牡蠣共生菌Talaromyces sp.ML-3發酵液的化學成分研究

薛亞偉, 孫 麗, 韓 旭, 袁 夢, 王鳳舞, 申 麗

(1.揚州大學醫學院,江蘇揚州 225001; 2.江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室,江蘇揚州 225001;3.青島農業大學食品科學與工程學院,山東青島 266109)

海洋——生命的起源之母,覆蓋了70%以上的地球表面和90%以上的生物圈。高鹽、高滲、低溫、低氧、低光照、寡營養的海洋極端環境,促使海洋生物必須調整自身的生存適應機制來應對環境壓力,從而形成獨特的代謝系統。因此,海洋生物次生代謝產物表現出陸地環境中未發現的新穎結構和化學特征,這些獨特的次生代謝產物就是海洋生物作為新藥藥源的重要基礎[1-2]。相較于海洋動植物資源的有限性,海洋微生物種類繁多、數量龐大,隨著海洋微生物培養和提取新技術的發展,人們對海洋微生物天然產物的興趣與日俱增,促進了對海洋微生物來源農用和醫用化合物的探索[3-4]。

目前,研究較多的海洋微生物主要有海洋無脊椎動物共附生微生物、海洋植物內生微生物、深海沉積物和海水來源微生物[5]。前期研究中,董玉潔等從長島海域的牡蠣中分離得到多株共生真菌和細菌[6],本研究對其中的共生真菌——籃狀菌(Talaromycessp.)ML-3的化學成分進行研究。綜合運用各種層析方法對Talaromycessp.ML-3發酵液的化學成分進行分離純化,并采用全球天然產物(GNPS)分子網絡分析發酵液的化學成分,以期為后續研究中實現化合物的導向分離、挖掘發現新的和/或具有活性的化合物提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柱層析硅膠(200～300目),青島海洋化工廠分廠;Silica gel 60 F254鋁板(20 cm×20 cm),德國Merck公司;Sephadex LH-20,瑞典Pharmacia Biotech公司;Betasil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)和Sinochrom ODS-AP色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),大連依利特分析儀器有限公司;Atlantis T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),美國安捷倫科技有限公司;DMSO-d6,美國Cambridge Isotope Laboratories;CDCl3,美國Aldrich公司;CD3OD,青島騰龍微波技術有限公司;色譜甲醇,瑞典歐森巴克環保化學公司;色譜甲酸,美國ACS恩科化學公司;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、PCRTaqMaster Mix 試劑盒和SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;DreamTaqDNA Polymerase,美國Thermo Scientific公司;其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

DD2 400核磁共振波譜儀,美國安捷倫科技有限公司;JEOL 500核磁共振儀,日本電子株式會社;TripleTOF 4 600超高效液相色譜儀-四級桿串聯飛行時間質譜,美國AB SCIEX有限公司;LC 3000N高效液相色譜儀,北京創新通恒色譜技術有限公司;Isolera one快速純化制備液相色譜,瑞典Biotage公司;SKY-200B恒溫振蕩搖床,上海蘇坤實業有限公司;SHP-250恒溫培養箱,上海精宏實驗設備有限公司;Applied Biosystems 2720 PCR儀,賽默飛世爾科技有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗菌株 菌株ML-3是青島農業大學王鳳舞博士于2010年9月從黃渤海交界(長島)海域采集的牡蠣中分離得到的1株共生真菌,菌株的分離和純化參照文獻[7]中的方法進行。牡蠣共生菌ML-3現保存于揚州大學醫學院。

1.3.2 菌株的鑒定 菌株接種至PD培養基中培養3～5 d,按照試劑盒說明書提取DNA。采用通用引物擴增菌株的內轉錄間隔區(ITS)rDNA序列,擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測得ITS序列上傳至GenBank中進行Blast比對分析,用MEGA 7軟件構建系統發育樹。

