黏質(zhì)沙雷氏菌H04的有機(jī)磷降解活性及促生能力

李 翯, 王鵬宇, 陳子軒, 王柳楠, 徐晨琪, 任 虹

(北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院/北京工商大學(xué)中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

利用解磷菌作為微生物菌劑是一種低成本、生態(tài)安全、可持續(xù)的具有環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益的替代策略[6]。解磷菌可通過產(chǎn)酸或酶解將難溶性有機(jī)磷和無機(jī)磷轉(zhuǎn)化成有效磷,從而直接或間接促進(jìn)植物生長[7-9]。解磷菌多來自植物的根際處,主要屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和不動桿菌屬(Acinetobacter)[10-11]。其中,黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一類革蘭氏陰性菌株,許多研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌可通過誘導(dǎo)磷酸鹽的溶解、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶的分泌以及鐵載體的產(chǎn)生來促進(jìn)植物生長[12-14]。Farhat等報道,黏質(zhì)沙雷氏菌能溶解難溶性無機(jī)磷,包括磷礦、磷酸三鈣和羥基磷灰石[15]。George等從椰子樹根際分離得到的黏質(zhì)沙雷氏菌KiSⅡ具有良好的解磷能力,其分解磷酸三鈣最高可釋放 216 μg/mL 的有效磷,并顯著促進(jìn)水稻生長[16]。然而,目前關(guān)于黏質(zhì)沙雷氏菌對有機(jī)磷源的利用和相應(yīng)解磷機(jī)制的研究較少。

本研究以來自北京工商大學(xué)的槐樹根際土壤的黏質(zhì)沙雷氏菌H04為研究對象,定性、定量評價其對有機(jī)磷源(卵磷脂、植酸)的利用能力,探討其解磷機(jī)制,并初步探究H04對輪作農(nóng)作物綠豆和小麥種子早期生長的影響,以期為農(nóng)作物微生物菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)于2021年6—10月在中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。黏質(zhì)沙雷氏菌H04,筆者所在課題組從北京工商大學(xué)(116°19′26″E,39°55′24″N)槐樹根際處篩選得到。磷酸酶、植酸酶活性和綠豆小麥發(fā)芽試驗(yàn)中陽性對照菌株:綠針假單胞菌產(chǎn)金色亞種。

1.1.2 培養(yǎng)基 有機(jī)磷固體培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸鈣 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,瓊脂 18.0 g,去離子水1 000 mL。

有機(jī)磷液體培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸鈣 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,去離子水1 000 mL。

NB培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,氯化鈉 5 g,去離子水1 000 mL。

1.2 解磷能力的評價

1.2.1 定性評價 解磷能力的定性評價應(yīng)用點(diǎn)培養(yǎng)法[17]。使用滅菌的牙簽,將菌株H04分別點(diǎn)接種于以卵磷脂或植酸鈣為唯一磷源的有機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板上,每個平板接種3個點(diǎn),3組平行試驗(yàn),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察有無透明圈的產(chǎn)生,并每天測量透明圈直徑(含菌落)與菌落直徑,計算解磷指數(shù),解磷指數(shù)=A/B,其中A是包括菌落在內(nèi)的透明圈直徑,B是菌落直徑。解磷指數(shù)大于1表明菌株在平板上有解磷活性。

1.2.2 定量評價 解磷能力的定量評價應(yīng)用鉬銻抗比色法[18]。菌株H04在NB培養(yǎng)基中以 180 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜,調(diào)整D600 nm為0.6。NB培養(yǎng)液接種到以卵磷脂或植酸鈣為唯一磷源的有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)。定期取10 mL培養(yǎng)液用鉬銻抗比色法測定其可溶磷的含量。用pH計測定培養(yǎng)基的pH值。

1.3 解磷機(jī)制的初步研究

1.3.1 種子液的配制 菌株H04在NB培養(yǎng)基中180 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜,調(diào)整D600 nm為0.6。

