橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷大鼠炎癥反應及AMPK/SIRT1通路的影響

薛涵予， 王澤秀， 張曉麗

（1.普洱市中醫醫院肺系病科，云南普洱 665000；2.云南省中醫醫院肺病科，云南昆明 650000）

膿毒癥是由宿主對感染的反應失調所導致的危及生命的器官功能障礙[1-2]。在膿毒癥中，炎性細胞被激活并釋放大量炎性介質，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-1和氧自由基等，可導致組織和機體器官的嚴重損傷[3-4]。急性肺損傷是膿毒癥的主要并發癥之一，是以呼吸衰竭、肺泡-毛細血管膜屏障、肺水腫和免疫/炎癥反應為特征的毀滅性疾病[5]。抑制炎癥反應可以減輕膿毒癥急性肺損傷并提高膿毒癥的存活率[6-7]。

橙花叔醇（3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇，nerolidol，NRD）是一種脂肪族倍半萜醇，存在于生姜、香茅、檸檬草、玫瑰和茶樹等精油中[8]，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌作用[9-12]。既往有研究報道，橙花叔醇可通過調節抗氧化酶和單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/核因子E2 相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶1（HO-1）通路抑制脂多糖（LPS）誘導的急性肺損傷過程中的炎癥反應[13]。為進一步探討橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷的治療作用及機制，本研究構建膿毒癥急性肺損傷大鼠模型，觀察橙花叔醇對其炎癥反應的影響。研究發現，AMPK 是參與能量代謝調節的關鍵激酶，AMPK 通過激活下游效應分子在急性肺損傷中發揮保護作用[14]。SIRT1（Sirtuin1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性組蛋白脫乙酰酶，具有抗炎和抗凋亡作用[15]，AMPK 具有SIRT1依賴性的抗炎活性。基于此，本研究觀察橙花叔醇是否通過介導AMPK/SIRT1通路對膿毒癥急性肺損傷發揮保護作用。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取36 只SPF 級健康12 月齡雄性SD 大鼠，體質量300 ～350 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2022-0004，使用許可證號：SYXK（滬）2022-0012。

1.2 藥物、試劑與儀器橙花叔醇（分子式：C15H26O，分子量：222.37，純度：98%）（美國Santa Cruz 公司）。LPS（美國Sigma-Aldrich 公司）；AMPK 抑 制 劑Dorsomorphin（美 國R&D Systems 公司）；蘇木素-伊紅（HE）染液（上海Beyotime 公司）；白細胞介素（IL）-1β、IL-10 和腫瘤壞死因子（TNF）-α（美國R&D Systems 公司）； 兔抗磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體、兔抗SIRT1 抗體、兔抗GAPDH 抗體（美國Santa Cruz 公司）。BioSystem XA全身體積描記肺功能檢測儀（WBP，美國DSI 公司）；血細胞計數器（上海契景公司）；Eclipse Ci顯微鏡（日本Nikon 公司）；Infinite F50 酶標儀（瑞士Tecan 公司）。

1.3 分組、造模與給藥將36 只大鼠隨機分為6 組，分 別 為Sham 組、LPS 組、LPS+DMSO 組、LPS+NRD 組、LPS+NRD+DMSO 組、LPS+NRD+Dors組，每組6只。

腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對大鼠進行麻醉后，背部臥床固定，分離右股靜脈，對股靜脈進行導管注射[16]。

動物處理具體方法如下。Sham 組：假手術組，股靜脈注射8 mg/kg 磷酸鹽緩沖液（PBS）；LPS 組：通過股靜脈注射LPS 8 mg/kg建立膿毒癥急性肺損傷模型；LPS+NRD 組：橙花叔醇預處理組，在LPS注射前30 min 尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg[16]；LPS+DMSO 組：橙花叔醇預處理陰性對照組，在LPS注射前30 min尾靜脈注射5 mg/kg DMSO；LPS+NRD+DMSO 組：尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg DMSO，然后股靜脈注射LPS 8 mg/kg；LPS+NRD+Dors 組：尾靜脈注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg AMPK 抑制劑Dorsomorphin[16]，然后股靜脈注射LPS 8 mg/kg。

所有大鼠在LPS誘導24 h后用過量的戊巴比妥鈉800 mg/kg 安樂死，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 肺功能檢測 LPS 誘導后12 h 后，使用50 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，使用全身體積描記肺功能檢測儀（WBP）進行檢查。WBP 由一個壓力傳感器（MAX1320，Buxco Electronics，Sharon，CT）相互連接的參考室和動物室組成。根據Buxco肺部操作協議[17-18]，測定大鼠用力呼出25% ～75%肺活量時的呼氣流量（FEF25%-75%）和20 毫秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV20/FVC）比值。

