression levels of CD44 mRNA in cancer and paracancerous tissues of THCA patients

2.1.3 ROC 曲 線 確 定CD44 mRNA 對THCA 組織及癌旁組織的鑒別效能 ROC 曲線分析結(jié)果顯示：ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）最大為0.865（95% CI：0.833～0.897）。在臨界值為6.855 時，其靈敏度、特異度和準確性分別為89.71%、75.13% 和72.91%，陽 性 預 測 值 為98.52%，陰性預測值為29.13%。見圖3。

圖3 CD44 mRNA 表達鑒別THCA 組織和癌旁組織的ROC 曲線Fig.3 ROC curves of expression of CD44 mRNA in THCA tissue and paracancerous tissue

2.1.4 DEGs 功能富集分析和PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建 GO分析主要包括細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）3 個部分，分析結(jié)果顯示：BP 主要與外源性凋亡信號通路、線粒體釋放細胞色素C 和凋亡信號通路的調(diào)控有關(guān)，MF主要與生長因子活性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性和細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)活性有關(guān)。GSEA 分析結(jié)果顯示：DEGs 表達與中性粒細胞脫顆粒反應有關(guān)。KEGG 分析結(jié)果顯示：DEGs主要富集在 p53 和磷脂酰肌醇 3-激酶（phospatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號通路。PPI 分析結(jié)果顯示：CD44 與DEGs 相互作用。見圖4。

2.2 THCA 患者CD44 mRNA 表達水平與TILs 浸潤豐度的相關(guān)性

應用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析CD44 mRNA 表達水平與7 種TILs 浸潤豐度的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CD44 mRNA 表達水平與B 細胞、巨噬細胞、CD4+T 淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞浸潤豐度呈正相關(guān)關(guān)系（partial.cor>0，P<0.01），與腫瘤純度和CD8+T 淋巴細胞浸潤豐度無相關(guān)性（partial.cor≤0，P<0.01）。見圖5。

圖5 THCA 患者癌組織中CD44 mRNA 表達水平與TILs 浸潤豐度的相關(guān)性Fig.5 Correlations between expression level of CD44 mRNA in cancer tissue of THCA patients and infiltration abundance of TILs

2.3 THCA 組織中CD44 蛋白表達水平與免疫檢查點基因的關(guān)系

R 軟件分析結(jié)果顯示：在THCA 組織中CD44蛋 白 表 達 水 平 與NRP1、CD27、TNFSF15、TNFRSF25、CD276、CD200、HHLA2、TNFRSF8 和CD40 基因表達水平呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與CD274 基因表達水平呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。見圖6。

圖6 THCA 患者癌組織中CD44 蛋白表達水平與免疫檢查點基因表達水平的關(guān)系Fig.6 Relationships between expression of CD44 protein and expression levels of immune checkpoint gene in cancer tissue of THCA patients

2.4 THCA 患者癌組織及其癌旁組織中CD44 蛋白陽性表達率

免疫組織化學SABC 法檢測結(jié)果顯示：CD44蛋白主要定位于細胞膜或細胞質(zhì)，顯微鏡下可見黃色或棕黃色顆粒，癌旁組織局灶呈弱表達或不表達。見圖7。在癌組織中CD44 蛋白陽性表達率高于 癌 旁 組 織 ［69.09% （76/110）vs20.91%（23/110）］，差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（χ2=51.589，P<0.001）。

圖7 THCA 患者癌組織和癌旁組織中CD44 蛋白的表達情況(免疫組織化學，×200）Fig.7 Expressions of CD44 protein in cancer tissue and paracancerous tissue of THCA patients（Immunohistochemistry,×200）

2.5 CD44 蛋白陽性表達率與THCA 患者臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學SABC 法檢測結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，THCA 患者癌組織中CD44 蛋白陽性表達率與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與患者性別、年齡和腺外侵犯無關(guān)（P>0.05）。見表1。