1.3.2 磷酸酶活性測定 將菌株H04以2%的接種量接種于以卵磷脂為唯一磷源的有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。用酸性磷酸酶和堿性磷酸酶試劑盒檢測酶活性。以37 ℃中1 mL液體1 min水解1 μmol對硝基苯磷酸二鈉產(chǎn)生對硝基苯酚定義為一個酶活單位。所有測量進(jìn)行3組重復(fù),以未接種的培養(yǎng)基作為陰性對照,以已被報道具有植物生長促進(jìn)活性和抗菌活性的微生物綠針假單胞菌產(chǎn)金色亞種作為陽性對照(CK+)[19]。

1.3.3 植酸酶活性測定 將菌株H04以2%的接種量接種于以植酸鈣為唯一磷源的有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。以GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》為標(biāo)準(zhǔn),采用分光光度法測定菌株H04的植酸酶活性[20]。在37 ℃、pH值5.5條件下,每分鐘從5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機(jī)磷,即為一個植酸酶活性單位。用下列公式計算植酸酶活性:

植酸酶活性(U/mL)=(y×n)/(m×t)。

式中:y代表無機(jī)磷含量,μmol;m代表樣品體積,mL;t代表酶解反應(yīng)時間,min;n代表樣品稀釋倍數(shù);所有測量均重復(fù)3次,以未接種的培養(yǎng)基作為陰性對照。綠針假單胞菌產(chǎn)金色亞種作為陽性對照(CK+)。

1.4 H04對綠豆和小麥早期生長的影響

為制備接種物,將菌株置于NB培養(yǎng)基中 30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)8 h。接種前,綠豆和小麥種子表面用0.1% NaClO滅菌5 min,無菌去離子水洗滌3次。以每30粒種子15 mL的比例,將細(xì)菌懸浮液作為種子浸液施用3 h后風(fēng)干。然后將每30粒風(fēng)干種子轉(zhuǎn)移到放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,設(shè)置3組平行。培養(yǎng)皿中,種子在黑暗下培養(yǎng)48 h,然后在室溫下以晝夜為周期進(jìn)行培養(yǎng)。按照要求用無菌去離子水澆水。以無菌去離子水浸種的種子為陰性對照(CK-),綠針假單胞菌產(chǎn)金色亞種為陽性對照(CK+)。

培養(yǎng)3 d,統(tǒng)計綠豆和小麥種子發(fā)芽數(shù)。7 d時,測定綠豆幼苗的根長、根粗、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根系活力,同時測定小麥幼苗的出苗率、根長、芽長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和總?cè)~綠素含量。

應(yīng)用TTC法計算根系活力[21],并用TTC還原強(qiáng)度來表示:

TTC還原強(qiáng)度[μg/(g·h)]=TTC還原質(zhì)量(μg)/根鮮質(zhì)量(g)×?xí)r間(h)。

應(yīng)用研磨提取法,并用80%丙酮提取總?cè)~綠素[22],按公式計算葉綠素含量:

葉綠素a含量(mg/g)=(12.7D663 nm-2.59D645 nm)×提取液體積(mL)/1 000×樣品質(zhì)量(g);

葉綠素b含量(mg/g)=(22.9D645 nm-4.67D663 nm)×提取液體積(mL)/1000×樣品質(zhì)量(g)。

總?cè)~綠素含量(mg/g)=葉綠素a含量(mg/g)+葉綠素b含量(mg/g)。

1.5 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 25.0進(jìn)行。通過方差分析和皮爾遜相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。為了檢測均值之間差異的統(tǒng)計學(xué)意義(α=0.05),進(jìn)行了鄧肯多重范圍檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷能力評價

定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),菌株H04在分別含有卵磷脂、植酸鈣為唯一磷源的有機(jī)磷固體培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生明顯的透明圈(圖1),解磷指數(shù)分別為1.94和5.89。

定量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)磷源為卵磷脂時,可溶性磷含量在1 d時顯著下降,之后逐漸上升,發(fā)酵4 d后達(dá)到最大值(2.89±0.12)mg/L,如圖2-A所示。與初始pH值相比, pH值在1 d時降至最低5.02,2 d 時升至7.93,隨后一直穩(wěn)定在堿性(pH值7.93～8.36),隨著pH值的增加,可溶性磷含量逐漸增多,但兩者相關(guān)性不顯著。