1.3.3 菌株發酵和發酵產物的分離純化 采用真菌1號培養基進行液體發酵,菌株接種至PDA培養基上28 ℃培養2～3 d,將新鮮菌體接種至裝有 200 mL PD培養基的500 mL錐形瓶中,搖床28 ℃、120 r/min 培養3 d;種子液以每瓶5～10 mL接種量接種至1 000 mL錐形瓶(400 mL培養基)中,室溫靜置培養28 d。發酵液經等體積乙酸乙酯萃取3次、減壓去除溶劑得到粗浸膏44 g。該粗浸膏經硅膠柱層析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脫(體積比為 100∶0→0∶100)得到15個組分(Fr.1～Fr.15)。組分Fr.5經硅膠柱層析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脫(體積比為 100∶0→0∶100)得到Fr.5-2,經Sephadex LH-20 凝膠柱層析(CHCl3∶CH3OH 體積比為 1∶1)得到Fr.5-2-1～Fr.5-2-3。其中,Fr.5-2-2經硅膠柱層析,石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比為 100∶0→0∶100)得到Fr.5-2-2-3,經高效液相色譜(HPLC)[Betasil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 體積比為 78∶22,1 mL/min]純化得到化合物4(0.6 mg,tR=27 min)。組分Fr.6經硅膠柱層析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脫(體積比為 100∶0→0∶100)得到Fr.6-2,經Sephadex LH-20凝膠柱層析(CHCl3∶CH3OH 體積比為 1∶1),得到Fr.6-2-1～Fr.6-2-4。Fr.6-2-2經HPLC[Sinochrom ODS-AP 柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 體積比為 25∶75,1 mL/min]純化得到化合物2(0.5 mg,tR=28 min);Fr.6-2-3經HPLC[Sinochrom ODS-AP 柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 體積比為 70∶30,1 mL/min]純化得到化合物1(2 mg,tR=25 min)。組分Fr.10經硅膠柱層析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脫(體積比為 100∶0→0∶100)得到Fr.10-1～Fr.10-3,其中,Fr.10-2經Sephadex LH-20凝膠柱層析(CHCl3∶CH3OH 體積比為 1∶1)得到Fr.10-2-2,經HPLC[Betasil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 體積比為 48∶52,1 mL/min]純化得到化合物3(1.5 mg,tR=45 min)。

1.3.4 液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定 (1)高效液相色譜條件:Atlantis T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);流動相A(0.1%甲酸水溶液),流動相B(甲醇),梯度洗脫(0～5 min,70%→40% A;5～15 min,40%→15% A;15～20 min,15%→1% A);0.3 mL/min;40 ℃;進樣量5 μL。(2)四級桿串聯飛行時間質譜條件:全掃描模式;氣簾氣壓力 35 kV;霧化溫度550 ℃;霧化氣 379.2 kPa;噴霧電壓5 500 V;去簇電壓80 eV;碰撞電壓35 eV;一級母離子掃描范圍[質荷比(m/z)]為100～2 000;二級子離子掃描范圍m/z50～2 000。

1.3.5 特征峰分子網絡構建 原始質譜數據文件經MSconvert軟件轉換成.mzXML格式文件,再經MZmine 2軟件處理后以.csv和.mgf格式導出,并上傳至GNPS分子網絡平臺Feature Networking模塊構建特征峰分子網絡(feature based molecular networking,FBMN)。具體參數設置:前體離子質量誤差值0.02 u,碎片離子質量誤差值0.02 u,特征峰分子網絡內節點間碎片匹配峰≥4個,節點之間的相關余弦值≥0.6。生成的FBMN導入Cytoscape軟件進行可視化。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

菌株ML-3的ITS rDNA序列經PCR擴增后測序,測得的ITS序列上傳至GenBank中進行Blast比對分析(GenBank登錄號:ON005440),構建系統發育樹。由圖1可知,菌株ML-3被鑒定為Talaromycessp.。