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）收集和細胞計數 將大鼠處死后，使用0.5 mL 無菌PBS 進行支氣管肺泡灌洗3 次（總體積＝1.5 mL），得到BALF。然后，使用血細胞計數器進行總白細胞計數和中性粒細胞計數。

1.4.3 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學形態 將大鼠肺組織樣本用10%福爾馬林溶液固定，包埋在石蠟中，然后切成3 ～4 μm切片。切片先后在二甲苯和乙醇中脫水。然后進行HE 染色。通過顯微鏡觀察圖像，并在成像系統（Digital Sight DS-FI2，Nikon，日本）上采集圖像。采用Smith 評分法[19]評估肺損傷程度，肺泡和間質炎癥、水腫，肺泡和間質出血、壞死，肺不張和透明膜形成均按照0 ～4 分制評分：無損傷，計0 分；損傷小于25%，計1 分；損傷25%～50%，計2 分；損傷50%～75%，計3分；損傷大于75%，計4分。

1.4.4 酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測BALF 中IL-1β、IL-10和TNF-α的水平 按照IL-1β、IL-10和TNF-α 試劑盒說明書操作，最后應用酶標儀在450 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.4.5 Western Blot 法檢測肺組織p-AMPK、SIRT1 蛋白表達水平 將肺組織均質化后，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。將等量的蛋白質（40 mg）加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上，轉移到尼龍膜上，分別與第一抗體兔抗p-AMPK、SIRT1、GAPDH（均按體積比1∶1 000 稀釋）。然后，將膜與第二抗體辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 一起在室溫下孵育1 h。通過化學發光法顯色、曝光，最后應用AlphaEase 軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內參。

1.5 統計方法采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，GraphPad Prism 8.0 軟件進行圖片制作。所有數據均以均數± 標準差（±s）表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），事后檢驗均采用Tukey’s 多重比較法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 橙花叔醇改善LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織及肺功能LPS組和LPS+DMSO 組大鼠肺組織可見中性粒細胞浸潤、肺泡壁增厚、出血和透明膜形成，LPS+NRD 組肺組織病理表現較LPS+DMSO 組好轉。見圖1-A。表明LPS 誘導膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織出現明顯炎性損傷，而橙花叔醇（NRD）預處理可減輕LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織病理損傷。

圖1 橙花叔醇（NRD）對脂多糖（LPS）誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織及肺功能的影響Figure 1 Effects of nerolidol on lung tissue and lung function in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

Smith 評分結果顯示：與Sham 組比較，LPS 組肺組織損傷評分增加（P＜0.001）；與LPS+DMSO組比較，LPS+NRD 組肺組織損傷評分減少（P＜0.01）。見圖1-A。表明橙花叔醇可明顯減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織損傷程度。

與Sham組比較，LPS組大鼠FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值顯著下降（P＜0.01）；與LPS+DMSO 組比較，LPS+NRD 組FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值升高（P＜0.01）。見圖1-B、圖1-C。表明橙花叔醇能部分逆轉膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能的下降。

2.2 橙花叔醇抑制LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥反應對BALF 中炎癥細胞進行計數和分類，結果顯示：與Sham 組比較，LPS 組和LPS+DMSO 組大鼠BALF 中總白細胞數、中性粒細胞數均顯著增加（P＜0.01 或P＜0.001）；與LPS+DMSO 組比較，LPS+NRD 組大鼠BALF 中總白細胞數、中性粒細胞數均顯著減少（均P＜0.01）。見圖2-A。橙花叔醇可顯著降低膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF白細胞及中性粒細胞水平。

圖2 橙花叔醇（NRD）對脂多糖（LPS）誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥反應的影響Figure 2 Effect of nerolidol on the inflammatory response of BALF in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

TNF-α、IL-1β 和IL-10 為炎癥相關因子[20]。ELISA 檢測結果顯示：與Sham 組比較，LPS 組和LPS+DMSO 組大鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平顯著上升，IL-10 水平顯著下降（均P＜0.01）；與LPS+DMSO 組 比 較，LPS+NRD 組 大 鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平顯著下降，IL-10 水平顯著上升（均P＜0.01）。見圖2-B。表明橙花叔醇可調節膿毒癥急性肺損傷大鼠BALF炎癥因子的釋放。