如圖2-B所示,當(dāng)磷源為植酸鈣時,可溶性磷含量逐漸升高,在2 d達(dá)到(20.26±1.04)mg/L,并維持至7 d達(dá)到峰值(22.99±0.45)mg/L。pH值由0 d時的5.75降至1 d時的2.75,2 d至7 d時維持在2.45～2.90之間。可溶性磷含量與pH值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

2.2 解磷機(jī)制的研究

2.2.1 磷酸酶活性 為了進(jìn)一步探討可溶性磷含量的增加與相關(guān)酶活性的關(guān)系, 對菌株H04的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖 3-A 和圖3-B所示,與CK+相比,菌株H04的酸性磷酸酶活性較低,而堿性磷酸酶活性明顯高于陽性對照CK+。菌株H04的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在3 d同時達(dá)到最大值,分別為(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L。

2.2.2 植酸酶活性 H04的植酸酶活性結(jié)果如圖3-C所示。菌株H04的植酸酶活性在3 d時達(dá)到最大值,為(1 417.01±48.38)U/L,與CK+相比,菌株H04具有更高的植酸酶活性。

2.3 H04對綠豆和小麥種子早期生長的影響

2.3.1 對綠豆生長的影響 菌株H04對綠豆發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表1和圖4所示。與陰性對照(CK-)相比,菌株H04處理增加了綠豆的萌發(fā),發(fā)芽率顯著增加了11%,而綠豆幼苗的鮮質(zhì)量、根長、根粗和根系活力也顯著提高,分別增加了25%、162%、35%和212%。菌株H04對綠豆生長的影響效果大于陽性對照(CK+),尤其,根長和根系活力效果顯著,分別提高了135%和132%。

表1 H04對綠豆發(fā)芽率和早期生長的影響

2.3.2 對小麥生長的影響 菌株H04對小麥發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表2所示。與CK-相比,接種H04可顯著促進(jìn)小麥種子的萌發(fā), 分別顯著提高發(fā)芽率12%和出苗率17%,而生物量和總?cè)~綠素含量方面無顯著差異。菌株H04對小麥早期生長的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于CK+。

表2 H04對小麥發(fā)芽率、出苗率和早期生長的影響

3 討論

本研究對黏質(zhì)沙雷氏菌H04的解有機(jī)磷(卵磷脂和植酸鈣)能力進(jìn)行定性和定量測定,初步探究其解磷機(jī)制,并初步研究其對輪作作物綠豆和小麥的早期生長的影響,為后續(xù)研究和促生應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

通過有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上形成解磷透明圈,作為定性評價細(xì)菌解磷能力的依據(jù),是一種有用但非決定性的方法。因此,有必要結(jié)合解磷菌在液體培養(yǎng)中的定量試驗(yàn)來評價其解磷能力[23]。解磷能力的定性和定量試驗(yàn)的結(jié)果表明,H04表現(xiàn)出了降解卵磷脂和植酸鈣的能力,解磷指數(shù)分別為1.94和5.89,可溶性磷含量最高分別為(2.89±0.12)mg/L和(22.99±0.45)mg/L。

解磷菌對有機(jī)磷的礦化作用主要與酶解作用有關(guān)[24]。在以植酸鈣為唯一磷源的發(fā)酵試驗(yàn)中,H04通過分泌植酸酶降解植酸鈣,并且當(dāng)培養(yǎng)至3 d時,酶活最高可達(dá)(1 417.01±48.38)U/L(圖3-C)。Tang等曾報道黏質(zhì)沙雷氏菌 SM01能分泌植酸酶(500 U/L)[25],與筆者所在課題組的結(jié)果相符。另外,試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),H04通過分泌植酸酶來增溶植酸鈣時,培養(yǎng)液的pH值始終維持在2.81～2.88,表明酸性條件有利于黏質(zhì)沙雷氏菌H04分泌植酸酶,提高植酸酶活性,促進(jìn)植酸鈣降解。

