中藥活性成分對產ESBLs大腸埃希菌增敏效應研究

王威鋒，霍思懿，張 彤，翟天翔，孫嘉琪，宋巧兮，云巾宴

（吉林農業科技學院動物科技學院，吉林 132109）

我國養殖業為保證畜禽等經濟動物健康，大量使用抗菌藥物，而這種對抗菌藥物的過度與不規范使用，使我國成為世界上畜禽病原菌耐藥情況最為嚴重的國家之一。在此背景下，針對病原菌耐藥性的研究受到越來越多科研工作者的關注。超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）是一類能水解青霉素類、頭孢菌素類、單環酰胺類的β-內酰胺酶，能夠被克拉維酸、舒巴坦等β-內酰胺酶抑制劑所抑制的酶，被認為是臨床上重要的多耐藥菌[1-2]。實踐證實，新型抗菌藥物的更新革代導致β-內酰胺酶種類增多，尤其是產ESBLs的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌感染所導致發病率、死亡率增加以及治療感染的成本顯著提高，已成為臨床耐藥性細菌感染的主要問題之一，對畜禽乃至人類的健康構成了嚴重的威脅[3-4]。只依靠對藥物化學結構改造、研究和開發新型抗菌藥物等手段，往往很難從根本上解決細菌耐藥性的問題，只有從多方面開展飼料端“禁抗”，養殖端“限抗”，并以植物提取物“替抗”，才有可能為全面“飼料禁抗”做好準備，從而減少由于抗生素濫用造成的危害[5]。中藥作為人類文明的瑰寶，成分復雜，不易導致細菌產生耐藥突變，具有抗菌藥物不能比擬的優勢。研究表明，中藥對產ESBLs致病菌有一定的抑殺作用，且不易產生耐藥性，極具開發潛力[6-8]。因此，發掘具有抗耐藥活性的中藥是解決細菌耐藥性、防控產ESBLs致病菌感染問題的重要研究方向[9-10]。

本研究通過探索小檗堿、黃芩苷、沒食子酸、異甘草酸、原兒茶酸及丁香酚6種中藥活性成分對吉林地區豬源產ESBLs大腸埃希菌抑菌效果，并將候選提取物與常用抗菌藥物聯合應用，以觀察產ESBLs大腸埃希菌對抗菌藥物敏感性的變化，為吉林地區仔豬感染產ESBLs大腸埃希菌的治療、推動抗菌藥物的適量與規范使用及保障動物產品安全提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：產ESBLs大腸埃希菌分離自吉林市一病死豬，經分離鑒定后，保存于吉林省預防獸醫學重點實驗室/吉林農業科技學院藥理與病理實驗室。

供試試劑：中藥提取物小檗堿（A052）、黃芩苷（A0016）、沒食子酸（A0010）、原兒茶酸（A0617）、異甘草酸（A0463）、丁香酚（A0074）均購于河南奧科標準物質科技有限公司；抗菌藥物鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環素、頭孢西丁鈉、慶大霉素及安普霉素均購于杭州微生物試劑有限公司，執行標準WS/T125-1999；ESBLs顯色培養基購于法國科瑪嘉。

1.2 試驗方法

1.2.1 產ESBLs大腸埃希菌耐藥性測定 采用（K-B）藥敏紙片擴散法檢測產ESBLs大腸埃希菌對不同抗菌藥物的敏感程度。取保存菌液10 μL于10 mL LB液體培養基中37 ℃震蕩培養6 h，吸取100 μL均勻涂板于LB瓊脂培養基，3～5 min后用眼科鑷將藥敏紙片（頭孢曲松、青霉素、頭孢他啶、四環素、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、多西環素、磺胺異噁唑）貼于LB平板上，倒置并放入37 ℃恒溫培養箱17 h，測定抑菌環直徑，根據美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2017年標準，判斷其對抗菌藥物的耐藥性[11]。

