基于Illumina MiSeq技術(shù)分析谷子根際叢枝菌根真菌群落多樣性

段 明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗教學(xué)中心,山西太谷 030801)

谷子[Setariaitalica(L.)Beauv]為禾本科狗尾草屬,耐旱、耐貧瘠、水分利用率高[1]。目前,已成為單子葉作物抗逆研究的模式植物[2]。研究發(fā)現(xiàn),叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)可使谷子根系高效利用土壤中磷元素,進(jìn)而有利于產(chǎn)量的提高[3],AMF通過與宿主共生來提高植物的抗旱性。谷子抗旱性很強的特點除了與自身生理生態(tài)性質(zhì)有關(guān),其根系周圍AMF的結(jié)構(gòu)及多樣性也不容忽視。因此,通過宏基因組測序分析不同品種谷子根系A(chǔ)MF種群特征,探索與谷子自身抗旱能力之間的相關(guān)性具有重要意義。AMF隸屬球囊菌門,與絕大多數(shù)陸生植物都能形成普遍存在的內(nèi)共生關(guān)系。在土壤微生物群體中,AMF的定殖依賴于特異信號的識別、傳導(dǎo)和交換,這個過程涉及植物根細(xì)胞將菌絲的內(nèi)化,進(jìn)而AMF附著枝從根表面滲入到根內(nèi),將菌絲縱向蔓延在根系周圍形成叢枝[4]。研究表明,AMF群落結(jié)構(gòu)主要受非生物與生物兩大因素影響。非生物因素如在森林、草原和沼澤生態(tài)系統(tǒng)中,AMF群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著差異[5]。生物因素主要指宿主本身對AMF的影響,植物會選擇與之互利共生的AMF[6],但目前這種說法還存在爭議。AMF最重要的生態(tài)功能就是與宿主建立共生關(guān)系來促進(jìn)植株的生長,提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn),植物與AMF形成穩(wěn)定的共生關(guān)系有利于它們的生存及對逆境脅迫的抗性。植物向AMF提供脂類以合成生命所需的脂肪酸;反過來,定殖于根系的AMF為植物提供水分和養(yǎng)分,促進(jìn)對土壤氮磷及礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和轉(zhuǎn)運[7],從而促使植株生長發(fā)育,提高植株對脅迫的耐受性。此外,AMF對植株分子和生理生化過程的調(diào)控亦具有很大影響。研究表明,接種AMF后,植物的光合、滲透調(diào)節(jié)及抗氧化能力得到大幅提高,抗旱性與未接種的植物相比也顯著增強[8];此外,植物體內(nèi)抗旱相關(guān)基因的表達(dá)也受到AMF強烈的誘導(dǎo)[9]。近期一些研究表明,谷子根系中的AMF可有效提高對磷元素的吸收進(jìn)而達(dá)到增產(chǎn)的效果[3],而接種根際固氮細(xì)菌也可顯著促進(jìn)狗尾草的生長發(fā)育[10],這2項研究均與谷子密切相關(guān)。谷子耐旱適應(yīng)性強,然而,目前對谷子抗旱性的研究主要集中在基因表達(dá)調(diào)控方面。MiSeq高通量測序具有準(zhǔn)確性高和通量大的特點,為谷子根際微生物的研究創(chuàng)造了條件,為此,采用高通量測序技術(shù)研究干旱脅迫下不同谷子品種根際AMF群落分布特征,以便充分發(fā)掘和利用AMF優(yōu)勢菌群,為谷子抗旱研究奠定基礎(chǔ)。本研究通過宏基因組測序分析鑒定與干旱相關(guān)的叢枝菌根真菌,并解析干旱條件下谷子根系叢枝菌根群體的結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子材料選用豫谷1號(YG)、沁黃(QH)、安陵(AN)3個品種。2018年,將3個品種種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校外農(nóng)作站旱棚中,苗期開始進(jìn)行不澆水干旱處理,10 d后取樣,通過抖根法至土壤不再下落,根際土壤即為黏在根系表面的土壤,去除土壤雜質(zhì),連同植物根系放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?個品種進(jìn)行3次重復(fù),CK為不含谷子根系的土壤對照。

