中國南瓜MLO基因的鑒定與表達分析

李 可, 金 輝, 陳 卓, 趙明明, 胡新燕, 李衛華, 陳曉光

(1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所,廣東湛江 524091; 2.江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所,江蘇徐州221000)

白粉病是南瓜發生最普遍、最嚴重的一種病害。南瓜白粉病是由單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)引起的。截至目前,國內外大量研究已鑒定出多個與植物白粉病抗性相關基因,其中一些已成功運用到抗病育種中,獲得了一些抗病品種[1-4],這些基因為培育新的抗病品種提供了遺傳材料[5-6]。R基因是最常見的一類抗病基因,具有專一高效的特點,缺點是容易因病原菌突變導致抗性丟失。另一類是負調控植物抗病性,參與植物感病的S基因,其功能缺失而產生植物抗病性,且與R基因相比抗性更穩定[7]。

自1942年在大麥中發現了第1個MLO基因突變體,大量學者對多種作物中的MLO基因進行了深入研究。研究發現,MLO基因是植物特有的一類由單基因控制的隱性抗病基因,MLO基因突變可誘導植物對白粉菌產生廣譜、高效且持久的抗性。截至目前,已在多種植物中證實MLO基因是參與白粉病病菌侵染植物的感病因子。研究者利用生物技術手段沉默或突變大麥、擬南芥、煙草、小麥、番茄等植物中的相關MLO基因[8-12],可誘導它們產生廣譜抗性。

中國南瓜全基因組測序工作的完成為MLO基因家族的鑒定奠定了基礎,本研究利用生物信息學方法對中國南瓜MLO基因家族成員進行鑒定,分析其理化性質、結構特點、進化關系及白粉病的誘導表達模式,以期為中國南瓜MLO基因的功能驗證及抗白粉病材料創制和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 中國南瓜MLO基因的鑒定與分析

利用已報道的近緣種的MLO蛋白序列在中國南瓜基因組數據庫(http://cucurbitgenomics.org/organism/14)中進行相似性搜索(BLAST),其中包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、美洲南瓜(Cucurbitapepo)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)。相關的MLO蛋白序列從數據庫(http://cucurbitgenomics.org/organism/14;http://cucurbitgenomics.org/organism/8)中獲取的中國南瓜MLO基因的CDS序列,利用BioXM2.7翻譯成蛋白序列。獲得的中國南瓜MLO蛋白序列通過Pfam數據庫(https://pfam.xfam.org/)確認是否含有MLO基因的保守結構域[13-15]。相應的MLO基因序列也從中國南瓜基因組數據庫中獲取。

1.2 基因結構分析

利用在線軟件GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)對基因結構進行分析,分析其外顯子和內含子構成。ORF分析利用BioXM2.7軟件完成[16-17]。

1.3 蛋白質結構特點分析

采用在線軟件ExPASy(https://www.expasy.org/)對中國南瓜MLO蛋白序列進行理化性質分析,包括分子權重和等電點分析。利用在線軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)進行跨膜區螺旋預測。氨基酸序列保守基序預測采用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)完成[18]。

1.4 多序列比對及進化樹分析

對85個MLO氨基酸序列進行進化樹作圖,包括15個擬南芥、20個美洲南瓜、21個印度南瓜、20個中國南瓜以及已報道的4個單子葉植物的白粉病抗性相關MLO蛋白和5個雙子葉植物抗病基因氨基酸序列。利用MEGA6采用Align by ClustalW進行多序列比對,采用最大似然法構建系統發育樹。被劃分到第Ⅴ分支的MLO蛋白序列利用DNAMAN進行多序列比對,鑒定該分支的保守氨基酸及基序[19]。

1.5 白粉病抗性相關基因的表達分析

感病和抗病材料為本研究前期篩選鑒定出的中國南瓜資源。抗感材料于2021年6月在江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所實驗室的光照培養箱中種植,培養條件為30 ℃光照16 h,25 ℃黑暗8 h,于南瓜苗3葉1心期接種白粉病菌。白粉病菌取自江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所試驗基地發病的大田南瓜葉片,挑取單菌落于吐溫20中,制成2.5×105～5.0×105個/mL孢子懸浮液,噴施接種在健康的感病南瓜幼苗葉片上,置于25～30 ℃、濕度90%的光照培養箱中培養,經5次分離純化后,收集白粉病菌孢子用于接種試驗。接種后置于光照培養箱中,培養條件同上,分別于接種前(0 h),接種后12、24、48、72 h取樣,液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存。分別檢測抗感材料中被劃分到第Ⅴ分枝的MLO基因(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)的表達量。