1.2.2 中藥活性成分及常用抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌最小抑菌濃度（MIC）測定 采用倍比稀釋法，將小檗堿、黃芩苷、沒食子酸、原兒茶酸、異甘草酸及丁香酚6種中藥活性成分在96孔板中稀釋至終濃度為0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL，并依次在對應的孔中加入濃度為1.0×105 cfu/mL的菌懸液10 μL，每孔終體積為200 μL。其中第11孔為陽性對照，無藥物處理；第12孔為陰性對照，僅加入LB液體培養基。37 ℃培養16 h后用酶標儀檢測620 nm處吸光度，計算中藥活性成分的MIC[12]。

1.2.3 常用抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌MIC測定 采用二倍稀釋法，將鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環素、頭孢西丁鈉、慶大霉素、安普霉素8種抗菌藥物按其初始濃度倍比稀釋，操作步驟同1.2.2。

1.2.4 中藥活性成分聯合常用抗菌藥物抗菌效果 由于中藥有效成分的亞抑菌濃度對菌株沒有抑制或殺滅作用，因此可在亞抑菌濃度時探究中藥有效成分改變耐藥菌敏感性方面的效果。聯合傳代是以中藥有效成分的亞抑菌濃度（1/2MIC）聯合2倍MIC的抗菌藥物（鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環素、頭孢西丁鈉、慶大霉素、安普霉素）來觀察抗菌藥物MIC的變化過程。將1 mg/mL的中藥有效成分貯存液以亞抑菌濃度稀釋至96孔板中，隨后將抗菌藥物以2MIC二倍稀釋至96孔培養板中，加入1×105 cfu/mL菌液10 μL，37 ℃恒溫箱培養16 h，檢測620 nm處吸光度；在隨后的第二代及第三代培養過程中，抗菌藥物與中藥活性成分稀釋操作同上述一致，但第二代接種的菌液來自第一代培養液，第三代接種菌液來自第二代培養液。

2 結果與分析

2.1 產ESBLs大腸埃希菌耐藥性

由表1可知，選取10種不同類型抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌藥物敏感性進行鑒定，結果表明產ESBLs大腸埃希菌對慶大霉素介于耐藥與敏感之間，對另外9種抗菌藥物表現為耐藥，說明產ESBLs大腸埃希菌具有普遍耐藥性。

表1 產ESBLs大腸埃希菌藥物敏感性鑒定結果

2.2 中藥活性成分對產ESBLs大腸埃希菌的MIC

通過對中藥有效成分MIC測定可知，其對產ESBLs大腸埃希菌均有不同程度的抑菌效果，小檗堿、黃芩苷、沒食子酸及丁香酚抑菌效果較好，其中小檗堿在濃度為16 μg/mL時可完全殺菌，丁香酚在濃度為64 μg/mL時可完全殺菌，黃芩苷和沒食子酸的MIC為256 μg/mL，而原兒茶酸、異甘草酸抑菌效果較差，MIC高于512 μg/mL（見表2）。

表2 中藥活性成分對產ESBLs大腸埃希菌的MIC

2.3 常用抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的MIC

各種抗菌藥物的MIC如表3所示，選取8種抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌藥物的MIC進行測定，結果表明美羅培南抑菌效果最好，當其濃度達到5 μg/mL時可有效抑制細菌生長，安普霉素、多西環素、亞胺培南具有較強抗菌效果，8種抗菌物質均具有抗菌效果，慶大霉素抗菌效果最差。

表3 抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的MIC

2.4 中藥提取物亞抑菌濃度對產ESBLs大腸埃希菌增敏效應

通過對比不同作用時間和不同藥物濃度作用下耐藥菌株對抗菌藥物敏感性的變化，小檗堿和沒食子酸對產ESBLs大腸埃希菌的最佳逆轉條件如表4、表5所示。在小檗堿的亞抑菌濃度為8 μg/mL時，培養16 h可不同程度恢復產ESBLs大腸埃希菌對ENR、MMP、DOX、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP的敏感性提高百倍以上。亞抑菌濃度下的小檗堿與各個抗菌藥物聯合作用于耐藥大腸桿菌后，隨著傳代次數增加其增敏效應更加突出，其中MMP、GEN、APR的MIC分別達到0.02、1.25、0.0234 μg/mL。