到目前為止,黏質(zhì)沙雷氏菌對卵磷脂解磷機(jī)制的研究尚未見報道。在以卵磷脂為唯一磷源的發(fā)酵試驗(yàn)中,可溶性磷含量在前3 d呈較低的水平,而酸性磷酸酶和堿性磷酸酶在這期間逐漸升至最高,分別為(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L,其中,酸性磷酸酶活性低于CK+,而堿性磷酸酶活性明顯高于CK+(圖3-A、圖3-B)。這可能是由于低磷水平下,促使H04分泌磷酸酶,磷酸酶的活性升高,促進(jìn)難溶卵磷脂的分解。此外,H04溶解卵磷脂時,酸性磷酸酶活性較低,在4.57～17.07 U/L之間,而堿性磷酸酶活始終高于酸性磷酸酶,堿性磷酸酶活性在17.47～35.20 U/L之間。這可能是由于培養(yǎng)液的pH值呈堿性(7.93～8.36)更利于堿性磷酸酶發(fā)揮作用。首次發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌 H04對卵磷脂的利用與酸性磷酸酶和堿性磷酸酶有關(guān),并主要分泌堿性磷酸酶來降解卵磷脂。

以黏質(zhì)沙雷氏菌作為微生物菌劑對于單一作物的促生能力已經(jīng)有所報道。例如Breitkreuz等[26]研究發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌(UFV-E13)對番茄的影響,并能提高番茄株高,控制黑斑病。Hameeda等報道,從堆肥中分離出的黏質(zhì)沙雷氏菌EB67,可提高玉米的生物量(干質(zhì)量)和玉米籽粒產(chǎn)量[27]。但是目前已報道的黏質(zhì)沙雷氏菌促生能力研究多集中于種植單一作物,然而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)往往以輪作的形式進(jìn)行,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,經(jīng)常選擇豆科植物和禾本科作物輪作增產(chǎn),這對于減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對化學(xué)磷肥和農(nóng)藥的依賴、保護(hù)農(nóng)田生物多樣性以及提高資源利用效率具有重要意義[28-29]。此外,豆科植物還可以通過改變根際土壤磷的含量,促進(jìn)相鄰禾本科作物對磷的吸收,從而提高磷的利用率[30]。因此,筆者所在課題組進(jìn)行了H04對豆科作物(綠豆)和禾本科作物(小麥)的種子萌發(fā)和早期生長的影響試驗(yàn),將H04分別接種于綠豆和小麥種子,結(jié)果表明,H04對綠豆和小麥的生長有積極的影響,如表1、表2、圖4所示。接種H04可提高綠豆幼苗的發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、根長、根粗和根系活力,還可增強(qiáng)小麥的發(fā)芽率和出苗率,特別對綠豆的根長和根系活力,可分別顯著增長135%和132%。H04能更好地促進(jìn)這2種作物的種子萌發(fā)和生長發(fā)育。因此,黏質(zhì)沙雷氏菌H04對于2種輪作農(nóng)作物(豆科作物綠豆與禾本科作物小麥)種子發(fā)育生長起到有益影響,有望成為改善農(nóng)作物生長的生物可持續(xù)替代品。

4 結(jié)論

黏質(zhì)沙雷氏菌H04在有機(jī)磷固體和液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出良好的利用卵磷脂和植酸鈣的能力。黏質(zhì)沙雷氏菌 H04通過分泌堿性磷酸酶來分解卵磷脂、分泌植酸酶來分解植酸鈣。對綠豆和小麥的早期生長試驗(yàn)表明,黏質(zhì)沙雷氏菌 H04能提高二者的發(fā)芽率和根系生長,特別是對綠豆的促進(jìn)作用十分顯著。本研究首次報道了黏質(zhì)沙雷氏菌對于卵磷脂的利用與酸性磷酸酶和堿性磷酸酶有關(guān),并且主要分泌堿性磷酸酶來降解。總體結(jié)果表明,H04可以作為植物促生菌劑的潛在候選,在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,特別是豆科作物和禾本科作物輪作系統(tǒng)中表現(xiàn)出巨大的潛力,進(jìn)一步的開發(fā)利用將證實(shí)這種潛力及其未來的商業(yè)應(yīng)用。