RNA提取利用翊圣 MolPure? Blood RNA Kit 植物RNA提取試劑盒,cDNA合成利用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒完成。基因的相對表達量采用TOYOBO SYBR? Green Realtime PCR Master Mix熒光定量試劑盒,反應程序:95 ℃,60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40個循環。利用ABIQuantStudioTM6 Flex進行熒光定量PCR。利用NCBI中的Primer-BLAST 設計引物,18S RNA作為內參[20-22]。

表1 熒光定量引物序列

2 結果與分析

2.1 中國南瓜中MLO基因的鑒定與分析

通過同源比對及鑒定,共獲得20個中國南瓜MLO基因(表2),按照其在染色體上的分布命名為CmoMLO1到CmoMLO20。20個CmoMLO基因分布在除了5、10、11、12、14和19號以外的14條染色體上。其中1、2、3、4、13和20號染色體上分別有2個CmoMLO基因分布。鑒定結果表明,中國南瓜的CmoMLO基因數量與美洲南瓜及印度南瓜的MLO基因數量相當。中國南瓜CmoMLO基因大小從 2 965 bp 到9 967 bp不等,所編碼的蛋白質氨基酸數量也從324個至1 264個不等,對應的等電點為6.26～9.63,分子權重為36 403.18～140 267.57 ku,外顯子個數為6～22個(圖1)。20個CmoMLO基因中有9個基因(CmoMLO2、CmoMLO5、CmoMLO8、CmoMLO10、CmoMLO14、CmoMLO15、CmoMLO16、CmoMLO18、CmoMLO20)含有15個外顯子。20個CmoMLO基因編碼的蛋白質氨基酸序列含有2～8個不等的跨膜區,其中12個CmoMLO蛋白(CmoMLO2、CmoMLO4、CmoMLO6、CmoMLO8、CmoMLO9、CmoMLO10、CmoMLO11、CmoMLO13、CmoMLO15、CmoMLO17、CmoMLO18、CmoMLO19)含有7個跨膜螺旋。利用MEGA6采用Align by ClustalW clustlW進行多序列比對,采用最大似然法構建系統發育樹,20個中國南瓜CmoMLO蛋白被分為6個分枝。

表2 中國南瓜MLO家族基因的特征

2.2 第Ⅴ分枝氨基酸序列保守基序預測

利用在線軟件MEME對來自不同作物的第Ⅴ分枝23個MLO氨基酸序列進行保守基序預測(圖2),在參數設置為0.05顯著水平條件下得到22個寬度6～50不等的保守基序,motif1、motif2和motif9是第Ⅴ分枝所有MLO蛋白序列都含有的保守基序,可能與雙子葉植物白粉病抗性有關。

2.3 多序列比對及進化樹分析

85個MLO蛋白聚類分析,分成7個分枝(圖3),中國南瓜的20個MLO基因被劃分到除第Ⅳ分枝外的6個分枝,其中5個被劃分到第Ⅰ分枝(CmoMLO2、CmoMLO7、CmoMLO12、CmoMLO15、CmoMLO16),3個被劃分到第Ⅱ分枝(CmoMLO11、CmoMLO17、CmoMLO20),3個被劃分到第Ⅲ分枝(CmoMLO5、CmoMLO9、CmoMLO10),5個被劃分到第Ⅴ分枝(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19),2個被劃分到第Ⅵ分枝(CmoMLO1、CmoMLO14),2個被劃分到第Ⅶ分枝(CmoMLO3、CmoMLO6)。已知的雙子葉植物抗白粉病相關MLO蛋白均被聚類到第Ⅴ分枝。第Ⅳ分枝涵蓋了所有已知單子葉植物白粉病抗性相關MLO蛋白。

為了揭示第Ⅴ分枝MLO蛋白的序列特點,利用DNAMAN進行多序列比對,鑒定該分枝MLO蛋白的保守氨基酸及基序。結果表明,該分枝的MLO蛋白的氨基酸序列含有7個跨膜結構域(TM1～TM7),且大部分成員的跨膜區氨基酸殘基高度保守(圖4)。

