消渴丸對2型糖尿病db/db小鼠降壓降脂的拆方研究

黨蕾， 寧娜， 黃秋凌， 陳健釗， 劉珊珊

（1.廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510530；2.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，廣東廣州 510240）

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝綜合征，患者常伴有高血壓、血脂紊亂[1]，且這些代謝因素相互影響[1-2]。因此，在糖尿病日常防治管理中，不僅需要控制血糖，亦要重點(diǎn)關(guān)注血壓、血脂等指標(biāo)的變化。消渴丸是由中藥復(fù)方與格列本脲組成的中西藥復(fù)方制劑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，消渴丸不僅調(diào)控血糖，還顯現(xiàn)降壓、降脂的作用[3-5]。但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究通過拆方方法，觀察消渴丸、消渴丸純中藥部分和格列本脲對2型糖尿病db/db小鼠血壓、血脂的作用，以進(jìn)一步明確其降壓降脂療效及作用機(jī)制，為臨床穩(wěn)定2型糖尿病患者血糖的同時，對調(diào)控其血壓血脂提供臨床應(yīng)用依據(jù)，從而為2型糖尿病的治療提供綜合策略，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物小鼠種系背景BKM 小鼠[包括：SPF 級自發(fā)性2 型糖尿病小鼠（db/db）100 只，7 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量30.9 ～41.7 g； SPF 級野生型wt/wt 小鼠20 只，7 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量14.2～22.4 g]，購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，生產(chǎn)許可證號： SCXK（蘇）2015-0001。實(shí)驗(yàn)單位為廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0003。本研究所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心小鼠倫理委員會批準(zhǔn)（批號：IA-PD2018008-01）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物消渴丸（每丸2.5 g，含格列本脲2.5 mg），由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號：YF0011；消渴丸純中藥，由廣州白云山中一藥業(yè)有限公司提供，生產(chǎn)批號：Y01461；格列本脲片，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：1709009。消渴丸的制備方法：葛根265 g、地黃159 g、黃芪53 g、天花粉265 g、玉米須265 g、南五味子53 g、山藥26.5 g 和格列本脲0.25 g，將葛根、地黃、玉米須、天花粉加水煎煮、濾過，濾液濃縮，黃芪、南五味子、山藥粉碎成細(xì)粉，與上述部分濃縮液拌勻，干燥，粉碎，過篩，混勻，用剩余濃縮液制丸，干燥，加入格列本脲，用黑氧化鐵和滑石粉的糊精液包衣，制成1 000 丸。用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液分別配制消渴丸至50、200 mg/mL 兩種濃度，消渴丸純中藥配至200 mg/mL，格列本脲配至0.2 mg/mL，每只動物給藥容積為20 mL/kg。

1.3 主要試劑與儀器CMC-Na，天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：20 150806；戊巴比妥鈉，美國Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號：P3761；小鼠胰島素、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定試劑盒均由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供。BP-98A 血壓計，生產(chǎn)廠家為日本軟隆公司；GT-1640 型血糖儀，生產(chǎn)廠家為日本京都公司；7100型全自動生化分析儀，生產(chǎn)廠家為日本日立公司；電子天平：BS224S，TE601-L，BP2100，BL3100，BP3100S，生產(chǎn)廠家均為賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Micro CL17 離心機(jī)，生產(chǎn)廠家為賽默飛世爾科技有限公司；ELx800 酶標(biāo)儀，生產(chǎn)廠家為美國BioTek公司。

1.4 動物模型選擇db/db 小鼠是Leptin 受體點(diǎn)突變的2 型糖尿病小鼠，為常用的2 型糖尿病研究實(shí)驗(yàn)小鼠模型之一，其出生后6周即可出現(xiàn)明顯的肥胖和高血糖等糖尿病癥狀，8 ～12 周時最為明顯，并可出現(xiàn)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥[6]。與誘發(fā)性糖尿病小鼠模型比較，db/db 小鼠不存在人為誘導(dǎo)因素的干擾，糖尿病的產(chǎn)生更接近臨床患者發(fā)病情況，模型成功率和穩(wěn)定性高，故采用db/db 小鼠作為本課題2型糖尿病模型。100只db/db小鼠與20只同窩同齡野生型wt/wt 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食6 h，尾靜脈穿刺采血，以空腹血糖＞11.1 mmol/L 判定2型糖尿病小鼠模型制備成功。