1.2 土壤宏基因組DNA的提取及檢測

利用土壤專用的基因組試劑盒(天根)提取土壤中微生物基因組DNA,提取后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 PCR擴增以及Illumina MiSeq測序

AMF的擴增采用引物AMV4.5NF(5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′)和AMDGR(5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)。擴增完成后,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析,在上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq測序。

1.4 高通量數(shù)據(jù)分析

利用FLASH軟件與QIIME軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)的測定

由表1可知,試驗土壤在正常澆水與干旱條件下的含水量分別為7.64%和3.69%,測定結(jié)果顯示,土壤的pH值分別為8.46和8.09,按土壤pH值分級標(biāo)準(zhǔn),試驗土壤呈堿性。按照土壤養(yǎng)分等級標(biāo)準(zhǔn)觀察,速效氮含量為61.4～70.4 mg/kg,屬于四級水平,速效磷含量為22.42～28.12 mg/kg,屬于二級級水平,速效鉀含量為183.6～185.3 mg/kg,屬于二級水平,有機質(zhì)含量為21.62～25.05 g/kg,屬于三級水平。

2.2 OTU統(tǒng)計及分類學(xué)分析

按97%序列相似度進(jìn)行歸并和操作分類單元(OTU)劃分,由圖1可知,谷子根際AMF群落的多樣性及種群豐度顯著低于CK。統(tǒng)計結(jié)果表明,谷子根系與CK土壤中OTU數(shù)量在1 632～4 290之間,鑒定出126種AMF。根據(jù)試驗要求,對不同樣本繪制Venn圖,分為2組:正常澆水谷子(YG、AN、QH)與干旱處理谷子(dYG、dAN、dQH)。由圖2、圖3可知,CK與YG、AN、QH進(jìn)行聚類,共有OTUs 213個;CK與dYG、dAN、dQH進(jìn)行聚類,共有OTUs 154個。

2.3 谷子根際AMF群落α-多樣性分析

AMF的種類及豐度存在很大變異,通過檢測谷子樣品中AMF的豐富度和多樣性,可根據(jù)檢測結(jié)果計算得出Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)。由表2可知,CK樣品的Chao1指數(shù)為734.12,ACE指數(shù)為751.29;而谷子根際樣品的Chao1指數(shù)在218.50～489.12之間,ACE指數(shù)在222.18～498.00之間,表明CK樣品中AMF的豐富度與微生物群落多樣性最高。

表2 不同樣品中的AMF群落多樣性指數(shù)

2.4 各分類水平的AMF群落數(shù)統(tǒng)計

不同的分類學(xué)結(jié)果表明,在門水平上,所有樣品序列都?xì)w入球囊菌門;在綱水平上,所有樣品序列注釋到明確分類地位的有3個綱,分別為球囊菌綱、類球囊菌綱和原囊菌綱;在目分類水平上,所有樣品共注釋到明確地位的有4個目,分別為球囊霉目、類球囊霉目、原囊霉目和多樣孢囊霉目;在科分類水平上,注釋到明確分類地位的有7個科,分別為球囊霉科、類球囊霉科、雙型囊霉科、原囊霉科、巨孢囊霉科、近明球囊霉科和多樣孢囊霉科。由圖4可知,在屬分類水平上,從CK以及谷子根際土壤樣品中注釋到明確分類地位的共有9個屬,依次是球囊霉屬、類球囊霉屬、雙型囊霉屬、原囊霉屬、近明球囊霉屬、巨孢囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、多樣孢囊霉屬和隔球囊霉屬。其中,原囊霉屬在CK中占優(yōu)勢,類球囊霉屬在谷子根際樣品中占優(yōu)勢。

使用R軟件,對豐度較高的屬進(jìn)行聚類分析和繪制熱圖。由圖5可知,紅色為樣本中豐度較高的屬,綠色為豐度較低的屬。

2.5 谷子根際AMF群落β-多樣性分析

主成分分析(PCA)是基于歐氏距離評價樣本之間的相似度,以不同樣本中的AMF屬進(jìn)行作圖,得到PCA圖。由圖6可知,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)貢獻(xiàn)率分別為65.17%、23.85%,可較好地反映樣本間種群結(jié)構(gòu)差異的影響因素。

