混菌發酵對雪茄煙葉化學成分及香氣品質的影響

毛亞浩，張彤彤，余君，李道宇，陳雄，楊春雷，姚蘭

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

雪茄煙葉經采收晾制后無法直接用于雪茄的生產，必須經過發酵才能達到工業加工的需求，未經發酵的煙葉青雜氣重且刺激性較大，這是因為在雪茄煙葉內存在多種大分子物質，這些物質含量在燃燒過程中會產生大量難聞氣體，影響雪茄煙葉整體品質［1］。發酵是改善雪茄煙葉品質的重要環節，一般分為自然發酵和人工發酵，與自然發酵相比，人工發酵具有成本低、周期短的優點，雪茄煙葉發酵中常采用人工發酵的方法［2-4］。研究發現，在發酵過程中人工添加部分微生物可以減少煙葉內大分子物質含量，進而提高雪茄煙葉吸食品質，使煙葉口感更加協調［5］。

酵母菌是一類可以產生香氣物質的真菌，由于其產生香味物質種類繁多，常被用于食品行業［6-8］，Assi-clair等［9］研究結果表明，釀酒酵母發酵可可豆可以促進酯、醛、酮和吡嗪等香味物質的形成，使其具有強烈的果香和花香。近年來，部分研究結果表明混菌發酵相比于單菌發酵更有利于產品風味的形成［10］，Singracha等［11］使用嗜鹽四聯球菌、魯氏接合酵母和季也蒙畢赤酵母混合發酵制備醬油，結果表明，與對照相比，乙醇、2-甲基-1-丙醇和麥芽酚等揮發性風味化合物含量顯著提高；Xu等［12］研究發現，使用混合發酵劑（季也蒙畢赤酵母、畢赤酵母和舊金山乳桿菌）發酵面包可以增強其感官品質，促進2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、糠醛和乙酸等芳香化合物的形成。Hou等［13］研究表明，接種葡萄園有孢漢遜酵母P5 和釀酒酵母P1 發酵后的蘋果酒中2-苯基乙酸乙酯（玫瑰和蜂蜜香味）是對照的4.6倍，經感官分析發現混合發酵后的蘋果酒香味明顯改善。

酵母菌具有較強的產香能力，但將酵母菌應用于雪茄煙葉發酵中以提高雪茄煙葉香氣的報道較少。本研究以從雪茄煙葉表面篩選出來的一株纖維素降解菌C1 與5 種具有產香能力的酵母共同處理雪茄煙葉，探究復合微生物對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量以及品質的影響，同時也能為酵母菌在雪茄煙葉發酵中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉來源于湖北省十堰市丹江口市習家店煙草站CX-014 晾制結束的雪茄茄芯中部煙葉。

供試菌株C1 篩選自雪茄煙葉表面；庫德畢赤酵母、費比恩酵母、漢遜酵母、Starmerella bacillaris、拜爾接合酵母均使用由本實驗室保藏的菌株。

纖維素產酶培養基：蛋白棟10 g，酵母粉10 g，CMC-Na 10 g，NaCl 5 g，KH2P041 g，去離子水1 000 mL，pH 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD 培養基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發酵方法 參考覃明娟等［14］的方法并修改，供試煙葉回潮至適當水分后切成煙絲，將培養至對數生長后期的菌株C1 與4.5‰葡萄糖、2.25‰谷氨酸混合后，加入無菌水充分溶解制成接種液，將接種液均勻噴灑在煙絲上，平衡水分后，保持煙葉水分為30%，然后放入37 ℃恒溫恒濕培養箱中進行發酵，發酵6 d 后接種酵母菌，30 ℃繼續發酵6 d，其中菌株C1 的單菌發酵條件為單獨接入菌株C1 和上述濃度的葡萄糖、谷氨酸37℃發酵6 d，酵母菌單菌發酵條件為單獨接種酵母菌30 ℃發酵6 d，發酵結束后，40 ℃烘干制樣。

1.2.2 發酵方案 由于在試驗過程中發現菌株C1與酵母菌同時發酵雪茄煙葉過程中無法共同生長，因此采用分段發酵的方法進行雪茄煙葉的發酵，試驗方案設計見表1。

表1 試驗方案設計

1.2.3 煙葉主要化學成分測定 參照Yao等［15］的方法進行測定，取烘干后的煙葉粉末0.25 g，加入25 mL萃取液（1%乙酸，2%乙醇）震蕩1 h后，使用連續流動分析儀對過濾后的上清液進行化學成分測定。

1.2.4 同時蒸餾萃取（SDE）煙草揮發性香氣物質 將煙葉去除主脈，烘干粉碎過篩后，準確稱取10.0 g，放入1 000 mL 圓底燒瓶中，并加入200 mL 飽和食鹽水；稱取60 mL 二氯甲烷于100 mL 圓底燒瓶中，分別連接在SDE 裝置兩側。有機相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加熱，水相使用160 ℃油浴加熱。待水相和有機相達到液液分層后，繼續反應5 h，收集有機相萃取液，同時使用旋轉蒸發儀將萃取液濃縮至2 mL，加入50 μL 1.202 8 mg/mL 乙酸苯乙酯作為內標。干燥后，使用0.22 μm 微孔有機濾膜過濾后裝入Agilent進樣瓶中。