1.5 分組與給藥將判定成功的2 型糖尿病db/db小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組，消渴丸低、高劑量組，消渴丸純中藥組和格列本脲組共5組，每組20只。同時，將20只wt/wt小鼠設(shè)為正常組。

每日早上8∶30 時，消渴丸低、高劑量組分別給予消渴丸混懸液1.0、4.0 g/kg（參照人和動物按體表面積折算的等效劑量比值[7]換算，下同，小鼠給藥劑量對應(yīng)為臨床服用劑量折算動物等效劑量的1 倍和4 倍）灌胃；消渴丸純中藥組給予消渴丸純中藥混懸液3.996 g/kg 灌胃；格列本脲組給予格列本脲混懸液4.0 mg/kg 灌胃；正常組和模型組以動物給藥容積為20 mL/kg 灌胃給予溶媒0.5%CMC-Na溶液。每日1次，連續(xù)4周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 血壓測定 給藥前、給藥第4 周，在小鼠清醒狀態(tài)下，采用BP-98A 血壓計測定收縮壓和舒張壓，連續(xù)測量3 次，取其平均值即為此次測量值。

1.6.2 空腹血糖的測定 給藥前、給藥第4 周，禁食6 h 后，通過尾靜脈穿刺采血，分離血清，應(yīng)用GT-1640型血糖儀檢測空腹血糖水平。

1.6.3 空腹胰島素的測定 給藥前、給藥第4周，禁食6 h 后，通過尾靜脈穿刺采血，分離血清，采用ELISA 法按照試劑盒說明書檢測空腹胰島素。

1.6.4 血脂的測定 給藥前、給藥第4 周，禁食6 h 后，通過尾靜脈穿刺采血，分離血清，采用7100 型全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量。

1.6.5 血清血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）的測定 在給藥第4周，禁食6 h后，用3%戊巴比妥鈉按2 mL/kg劑量腹腔注射麻醉小鼠，腹主動脈采血，分離血清，迅速取肝臟，采用ELISA 法按照試劑盒說明書檢測血清AngⅡ含量和肝組織PPARα 的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，以LSD 法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消渴丸對2型糖尿病db/db小鼠收縮壓和舒張壓的影響表1 結(jié)果顯示：治療前、給藥4 周后、治療前后，各組間舒張壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血壓比較Table 1 Comparison of blood pressure among various groups of mice（±s，mmHg）

表1 各組小鼠血壓比較Table 1 Comparison of blood pressure among various groups of mice（±s，mmHg）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

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給藥前，與正常組比較，模型組收縮壓顯著升高（P＜0.05）；模型組和各給藥組之間收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥4 周后，與正常組比較，模型組收縮壓顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，消渴丸低、高劑量組和消渴丸純中藥組收縮壓顯著下降（P＜0.05），而格列本脲組收縮壓無明顯變化（P＞0.05）。

2.2 消渴丸對2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖的影響表2結(jié)果顯示：給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組空腹血糖顯著升高（P＜0.01）；模型組和各給藥組之間空腹血糖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠空腹血糖值比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose among various group of mice（±s，mmol·L-1）

表2 各組小鼠空腹血糖值比較Table 2 Comparison of fasting blood glucose among various group of mice（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較；④P＜0.05，與格列本脲組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與同組給藥前比較

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給藥4周后，與正常組比較，模型組和各給藥組空腹血糖顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組空腹血糖均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高劑量組和格列本脲組降低作用更明顯；各給藥組間兩兩比較，消渴丸純中藥組空腹血糖高于格列本脲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

消渴丸高劑量組和格列本脲組給藥4周后空腹血糖與治療前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；消渴丸低劑量組和消渴丸純中藥組空腹血糖高于治療前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 消渴丸對2型糖尿病db/db小鼠血清空腹胰島素和HOMA-IR 的影響表3 結(jié)果顯示：給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組胰島素水平顯著降低（P＜0.01），HOMA-IR 顯著升高（P＜0.05）；模型組和各給藥組之間胰島素水平、HOMA-IR 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠血清空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）比較Table 3 Comparison of serum insulin and insulin resistance index（HOMA-IR）among various group of mice（±s）

表3 各組小鼠血清空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）比較Table 3 Comparison of serum insulin and insulin resistance index（HOMA-IR）among various group of mice（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，與模型組比較；④P＜0.05，與同組給藥前比較