其中,○組代表單純土壤樣品,CK1、CK2距離較近,但與CK3距離較遠(yuǎn);□組代表正常澆水條件下的AN谷子根際樣品,AN1、AN3距離較近,但與AN2距離較遠(yuǎn);◇組代表正常澆水條件下的QH谷子根際樣品,QH1、QH3距離較近,但與QH2距離較遠(yuǎn);▽組代表正常澆水條件下的YG谷子根際樣品,YG1、YG2距離較近,但與YG3距離較遠(yuǎn);△組代表干旱條件下的AN谷子根際樣品,dAN1、dAN2、dAN3距離較近;+組代表干旱條件下的QH谷子根際樣品,dQH1、dQH2、dQH3距離較近;×組代表干旱條件下的YG谷子根際樣品,dYG1、dYG2、dYG3距離較近。由此可得出以下結(jié)論:第一,CK與谷子根際樣品能夠較好地分開,表明寄主有無是影響AMF群落結(jié)構(gòu)差異的主要因素;第二,同一谷子品種、不同處理以及同一處理、不同谷子品種并不能完全聚在一起,表明處理條件和品種類型是影響AMF群落結(jié)構(gòu)差異的次要因素。

2.6 AMF系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為直觀清晰地反映各分類單元在樣本中的豐度及進(jìn)化信息,利用軟件MEGAN構(gòu)建種群分類等級樹。由圖7可知,CK中AMF主要是原囊霉屬(Archaeospora)和巨孢囊霉屬(Gigaspora);YG中AMF主要是雙型囊霉屬(Ambispora);球囊霉屬(Glomus)和類球囊霉屬(Paraglomus)在所有樣品中均勻分布。

2.7 樣本AMF組成的差異分析

由表3可知,CK與谷子根際樣品相比,在屬水平上叢枝菌根存在顯著差異;干旱處理后,YG與QH品種根際叢枝菌根在屬水平上具有差異,AN品種根際叢枝菌根群落未發(fā)生顯著差異。由圖8可知,樣本組間最顯著的分類單元,分別為雙型囊霉屬、原囊霉屬、近明球囊霉屬、巨孢囊霉屬、球囊霉屬、類球囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、隔球囊霉屬。

表3 樣本間分類學(xué)組成的差異分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

植物與微生物之間的互利共生關(guān)系源于胞內(nèi)信號物質(zhì)的交換。植物根系通過釋放獨腳金內(nèi)酯(SLs)可誘導(dǎo)AMF產(chǎn)生分枝,并促進(jìn)菌絲在根部的定殖[11]。AMF的定殖依賴于特異信號的識別、傳導(dǎo)和交換,這個過程涉及植物根細(xì)胞將菌絲內(nèi)化,進(jìn)而AMF附著枝從根表面滲入至根內(nèi),將菌絲縱向蔓延在根系周圍形成叢枝[12-13]。

土壤作為一種復(fù)雜的基質(zhì)是植物賴以生存的場所[14],而根際是植物根系與土壤的交界面,是大量微生物的棲息地,微生物受益于植物根系的代謝產(chǎn)物[15]。AM是自然界分布較為廣泛而古老的一種共生菌[16],它的共生體現(xiàn)在營養(yǎng)物質(zhì)的交換,植物向它提供約20%的光合產(chǎn)物,反過來它幫助植物有效地吸收土壤中的礦質(zhì)元素及水分[17-18],它們的相互作用影響著植物的生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收及對脅迫的耐受性[19]。此外,土壤的組成及結(jié)構(gòu)對植物生理及根系分泌物也有調(diào)控作用,不同植物根系形態(tài)的不同、分泌物數(shù)量及種類的不同均會對植物根系表面的微生物產(chǎn)生選擇性,改變微生物群落組成[20]。