2.4 白粉病抗性相關基因的表達分析

為了檢測中國南瓜白粉病抗性相關MLO基因,于接種后不同時間點取樣,分別檢測抗感材料中被劃分到第Ⅴ分枝的MLO基因的表達量(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)(圖5)。CmoMLO4在抗病材料中接種前后表達量無顯著差異,感病材料中接種后24 h顯著上調,其余幾個時期與接種前表達量無顯著差異。CmoMLO8在抗感材料中接種前后基因表達的整體趨勢較一致,均在接種后12 h顯著上調表達,而后表達量開始下降,但抗病材料中12、48、72 h基因上調表達,顯著高于感病材料。CmoMLO13在抗病材料中接種后12 h顯著上調表達,24、48 h與接種前表達量無顯著差異,接種后72 h再次顯著上調表達,感病材料中接種后24 h顯著上調表達,48 h表達量下降,72 h 再次顯著上調表達。CmoMLO18在抗病材料中接種后12、48 h顯著上調表達。CmoMLO18在感病材料中接種前后表達量無顯著差異。CmoMLO19在抗病材料中接種后12、48、72 h均顯著上調表達。CmoMLO19在感病材料中接種后顯著上調表達,且在24 h達到峰值。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19可能參與了白粉病病菌侵染中國南瓜的重要相關基因,且在接種后24 h是白粉病侵染的關鍵時期。

3 討論與結論

前人研究已證實,MLO基因家族的某些成員在白粉病病菌侵染植物的過程中充當“感病因子”,MLO基因的突變能夠引發植物對白粉病的廣譜抗性,因此MLO基因在植物抗白粉病育種中具有重要的意義。截至目前,葫蘆科蔬菜作物中西瓜、甜瓜、黃瓜、印度南瓜、美洲南瓜、苦瓜等多種作物均已報道了對MLO基因家族成員的鑒定與分析[17,23-26],而關于中國南瓜MLO基因的鑒定與分析還未見報道。本研究采用生物信息學方法,利用中國南瓜基因組數據,共鑒定得到20個MLO基因,基因數量與印度南瓜(20個)和美洲南瓜(18個)相當[25-26]。印度南瓜的20個MLO基因分布在15條染色體上,而中國南瓜的20個MLO基因分布在14條染色體上,2個種中的5、10、11、12、14、19號染色體上均無MLO基因分布,其中1、2、3、4、13、20號染色體均有2個MLO基因分布,說明MLO基因在2個種中具有較高的保守性,同時又存在一定的變異性。對應的等電點為6.26～9.63,外顯子個數為6～22個,有 2～8個不等的跨膜區,與葫蘆科其他作物(西瓜、甜瓜、黃瓜、印度南瓜、美洲南瓜)一致性較高[23,25-26]。系統進化分析表明,中國南瓜MLO蛋白與已報道的葫蘆科其他作物高度相似,均被劃分成6個分枝。

目前的研究表明,雙子葉植物中與白粉病抗性相關的MLO蛋白可能僅分布在第Ⅴ分枝,而單子葉植物中的相關基因僅位于第Ⅳ分枝,但這2個分枝上的基因并不都參與植物與白粉病病菌的互作[27]。因此通過人工接種試驗鑒定中國南瓜第Ⅴ分枝相關MLO基因的表達量變化,發現CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在感病材料接種后24 h顯著上調表達,且上調幅度較高,而在抗病材料中上調表達不顯著或幅度明顯低于感病材料,說明他們可能是白粉病病菌侵染中國南瓜過程中的主要感病因子。CmoMLO8和CmoMLO18在抗感材料中表達量變化趨勢整體上較一致,可能在抗感材料中參與了相似的生物學過程。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在接種感病材料后24 h表達量達到峰值,說明接種后24 h是基因與白粉病病菌互作的關鍵時期。顏惠霞對南瓜白粉病病原菌侵染過程進行觀察發現,接種后24 h白粉病病菌芽管伸長,形成初生菌絲,接種后36 h分生出次級菌絲,接種后96 h串生的分生孢子形成[28]。白粉病病菌侵染黃瓜葉片也有類似的過程[29],本研究中基因表達量變化結果與該細胞學觀察結果相吻合。后續研究中可通過基因敲除或沉默技術進一步驗證CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19基因的功能。