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給藥4周后，與正常組比較，模型組和各給藥組胰島素水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），HOMA-IR顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，消渴丸高劑量組和格列本脲組胰島素水平顯著升高（P＜0.05），HOMA-IR 顯著降低（P＜0.05），而消渴丸低劑量組和消渴丸純中藥組胰島素、HOMAIR 水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

給藥4周后，各給藥組胰島素水平與給藥前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），消渴丸高劑量組和格列本脲組HOMA-IR 則顯著低于給藥前（P＜0.05）。

2.4 消渴丸對2型糖尿病db/db小鼠血脂的影響表4結(jié)果顯示：給藥前，與正常組比較，模型組和各給藥組TC 值和LDL-C 值顯著升高（P＜0.01）；模型組和各給藥組之間TC 值和LDL-C 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠血脂水平比較Table 4 Comparison of blood lipids levels among various groups of mice（±s，mmol·L-1）

表4 各組小鼠血脂水平比較Table 4 Comparison of blood lipids levels among various groups of mice（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與同組給藥前比較

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給藥4周后，與正常組比較，模型組和各給藥組TC 值和LDL-C 值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TC 值和LDL-C 值顯著降低（P＜0.05）；各給藥組之間TC值和LDL-C值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

各給藥組給藥4 周后TC 值和LDL-C 值均顯著低于給藥前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 消渴丸對2型糖尿病db/db小鼠血清AngⅡ含量的影響表5 結(jié)果顯示：給藥4 周后，與正常組比較，模型組和格列本脲組血清AngⅡ含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，消渴丸低、高劑量組和消渴丸純中藥組血清AngⅡ含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），格列本脲組血清AngⅡ含量無顯著性變化（P＞0.05）。各給藥組間比較，消渴丸高劑量組和消渴丸純中藥組血清AngⅡ水平顯著低于格列本脲組（P＜0.05），消渴丸高劑量組與消渴丸純中藥組之間血清AngⅡ含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組小鼠血清AngⅡ含量比較Table 5 Comparison of serum AngⅡcontent among various groups of mice（±s，pg·mL-1）

表5 各組小鼠血清AngⅡ含量比較Table 5 Comparison of serum AngⅡcontent among various groups of mice（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較；⑤P＜0.05，與格列本脲組比較

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2.6 消渴丸對2型糖尿病db/db 小鼠肝組織PPARα 含量的影響表6 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組肝組織PPARα 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組肝組織PPARα 含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高劑量組和格列本脲組的PPARα 含量升高效果與正常組相當(dāng)（P＞0.05），消渴丸低劑量組和消渴丸純中藥組的PPARα 升高效果未達(dá)到正常組水平（P＜0.05）。

表6 各組小鼠肝組織PPARα含量比較Table 6 Comparison of PPARα content in liver tissue among various groups of mice（±s，ng·mL-1）

表6 各組小鼠肝組織PPARα含量比較Table 6 Comparison of PPARα content in liver tissue among various groups of mice（±s，ng·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

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3 討論

根據(jù)2021年國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的全球糖尿病報告，全球約有5.37 億成年人患有糖尿病。2021 年《美國醫(yī)學(xué)會雜志》（JAMA）上發(fā)表的最新估計顯示，我國2018 年糖尿病患病率為12.4%[8]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的提升，我國糖尿病患病率呈爆發(fā)式增長[9]。

糖尿病的臨床表現(xiàn)，除高血糖外，往往合并包括高血壓、血脂異常等代謝紊亂癥狀[10-11]。研究[11]表明，確診的2 型糖尿病患者中合并代謝綜合征高達(dá)72.4%。2020 年版《中國2 型糖尿病防治指南》指出，糖尿病患者的血壓和血脂是2個重要且可干預(yù)的風(fēng)險因子，對它們的監(jiān)測和控制達(dá)標(biāo)與血糖的監(jiān)測和控制達(dá)標(biāo)同等重要。因此，對2型糖尿病患者應(yīng)執(zhí)行綜合治療策略，包含控糖、降血壓和調(diào)控血脂等措施。