1.2.5 GC/MS 條件 氣相色譜：Agilent Techologies 7890A；色譜柱：HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量：1 μL；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；分流比：10∶1；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；質 譜：Agilent Techologies 5975C；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；電離方式EI：70 eV。

1.3 數據處理

所有試驗均設置3 個平行，采用Origin 2019 作圖、Excel進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中雪茄煙葉主要化學成分的變化

煙葉主要化學成分是影響雪茄煙品質的重要指標，決定了煙葉吸食的協調性［16］。雪茄煙發酵過程中主要化學成分變化如圖1 至圖4 所示。由圖1 可以看出，在雪茄煙葉發酵過程中，還原糖含量總體呈下降趨勢，但還原糖降低速率有較大差異，說明在雪茄煙葉發酵過程中微生物利用還原糖作為碳源進行生長發育。其中在單菌發酵方案中，雪茄煙葉發酵結束后還原糖含量在0.28%～0.32%，而在混合發酵方案中，其還原糖含量在0.21%～0.26%，這可能是由于接種微生物種類不同，其在雪茄煙葉固態發酵過程中的生長情況不同所致。圖2 是發酵過程中雪茄煙葉總糖含量的變化趨勢，可以看出在發酵過程中總糖含量變化趨勢與還原糖基本一致，其中單菌方案中，發酵結束雪茄煙葉總糖含量在0.70%～0.83%，而混合方案總糖含量在0.60%左右。

圖1 雪茄煙葉發酵過程中還原糖含量的變化

圖2 雪茄煙葉發酵過程中總糖含量的變化

煙堿是雪茄煙中重要的植物堿，煙堿含量決定了煙葉的勁頭，也是煙葉中主要有害物質之一［17］。圖3 和圖4 分別是雪茄煙葉發酵過程中煙堿和總氮含量的變化曲線圖，可以看出在雪茄煙葉發酵過程中煙堿和總氮含量基本保持不變，其中煙堿含量為5.24%～5.71%，而總氮含量為2.71%～3.20%，這與張銳新等［18］的研究結果一致。

圖3 雪茄煙葉發酵過程中煙堿含量的變化

圖4 雪茄煙葉發酵過程中總氮含量的變化

2.2 雪茄煙葉中揮發性中性香氣物質的變化

對不同方案發酵過程中雪茄煙葉揮發性中性香氣成分進行測定，共發現23 種香氣物質，可分為5類：美拉德反應產物、苯丙氨酸轉化產物、類胡蘿卜素轉化產物、西柏烷類轉化產物以及其他香氣物質［19］。由表2 和表3 可以看出，單菌發酵方案中，菌株C1 和費比恩酵母發酵后的雪茄煙葉總香氣含量較高，分別為638.17 μg/g 和606.53 μg/g。混菌發酵后，雪茄煙葉香氣物質含量顯著提高，其中菌株C1和漢遜酵母共同處理后的雪茄煙葉總香氣物質含量最高為998.09 μg/g，與單菌發酵中香氣物質含量最高的方案相比提高了56.4%。試驗結果表明，雪茄煙葉在經過菌株C1 處理后再經過庫德畢赤酵母、漢遜酵母、費比恩酵母和Starmerella bacillaris繼續發酵可以有效提高雪茄煙葉揮發性香氣物質含量，從而進一步提高雪茄煙葉品質。

新植二烯是雪茄煙葉中含量最高的揮發性香氣物質，新植二烯在雪茄煙葉燃燒時可以攜帶其他香氣物質進入煙氣，是煙葉的重要增香劑［19］。在單菌發酵方案中，新植二烯含量最高為471.19 μg/g，而在混菌階段發酵方案中，除拜耳接合酵母外，其余4 種酵母菌與菌株C1 共同發酵后的雪茄煙葉新植二烯含量均明顯高于單菌階段發酵，其中菌株C1 和漢遜酵母共同發酵后的雪茄煙葉中新植二烯含量高達755.38 μg/g。