2.3 橙花叔醇通過激活AMPK/SIRT1通路減輕LPS誘導的大鼠膿毒癥急性肺損傷通過Western Blot 法觀察LPS 誘導膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織勻漿中AMPK/SIRT1 通路相關蛋白表達結果顯示，與Sham組比較，LPS組肺組織p-AMPK與SIRT1蛋白表達水平均顯著降低（均P＜0.01）。見圖3。結果表明，LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK/SIRT1通路被抑制。

圖3 脂多糖（LPS）誘導對大鼠肺組織AMPK/SIRT1通路相關蛋白表達的影響Figure 3 Effect of LPS induction on AMPK/SIRT1 pathway-related protein expression in rat lung tissue

為了確定橙花叔醇是否通過激活AMPK 發揮抗炎作用，在使用橙花叔醇治療大鼠膿毒癥急性肺損傷的同時使用AMPK 抑制劑（Dorsomorphin，Dors）來抑制AMPK 磷酸化。結果顯示：與LPS+NRD+DMSO 組比較，LPS+NRD+Dors 組肺組織p-AMPK 及SIRT1 蛋白表達水平下降（P＜0.01）。見圖4-A。提示Dors 成功抑制了橙花叔醇對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK 磷酸化及SIRT1蛋白表達的促進作用。且在Dors 的應用下，橙花叔醇減輕的大鼠肺組織病理及功能損傷被逆轉，表現在肺損傷嚴重，FEF25%-75%和FEV20/FVC 水平均顯著下降（見圖4-B ～D）。此外，AMPK 抑制劑Dors顯著升高橙花叔醇干預的BALF中炎癥細胞數量及炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平，顯著降低抗炎癥因子IL-10 水平（均P＜0.01，見圖4-E、圖4-F）。上述結果表明，橙花叔醇可通過激活AMPK/SIRT1通路保護膿毒癥急性肺損傷大鼠。

圖4 橙花叔醇（NRD）通過激活AMPK/SIRT1通路對大鼠膿毒癥急性肺損傷的影響Figure 4 Effect of nerolidol on sepsis-induced acute lung injury in rats through activation of AMPK/SIRT1 pathway

3 討論

炎癥被認為是對感染或損傷的主要反應。然而，炎癥不受控制的延長可導致組織損傷[21-22]。LPS 是急性肺損傷發生的常見內毒素[23]。研究[24-25]發現，LPS 可以顯著上調中性粒細胞和單核白細胞的積累、上調炎性因子的表達水平。炎癥浸潤是急性肺損傷的關鍵因素，它導致肺功能進行性惡化[26]。白細胞，尤其是中性粒細胞，是急性肺損傷發病機制的“罪魁禍首”。LPS 誘導后，來自肺泡巨噬細胞和肺細胞的促炎介質會刺激外周循環中的中性粒細胞活化[27]。中性粒細胞的遷移、呼吸爆發和脫粒對先天免疫系統至關重要[28]。本研究結果顯示，LPS誘導膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能、肺組織明顯受損，炎性細胞浸潤明顯，且BALF 中中性粒細胞和單核白細胞募集，且伴隨BALF 中TNF-α、IL-1β表達的顯著升高，抗炎性因子IL-10水平的顯著降低。橙花叔醇可抗炎[29]。給予橙花叔醇預防干預后，橙花叔醇可減輕LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織病理損害及肺功能損傷，降低BALF 中總白細胞數、中性粒細胞數及炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水 平，提高BALF 中IL-10水平，上調肺組織p-AMPK、SIRT1 蛋白表達水平。表明橙花叔醇可減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠炎癥反應。

AMPK 是一種廣泛存在于真核生物中的能量敏感性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對于調節能量代謝和線粒體生物發生以應對能量剝奪至關重要[14]；SIRT1 是一種NAD+依賴性組蛋白脫乙酰酶，是參與細胞能量平衡的代謝酶[15]。既往研究表明，AMPK的敲低明顯加重了LPS 誘導的小鼠膿毒癥急性肺損傷[30-31]。本研究結果顯示，LPS 誘導的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK/SIRT1 通路被抑制，而橙花叔醇促進了膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織AMPK 的磷酸化并上調了SIRT1的表達。為驗證橙花叔醇是否通過介導AMPK/SIRT1通路對膿毒癥急性肺損傷產生治療作用，本研究在同時添加AMPK 抑制劑的條件下使用橙花叔醇預處理模型大鼠，發現橙花叔醇減輕肺損傷的效應被部分逆轉，表明橙花叔醇通過激活AMPK/SIRT1通路修護大鼠膿毒癥急性肺損傷。

綜上所述，橙花叔醇可通過介導AMPK/SIRT1通路及抑制炎癥反應對膿毒癥急性肺損傷大鼠發揮治療作用。