表1 THCA 患者癌組織中CD44 蛋白陽性表達率與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between expression of CD44 protein in cancer tissue and clinicopathological characteristics of THCA patients [n(η/%)]

3 討 論

近年來THCA 的發(fā)病率迅速上升［12］，通過手術(shù)治療THCA 雖然可以取得滿意的效果，但甲狀腺活檢呈特殊病例亞型及并發(fā)甲狀腺局部晚期癌的患者預后仍然較差。本研究采用生物信息學方法篩選出32 個與THCA 相關(guān)的ARGs，GO 分析結(jié)果顯示：上述32 個基因主要參與細胞凋亡相關(guān)的信號通路；KEGG 分析結(jié)果顯示：32 個基因主要與p53、PI3K-Akt 和凋亡途徑信號通路有關(guān)。而PI3K-Akt 信號傳導通路的過度激活在THCA 的發(fā)生 發(fā) 展 過 程 中 起 重 要 作 用［13］。RYU 等［14］研 究 顯示：CD44 mRNA 表達水平與THCA 患者的生存率有明顯相關(guān)性。CD44 是編碼人類11 號染色體上高度保守的基因，由20 個外顯子和19 個內(nèi)含子組成，是一種非激酶細胞表面跨膜糖蛋白，通過在腫瘤細胞中過表達促進癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和遷移等［15-16］。NAM 等［17］認為：沉默CD44 mRNA 表達可以抑制三陰性乳腺癌細胞的生長和遷移。CD44蛋白在膀胱癌、膽囊癌、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌、頭頸部鱗癌和胃癌組織中廣泛高表達，并且與腫瘤的侵襲性和不良預后有關(guān)［18-23］。本研究結(jié)果顯示：在THCA 患者癌組織中CD44 蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，并與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑有關(guān)，與FIGGE 等［24］研究結(jié)果一致，提示該基因在促進THCA 進展的過程中起到一定作用。本研究中ROC 曲線分析結(jié)果顯示：CD44 mRNA 表達水平在區(qū)分THCA 組織及癌旁組織中具有診斷意義，其靈敏度、特異度和準確性分別為89.71%、75.13%和72.91%。提示CD44 基因可作為一種診斷性腫瘤標志物，用于與正常組織相鑒別。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由細胞外基質(zhì)、癌相關(guān)成纖維細胞、血管上皮細胞和浸潤性免疫細胞組成［25-26］。實體腫瘤中的免疫細胞浸潤是TME 相關(guān)致癌機制中的關(guān)鍵因素［27］。腫瘤細胞中可通過調(diào)節(jié)TME 影響細胞凋亡，進而產(chǎn)生促癌作用，促進腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展［28］。本研究結(jié)果顯示：THCA 患者癌組織中CD44 mRNA 表達水平與TILs（B 細胞、巨噬細胞、CD4+T 淋巴細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞）浸潤豐度呈正相關(guān)關(guān)系，提示THCA 組織中CD44 mRNA 過表達可能促進TILs 的增殖，進而改變TME，促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示CD44 蛋白表達與9 個免疫檢查點基因呈正相關(guān)關(guān)系，與1 個免疫檢查點基因呈負相關(guān)關(guān)系，提示CD44 基因可能參與THCA 的免疫調(diào)節(jié)功能。上述結(jié)果顯示：CD44 蛋白可能是THCA 潛在的免疫調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，CD44 蛋白表達上調(diào)可能與THCA的發(fā)生和發(fā)展及免疫浸潤有關(guān)。本研究為THCA發(fā)病的分子機制研究提供了理論依據(jù)，CD44 蛋白有可能成為鑒別良、惡性甲狀腺腫瘤的分子標志物，同時CD44 蛋白也有望成為THCA 新的臨床治療靶點。本研究未能進一步闡述CD44 蛋白作用機制及相關(guān)的信號通路，其具體的作用機制仍有待深入研究。