前期Tang等證明,YG與AN分別為抗旱性強與干旱敏感的谷子品種,QH介于兩者之間;干旱條件下,與YG相比,AN的生長顯著受到抑制;而在正常澆水條件下,AN的光合能力與生長狀況要好于YG[2]。影響植物的抗旱性因素很多,諸如基因型、環(huán)境及植物與微生物的共生互作等。為此,本研究選擇YG、AN和QH等3個抗旱性不同的材料,利用高通量測序技術(shù)對谷子根際叢枝菌根真菌群落進(jìn)行了研究。多樣性分析結(jié)果表明,CK與谷子根際叢枝菌根真菌多樣性指數(shù)及豐度指數(shù)存在顯著差異,宿主谷子的根際叢枝菌根真菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)均低于CK,特別是原囊霉屬、巨孢囊霉屬和隔球囊霉屬顯著減少,這表明宿主的生理代謝及根系分泌物在一定程度上影響了叢枝菌根真菌的分布特征。此外,無論正常澆水還是干旱條件下,這些指數(shù)在不同谷子品種之間存在普遍的相似性,并未表現(xiàn)出明顯的差異,只是少數(shù)菌屬在品種間表現(xiàn)出獨特性。這表明在干旱條件下,根系的生理代謝依然維持在較高的水平,與正常澆水條件下的群落特征基本一致。分析原因可能有3點:第一,在自然生態(tài)系統(tǒng)中,植物往往能與AMF形成互惠互利的關(guān)系,這種關(guān)系的形成有利于提高植物抵抗各種脅迫的能力,是依賴于植物根系的菌絲協(xié)助獲取礦質(zhì)營養(yǎng)及水分而實現(xiàn)的。與其他植物不同,谷子耐旱、耐貧瘠,水分利用率高,而根系是其重要基礎(chǔ)。因此,在干旱脅迫下,AMF依然保持種類多樣的特征,與谷子建立很好的共生。第二,研究表明不同生態(tài)型的土壤類型能強烈影響AMF的群落結(jié)構(gòu)及多樣性水平[4],本試驗土壤類型為基本農(nóng)田用地,土壤呈弱堿性,根據(jù)有機質(zhì)及氮磷鉀含量分級標(biāo)準(zhǔn)來看,營養(yǎng)狀況屬于中高級,較為適宜作物生長。谷子根際AMF是否受到土壤理化性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步探討。第三,干旱的設(shè)置,造成品種間AMF的相似是否受到干旱時間和程度的影響有待進(jìn)一步研究。Maestre等對除南極洲以外各大洲80個旱地的微生物多樣性進(jìn)行了全面分析,結(jié)果表明,隨著干旱程度的增加,土壤微生物的多樣性及豐度出現(xiàn)降低,這些結(jié)果主要是由于干旱對土壤有機碳含量造成的負(fù)面影響;干旱條件會改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),綠彎菌門和α-變形菌相對豐度增加,而酸桿菌門和疣微菌門的豐度減少,試驗結(jié)果與以往研究報道情況相反,土壤pH值不是影響細(xì)菌多樣性的主要因素,真菌群落以子囊菌為主[21]。然而,目前本研究結(jié)果表明,干旱條件下,谷子根系叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)及分布并未發(fā)生顯著變化,是否由于宿主與真菌互作的關(guān)系或谷子的抗旱性特征有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

由圖6、圖7可知,球囊霉屬和類球囊霉屬在所有樣本中分布較為均勻,表明這2個AMF屬受谷子根系分泌物影響較小;原囊霉屬和巨孢囊霉屬在谷子根際樣本中含量很低,明顯低于CK,表明這2個AM屬受谷子根系分泌物影響較大。

綜上所述,本研究對3個谷子品種(豫谷、沁黃、安陵)在正常生長與干旱條件下AMF的群落組成試驗中,發(fā)現(xiàn)干旱條件下,AMF群落組成及豐度并未發(fā)生顯著變化,與谷子本身耐旱有很大關(guān)系。在今后的研究中,應(yīng)當(dāng)從干旱程度及土壤選擇等因素分析對AMF群落的影響,以期發(fā)現(xiàn)谷子抗旱與AMF的關(guān)系。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索AMF的多樣性,選擇及鑒定合適的AMF菌種進(jìn)行定殖谷子奠定了基礎(chǔ)。