2.2 化合物的結構鑒定

由圖2可知,化合物1:黃色粉末;高分辨電噴霧質譜(HR-ESI-MS)m/z271.060 5[M+H]+和m/z269.046 6[M-H]-,分子式為C15H10O5(C15H11O5計算值為 271.060 1);1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.51(1H,s,H-5),7.02(1H,s,H-7),7.01(1H,d,J=2.4 Hz,H-4),6.19(1H,d,J=2.4 Hz,H-2),2.40(3H,s,H-11)。以上1H-NMR數據與文獻[8]中的報道一致,故化合物1被鑒定為大黃素(emodin)。

化合物2:棕色固體;HR-ESI-MSm/z162.093 9[M+H]+和m/z184.074 1[M+Na]+,分子式為C10H11NO(C10H12NO計算值為 162.091 3);1H-NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.03(1H,br s,1-NH),7.63(1H,d,J=8.0 Hz,H-4),7.38(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),7.22(1H,t,J=7.6 Hz,H-6),7.13(1H,t,J=7.6 Hz,H-5),7.10(1H,s,H-2),3.92(2H,t,J=6.0 Hz,H-9),3.05(2H,t,J=6.0 Hz,H-8)。以上1H-NMR數據與文獻[9]中的報道一致,故化合物2被鑒定為3-indolethanol。

化合物3:橙黃色粉末;HR-ESI-MSm/z287.054 2[M+H]+和m/z309.035 6[M+Na]+,分子式為C15H10O6(C15H11O6計算值為287.055 0);1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.37(1H,s,1-OH),12.20(1H,s,8-OH),7.64(1H,s,H-5),7.23(1H,s,H-7),7.01(1H,s,H-4),6.38(1H,s,H-2),5.54(1H,s,11-OH),4.60(2H,d,J=2.0 Hz,H-11)。以上1H-NMR數據與文獻[8]和[10]中的報道基本一致,故化合物3被鑒定為 ω-hydroxy-emodin。

化合物4:棕色固體;HR-ESI-MSm/z425.303 0[M+H]+和m/z447.285 8[M+Na]+,分子式為C28H40O3(C28H40NaO3計算值為447.287 0);1H-NMR(CDCl3,500 MHz)δ:6.36(1H,s,H-4),5.27(2H,m,H-22,H-23),2.81(1H,t,J=8.9 Hz,H-9),2.65(1H,d,J=16.7 Hz,H-7a),2.44～2.53(6H,m,H-2ab,H-7b,H-16ab,H-20),1.97～2.06(4H,m,H-1ab,H-11a,H-12a),1.83～1.92(2H,m,H-11b,H-24),1.68～1.78(3H,m,H-12b,H-15ab),1.43～1.51(2H,H-17,H-25),1.27(3H,s,H-19),1.09(3H,d,H-21),0.98(3H,s,H-18),0.91(3H,d,H-28),0.83(3H,d,H-27),0.81(3H,d,H-26)。以上1H-NMR 數據與文獻[11]中的報道基本一致,故化合物4被鑒定為(22E,24R)-8,14-epoxyergosta-4,22-diene-3,6-dione。

2.3 Talaromyces sp.ML-3發酵液粗浸膏的特征峰分子網絡分析

由圖3可知,Talaromycessp.ML-3發酵液粗浸膏和“種子”化合物1～化合物4共同構建的特征峰分子網絡圖中已標出4個“種子”化合物。該特征峰分子網絡(FBMN)共有1 149個節點,并形成862個節點簇(節點數 ≥ 3個的節點簇有24個)。其中,有7個節點簇節點分子的相對含量較高,最高的是2個單節點簇,為303.229 6和317.245 3。利用GNPS平臺的Library Search功能進行搜庫,結果表明,節點簇A存在脂肪酸類化合物,節點簇B存在二蒽醌類化合物,節點簇C存在單蒽核蒽醌類化合物,節點簇D存在環二肽類化合物,節點簇E存在香豆素類化合物。盡管化合物1和化合物3皆為單蒽核蒽醌類化合物,但2個化合物并未形成同一個節點簇,馬小翔等利用GNPS分子網絡分析土曲霉C23-3次生代謝產物時也出現類似現象[12]。此外,2個單節點簇303.229 6和317.245 3的二級質譜皆只有一個信號,無法預測其結構類型。