表4 亞抑菌濃度的小檗堿對產ESBLs大腸埃希菌耐藥性的影響

表5 抑菌濃度的沒食子酸對產ESBLs大腸埃希菌耐藥性的影響

當沒食子酸的亞抑菌濃度為128 μg/mL時，培養16 h可不同程度恢復產ESBLs大腸埃希菌對ENR、MMP、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP對產ESBLs大腸埃希菌的敏感性提高百倍以上。亞抑菌濃度下沒食子酸在與各個抗菌藥物聯合作用于耐藥大腸桿菌后，隨著傳代次數增加其作用更加突出。

3 討 論

目前，中藥抗菌及降低其耐藥性的研究已經取得了一定程度的進展[13]。生物堿類藥物苦豆子堿對耐β-內酰胺酶的大腸埃希菌有較好的抑菌活性[14-15]。王月玲[16]研究表明硫酸黃連素對產ESBLs大腸埃希菌的抑菌效果較好，硫酸黃連素的MBC為32～128 mg/mL，且與頭孢他啶的聯合用藥表現為相加作用。帥麗華等[17]通過體外聯合抗菌試驗發現，黃連提取物和鹽酸小檗堿能明顯降低阿米卡星的MIC，進而提高阿米卡星的抗菌效果。呂世明等[18]研究表明苦參堿能抑制ESBLs活性，從而降低頭孢類抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的MIC。劉增援[19]從救必應中提取的總黃酮可明顯抑制大腸桿菌的生長，并且隨著濃度升高呈劑量依賴性的抑菌、殺菌作用，且與CRO、CAZ、CEF、CTX、AK、FFC等聯合作用后FICI均處于0～0.5，表現為協同作用。可通過破壞大腸桿菌細胞壁、細胞膜結構，抑制或消除大腸桿菌總蛋白合成而發揮作用。黃芩苷、槲皮素及木犀草素作為黃酮類化合物可顯著降低抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的MIC值，呈較好的抗菌特性。此外，石科[20]研究中連翹苷和白芍苷對大腸埃希菌均有明顯的體外抑菌效果，而白芍苷抑菌作用更強。呂世明等[18]研究表明，蘆薈大黃素、香紫蘇醇及大蒜素等中藥單體成分可通過降低頭孢類抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的MIC，進而協同抑制ESBLs活性，汪怡倩等[9]研究也證實了中藥對產ESBLs致病菌的抑殺作用，且極具開發潛力[21-22]。由此可見，很多中藥有效成分均具有較強的抗菌活性，而與抗菌藥物聯用，能減少藥物用量，發揮協同增效作用。

本研究比較6種中藥提取物聯合抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌的抑菌效果，小檗堿、黃芩苷、沒食子酸及丁香酚在亞抑菌濃度時與抗菌藥物聯用對產ESBLs大腸埃希菌進行傳代試驗表明，菌株的MIC隨著傳代次數的增加而降低，傳代三代后MMP、GEN、APR的MIC<2 μg/mL，其最小抑菌濃度降低200倍以上，產ESBLs大腸埃希菌在中藥活性成分亞抑菌濃度與抗菌藥物的聯合傳代培養中，未表現出耐藥程度升高，相反其耐藥程度在聯合傳代之后有所下降，表明亞抑菌濃度的中藥活性成分具有與抗菌藥物協同或相加的作用，亦可能存在亞抑菌濃度的中藥活性成分破壞或降低產ESBLs大腸埃希菌耐藥機制及耐藥性的作用，但其作用機制有待進一步探討。

抗菌藥物與亞抑菌濃度的小檗堿、沒食子酸聯合用藥，傳代培養耐藥菌株之后，其抑制作用均有所增強。聯合傳代之后，中藥有效成分小檗堿、沒食子酸可使抗菌藥物的耐藥菌株的敏感性提高百倍以上，表明中藥活性成分可能存在增強耐藥菌株對抗菌藥物敏感性的效應，但其具體的作用機制還不清楚，需進一步探討。綜上所述，小檗堿與沒食子酸在單獨及聯合抗菌藥物對產ESBLs大腸埃希菌均具有良好的抑制效果，可作為單獨及聯合用藥以抑制大腸耐藥菌株擴散與傳播的備選藥物。