雪茄煙葉發酵過程中美拉德反應產物主要有糠醛、糠醇等呋喃類物質［20］，由表2、表3 可知，單酵母發酵方案中，拜耳接合酵母處理后的雪茄煙葉美拉德反應產物含量最高為4.17 μg/g，而混菌發酵后的雪茄煙葉美拉德反應產物含量明顯提高。其中方案10 即菌株C1和Starmerella bacillaris共同發酵后的雪茄煙葉中美拉德反應產物含量最高為15.39 μg/g，約是未經菌株C1 處理組的4 倍。在菌株C1 分別與庫德畢赤酵母和拜耳接合酵母混合發酵的雪茄煙葉中糠醇含量較高分別為7.22 μg/g 和7.78 μg/g，約是單酵母發酵煙葉中的5倍，約是單菌株C1 發酵的1.4倍。單菌發酵方案中，菌株C1 發酵后的煙葉中美拉德反應產物含量最高，除漢遜酵母外，其余酵母菌方案的雪茄煙葉無明顯差異；而混菌方案中，除菌株C1 和費比恩酵母處理后煙葉美拉德反應產物較低，其余組合差異較小。這些差異可能與美拉德反應產物的形成有關，美拉德反應產物是由還原糖和氨基酸在一定溫度下發生的［21］，而菌株C1 在雪茄煙發酵過程中可以產生纖維素酶，使部分纖維素轉化為還原糖更有利于美拉德反應進行。

苯丙氨酸轉化產物是雪茄煙重要的香氣成分，其中苯乙醇、苯甲醇等具有強烈的花香，可以顯著提高雪茄煙的風味［20］。分析發現，經菌株C1、菌株C1與漢遜酵母以及菌株C1與Starmerella bacillaris共同發酵后的雪茄煙葉苯丙氨酸轉化產物含量較高，在36.25～43.69 μg/g，是其余方案的2 倍左右。經過復合微生物發酵的煙葉與單菌相比苯甲醇、苯乙醇含量明顯提高，這對提高雪茄煙風味有重要作用。值得注意的是在單菌發酵后的雪茄煙葉中都檢測到苯乙醛的存在，而在混菌發酵后苯乙醛基本消失，推測可能是由于添加復合微生物導致雪茄煙表面微生物組成發生變化，促進苯乙醛脫氫轉化為苯乙醇所致［22］。另外經漢遜酵母和費比恩酵母發酵過的雪茄煙葉苯甲醇含量均明顯提高，說明這兩種酵母更有利于苯甲醇的合成。

類胡蘿卜素轉化產物是煙葉中除新植二烯外含量最高的香氣物質種類，由表2、表3 可以看出，單酵母菌發酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉化產物含量差異不大，含量在38.40～45.00 μg/g，說明酵母菌對類胡蘿卜素轉化作用不顯著。除庫德畢赤酵母外，經過菌株C1 和其余酵母菌發酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉化產物含量均明顯提高，其中菌株C1 與漢遜酵母共同發酵后的煙葉中類胡蘿卜素轉化產物含量最高為80.85 μg/g，約是單酵母發酵的2 倍。與單酵母發酵相比，經過菌株C1 發酵后的煙葉中大馬士酮、巨豆三烯酮A 以及巨豆三烯酮B 含量均明顯提高。推測可能是由于菌株C1 在發酵過程中可以產生CCD1、CCD4 等類胡蘿卜素裂解雙加氧酶從而促進類胡蘿卜素的降解轉化［23］。西柏烷類轉化產物主要是茄酮，研究結果發現，各方案中茄酮含量變化不明顯，均在20 μg/g 左右。

表2 單菌發酵揮發性中性香氣物質含量（單位：μg/g）

表3 混菌發酵揮發性中性香氣物質含量（單位：μg/g）

產香酵母在煙葉上的應用報道較少，近年來有部分學者將產香酵母應用到煙葉發酵中，得到了較好的效果。胡志忠等［24］利用產香酵母發酵煙葉后發現煙葉中新增多種致香物質，且新植二烯含量與對照相比增加了78.07 μg/g。郭林青等［25］研究結果表明，漢遜酵母發酵煙沫后其醇類物質含量明顯增加，與對照相比其發酵液香味明顯改善。帥瑤等［26］、薛磊等［27］研究發現復合微生物對煙葉發酵后，煙葉中β-大馬酮等多種香氣物質含量增加，煙氣細膩度改善，香氣質和香氣量均有增加，雜氣減輕顯著，煙葉質量明顯改善，這與本研究結果一致。

3 結論

本研究使用階段發酵的方法處理雪茄煙葉，通過利用菌株C1 對煙葉纖維素的降解作用以及酵母的產香能力對雪茄煙葉進行發酵，結果發現，單酵母發酵方案中費比恩酵母發酵后的雪茄煙葉香氣物質總量最高為606.53 μg/g，其余酵母無明顯差異，均在500 μg/g 左右。而經過菌株C1 與酵母菌株混菌發酵后的雪茄煙葉與單菌發酵相比香氣物質總量明顯提高，其中以菌株C1 和漢遜酵母混菌發酵后的雪茄煙葉效果最顯著，香氣物質總量達到998.09 μg/g，為費比恩單菌發酵的1.6 倍。

經復合微生物混菌發酵后的雪茄煙葉揮發性香氣物質種類沒有變化，但含量顯著提高，其中漢遜酵母和費比恩酵母處理后的雪茄煙葉苯甲醇含量明顯高于其他處理組，菌株C1 更有利于美拉德反應產物以及苯丙氨酸轉化產物的形成。