依據GNPS平臺的搜庫結果以及“種子”化合物,進一步仔細分析上述節點簇中節點分子的二級質譜,對節點分子的化學結構進行鑒定。由圖4可知,節點簇A中,節點295.263 8([M+H-H2O]+)的二級質譜與GNPS光譜庫數據一致,故將其鑒定為methyl 12-hydroxy-9-octadecenoate(化合物5),在此基礎上,推測節點281.247 7([M+H-H2O]+)和297.279 0([M+H-H2O]+)分別為12-hydroxyl-9-octadecenoic acid(化合物6)和methyl 12-hydroxyoctadecanoate(化合物7)。由圖5可知,節點簇B中,節點543.1 291([M+H]+)的二級質譜與GNPS光譜庫數據一致,故將其鑒定為rugulosin A(化合物8);根據節點559.124 2([M+H]+)和575.119 1([M+H]+)與543.129 1(rugulosin A,化合物8)的關系,將其分別鑒定為rugulosin B(化合物9)和rugulosin C(化合物10)。

由圖6可知,節點315.050 3([M+H]+)和301.034 4([M+H]+)的二級質譜與GNPS光譜庫數據一致,故將其分別鑒定為endocrocin(化合物11)和emodic acid(化合物12);根據297.0 397([M+H]+)和329.065 9([M+H]+)與315.050 3(endocrocin,化合物11)的關系,推測上述2個節點化合物分別為2,3-anthracenedicarboxylic acid(化合物13)和2-acetyl-1,3,8-trihydroxy-6-met hoxyanthracene-9,10-dione(化合物14); 依據節點301.034 4(emodic acid,化合物12),可推測317.029 2([M+H]+)和316.046 5([M+H]+)分別為2-(dihydroxymethyl)-1,6,8-trihy droxy-3-methylanthracene-9,10-dione(化合物15)和1,4,5-trihydroxy-8-[(3-hydroxyp ropyl)amino]anthracene-9,10-dione(化合物16);二級質譜顯示,節點187.060 2[M+H]+(C8H10O5,tR=2.06 min)與節點173.044 5[M+H]+(C7H8O5,tR=1.51 min)的MS2碎片非常相似,節點187.060 2僅比節點 173.044 5 多1個信號(187.060 2[M+H]+),提示2個節點分子具有相同的骨架,但因沒有更多的信息,暫未鑒定出它們的具體結構。此外,節點271.060 2與“種子”化合物1具有相同的二級質譜,是同一個化合物。

由圖7可知,節點簇D中,節點211.144 3([M+H]+)的二級質譜與GNPS光譜庫數據一致,故將其鑒定為cyclo(Pro-Leu)(化合物17),在此基礎上,推測節點197.128 4([M+H]+)、213.160 0([M+H]+)和245.128 4([M+H]+)分別為cyclo(Pro-Val)(化合物18)、cyclo(Val-Ile)(化合物19)和cyclo(Phe-Pro)(化合物20)。節點簇E中,節點235.096 6([M+H]+)的二級質譜與GNPS光譜庫數據一致,故將其鑒定為 7-hydroxy-3-(2-hydroxypropyl)-5-methyl-1H-isochromen-1-one(化合物21),并進一步將節點219.101 7([M+H]+)鑒定為5-hydroxy-7-methyl-4-propyl-2H-chromen-2-one(化合物22)。化合物5至化合物22的結構見圖8。