消渴丸由7味中藥和格列本脲組成，臨床上用于2型糖尿病治療。臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消渴丸不僅有調(diào)控血糖作用，還可降血壓和降血脂[3-5]。本研究通過拆方，觀察消渴丸、消渴丸純中藥部分和格列本脲對2 型糖尿病小鼠血壓和血脂的作用，以期為揭示消渴丸調(diào)控血糖同時降血壓降脂的療效和機(jī)制提供理論依據(jù)，從而為2型糖尿病的治療提供綜合策略。拆方研究結(jié)果顯示：在調(diào)控空腹血糖方面，消渴丸低、高劑量組，消渴丸純中藥組及格列本脲組在給藥4周后空腹血糖值均明顯降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），而消渴丸純中藥組空腹血糖值高于格列本脲組（P＜0.05）。這表明消渴丸低、高劑量與格列本脲降低空腹血糖效果相當(dāng)，單純消渴丸純中藥部分降糖效果不甚理想，需配合格列本脲一同使用，才能發(fā)揮更優(yōu)的控糖作用。

HOMA-IR 是評估胰島素抵抗的直接指標(biāo)，HOMA-IR 升高提示患者體內(nèi)組織細(xì)胞對胰島素的利用及敏感性的不足，從而影響機(jī)體對血糖的調(diào)控作用[12-13]。拆方研究結(jié)果顯示：消渴丸高劑量組和格列本脲組HOMA-IR 均有降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且2 組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；消渴丸純中藥組HOMA-IR 與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示消渴丸控制血糖作用可能主要與消渴丸中格列本脲成分緩解胰島素抵抗有關(guān)。

針對收縮壓指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，消渴丸低、高劑量組和消渴丸純中藥組給藥4 周后收縮壓明顯降低（P＜0.05），而格列本脲組收縮壓無顯著變化（P＞0.05）。這表明消渴丸降血壓作用主要是通過降低收縮壓而實(shí)現(xiàn)的。已有研究證實(shí)，AngⅡ水平升高具有強(qiáng)收縮血管作用，還可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥形成，促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生，從而加重高血壓的進(jìn)展[14-15]。拆方研究結(jié)果顯示：與模型組比較，消渴丸低、高劑量組和消渴丸純中藥組給藥4 周后血清AngⅡ水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），格列本脲組血清AngⅡ含量無顯著變化（P＞0.05）；消渴丸高劑量組與消渴丸純中藥組之間血清AngⅡ含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示消渴丸降血壓作用可能主要與消渴丸純中藥組分抑制AngⅡ分泌有關(guān)。

針對血脂指標(biāo)，拆方研究結(jié)果顯示：給藥4周后，與模型組比較，消渴丸低、高劑量組TC 值和LDL-C 值均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且LDL-C 降低程度呈一定量效關(guān)系；格列本脲組TC 值和LDL-C 值亦低于模型組（P＜0.05），但TC 值和LDL-C 值下降作用不及消渴丸高劑量組；同時，與給藥前比較，各給藥組TC 和LDL-C在給藥4 周后均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。該結(jié)果表明，消渴丸調(diào)控血脂作用是中西藥組分協(xié)同作用的結(jié)果，消渴丸中藥組分與格列本脲協(xié)同作用才能達(dá)到血脂調(diào)控的最佳療效，與前期組分研究報道結(jié)論相符[16]。PPARα 是參與脂肪酸代謝的關(guān)鍵蛋白酶[17]，本研究后續(xù)檢測各組在給藥4 周后肝組織PPARα 的含量，結(jié)果顯示，各給藥組肝組織PPARα 水平較模型組顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高劑量組肝組織PPARα 水平最高，提示消渴丸可促進(jìn)脂肪酸代謝，加速其分解，實(shí)現(xiàn)調(diào)控血脂穩(wěn)態(tài)，而單純格列本脲用藥，無法達(dá)到最佳治療2型糖尿病血脂異常的效果。

綜上所述，本研究證實(shí)了消渴丸不僅具有調(diào)控血糖，也有降壓和降血脂的療效，其療效是消渴丸純中藥部分和西藥格列本脲部分協(xié)同作用的結(jié)果。消渴丸調(diào)控2型糖尿病小鼠血糖主要由西藥組成部分格列本脲抑制胰島素抵抗起作用，而通過純中藥部分抑制AngⅡ降低收縮壓而實(shí)現(xiàn)控制血壓，通過中藥部分和西藥部分協(xié)同升高肝組織PPARα 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控血脂；但具體調(diào)控機(jī)制仍有待深入挖掘。