3 討論

海洋微生物是具有顯著生物活性和藥用前景先導化合物的潛在來源[13-14]。從地中海鏈霉菌(Streptomycesmediterranoi)中分離得到利福霉素類化合物,以利福霉素B為先導化合物,經結構修飾得到治療肺結核的利福平[15]。炭疽菌引起的蘋果炭疽葉枯病(Glomerellaleaf spot,GLS)是我國近年來新發現的一種危害嚴重的流行性病害和重點防治對象,珊瑚共生鏈霉菌(Streptomycessp.)DC4-5產生的新大環內酯化合物iseolides A～iseolides C對炭疽菌(Glomerellacingulate)具有較明顯的抑制作用,最低抑菌濃度(MIC)為0.19～6.25 μg/mL;抑菌活性測定結果顯示,它們對人的致病菌如白色念珠菌(Candidaalbicans)和紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)具有類似的抑制作用[16]。海藻內生真菌Acremoniumvitellinum產生的新天然產物——氯霉素衍生物(4S)-4-[(S)-hydroxy(4-nitrophenyl)methyl]-2-oxazolidinone對棉鈴蟲具有顯著的殺蟲活性,其LC50為(0.56±0.03)mg/mL,與陽性對照苦參堿[LC50為(0.24±0.01)mg/mL]相當[17]。海洋微生物是極具研究開發價值的生物活性次生代謝物的有效生產者,是一個潛力巨大的微生物新資源庫[1]。

基于LC-MS/MS的GNPS分子網絡是一種可應用于天然產物分析的可視化工具[18],其Library Search功能可快速、大規模地鑒定已知化合物和相似化合物,并挖掘新化合物;此外,GNPS分子網絡在分析菌株代謝產物多樣性方面具有強大的統計學優勢,可用于指導菌株培養方法和提取工藝的優化[19]。本研究采用GNPS分子網絡分析Talaromycessp.ML-3發酵液的化學成分,從其發酵液中共識別出22個化合物,具體為:11個蒽醌類化合物(3個二蒽醌和8個單蒽核蒽醌)、3個脂肪酸類化合物、4個環二肽、2個香豆素類化合物、1個吲哚生物堿和1個麥角甾醇,這些結構類型的化合物不乏極具潛力的先導化合物。

大黃素等4種天然蒽醌化合物與新白葉藤堿衍生物Z-24復配得到的農用殺菌劑能防治立枯絲核菌、禾谷鐮刀菌和稻瘟病病菌等引起的植物病害,表現出殺菌譜較廣、毒性較低、有效延緩植物病原菌耐藥性產生等優勢[20]。二蒽醌通常由2個相同或不同的蒽醌單體通過1～4個C—C鍵連接在一起,與單體相比,二聚化賦予其良好的生理活性。從PenicilliumislandicumSopp.中分離得到的二蒽醌skyrin對小鼠白血病細胞L1210具有細胞毒活性[21];從PenicilliumradicumFKI-3765-2中分離得到的二蒽醌rugulosins A～rugulosins C均可抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[22]。研究顯示,Talaromycessp.YE3016中存在同時控制skyrin和rugulosin A生物合成的rug基因簇[23];Talaromyces屬真菌中,T.rugulosus[24]、T.brunneus[25]和T.wortmannii[26]是skyrin和rugulosin A的共同生產者。本研究發現,Talaromycessp.ML-3發酵液中存在rugulosins A～rugulosins C(化合物8～化合物10),說明它也是二蒽醌的有效生產者。Talaromycessp.ML-3發酵產物化學成分十分豐富,但目前只識別出其中少量化合物,后續將進一步以已知化合物作為“種子”進行化學成分的識別,以期挖掘發現新的和/或具有活性的化合物。

4 結論

從牡蠣共生真菌Talaromycessp.ML-3發酵液粗浸膏中分離純化得到4個化合物:emodin(化合物1)、3-indolethanol(化合物2)、ω-hydroxy-emodin(化合物3)和(22E,24R)-8,14-epoxyergosta-4,22-diene-3,6-dione(化合物4)。LC-MS/MS分子網絡分析結果顯示,Talaromycessp.ML-3發酵液中含有豐富的化學成分,包括蒽醌類、脂肪酸類、環二肽類、香豆素類、吲哚生物堿和麥角甾醇類等物質。本研究結果為后續化合物的導向分離和新活性化合物的挖掘提供了依據。