烏藥醇提物對酒精聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝防治作用研究

顧建榮 韓麗萍 吳瑤 賴威旨 何志剛 葉合 樓招歡

酒精性肝病是指飲酒過度引起肝細胞發(fā)生變性、壞死，進而導(dǎo)致肝臟損傷等病變，臨床發(fā)病率逐年升高[1]。鑒于病情和病程，酒精性肝病臨床分型主要包括輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝和酒精性肝炎等[2]。酒精攝入過多會加速肝臟脂肪生成，引起肝細胞脂質(zhì)沉淀，約90%以上酗酒者會進展為酒精性脂肪肝[3-4]。酒精性脂肪肝發(fā)病機制尚未完全明確，當前仍缺乏有效防治該病的藥物。課題組前期研究表明，烏藥具有良好的降血脂作用[5-6]，能調(diào)節(jié)酒精性肝損傷大鼠異常的血脂水平[7]，防治酒精性肝病[8-9]。本研究擬在前期基礎(chǔ)上，進一步觀察烏藥對酒精和高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝的防治作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康ICR 雄性小鼠32 只，體質(zhì)量（20±2）g，購于上海靈暢生物科技有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)富春動物房[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0024]。室溫（23±2）℃，相對濕度45%～55%，自由飲食飲水，人工光照，明、暗各12 h。本實驗經(jīng)倫理委員會審核通過，倫理編號：ZSLL-2017-023。

1.2藥物與試劑 烏藥醇提物（Linderae Radix ethanol extract，LREE）：取烏藥飲片（浙江省天臺山烏藥生物工程有限公司，批號140301）適量置于圓底燒瓶，加10BV 70%乙醇，85 ℃回流2 h 提取2 次，濾過，合并2 次濾液，減壓回收乙醇并濃縮至適當體積，得LREE，臨用前用純水與LREE 按相應(yīng)比例配置成0.1 g/mL 濃度藥液。陽性對照藥：將易善復(fù)（批號BBJD106，賽諾菲安萬特制藥有限公司）置于純水中，于磁力攪拌器上攪拌1 h 后進行超聲乳化，最終配成2.05 mg/mL 的乳劑。造模試劑：紅星二鍋頭酒（酒精度52%，2.0 L/瓶，北京紅星股份有限公司，許可證編號：SC11511160310087）。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT，16052001）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspertate aminotransferase，AST，16091901）、總膽固醇（total cholesterol，TC，15100801）、三酰甘油（triglyceride，TG，16030301）試劑盒購自寧波美康生物科技股份有限公司RNA Purification Kit（12183-555）、First-Strand Synthesis SuperMix（11752-050）購自Thermo Pierce 公司；實時定量PCR 其他材料購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3實驗儀器 TBA-40FR Accute 全自動生化分析儀（日本東芝公司）；BIO-TEK 4C106 酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Tissue-Tek VIPTM 5 Jr 全封閉組織脫水機（Sakura Finetek Japan Co.，Ltd.）；MF43-N 正置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；Bio-Rad 1658033 蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂公司）；Bio-Rad CFX384 多重實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）。

1.4動物分組及給藥 ICR 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組及烏藥組，每組8 只。除正常對照組外，其余各組小鼠均予以高脂飼料+灌胃不同濃度白酒建立酒精性脂肪肝模型[9]（實驗第1～2 周給予酒精體積濃度為30%的白酒，第3～4 周白酒濃度增加至35%，第5～6 周白酒濃度增加至40%，第7～8 周增加至45%）；造模同時給予相應(yīng)藥物，其中正常對照組和模型對照組按1 mL/100 g 體積灌胃純水，陽性對照組灌胃0.2739 g/kg 易善復(fù)，烏藥組灌胃1 g/kg LREE，每日1 次，連續(xù)給藥8 周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)檢測 每3 天記錄1次小鼠體質(zhì)量，實驗第8 周末次給藥后禁食12 h，記錄小鼠體質(zhì)量，毛細管眼球取血，解剖，取肝臟用生理鹽水漂洗后，置刻度尺處拍照，稱定質(zhì)量，計算肝指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.5.2血清生化指標檢測 取各組小鼠血液1 mL，以轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心15 min 取血清，全自動血生化儀檢測血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量。

1.5.3肝組織病理學(xué)及脂質(zhì)沉積觀察 取各組小鼠肝臟，置于白色背景下觀察肝臟形態(tài)、色澤后，取相同位置的一部分肝組織置甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，行HE 染色；另取一部分肝組織，置-80 ℃冰箱冷凍，冷凍切片機切片，油紅O 染色后，封片，光鏡下觀察小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況。

1.5.4肝組織TC 攝取及合成相關(guān)調(diào)控基因mRNA表達水平檢測 取各組小鼠肝組織樣本適量，加入1 mL TRIzol 提取總RNA，BCA 法測定其蛋白含量，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行擴增，95 ℃預(yù)變性1 min，隨后進入40 個循環(huán)（95 ℃，15 s，63 ℃，25 s），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示基因平均相對表達量。引物序列由杭州紐貝生物設(shè)計，生工生物工程（上海）股份有限公司負責(zé)合成。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析法，兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠體質(zhì)量的影響至實驗第8 周，與正常對照組比較，模型對照組小鼠體質(zhì)量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型對照組比較，易善復(fù)組和烏藥組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠體質(zhì)量的影響（g，）

表2 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠體質(zhì)量的影響（g，）

注：正常對照組予正常飼料喂養(yǎng)+灌胃純水；模型對照組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃純水；易善復(fù)組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃易善復(fù)；烏藥組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃LREE；LREE 為烏藥醇提物；與模型對照組比較，aP＜0.05

2.2LREE 對酒精性脂肪肝小鼠血清肝功能指標的影響 與正常對照組比較，實驗第2、6、8 周，模型對照組小鼠血清AST 活性顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；血清ALT 活性在實驗前4 周無明顯變化，但至第6 周，血清ALT 活性顯著增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，易善復(fù)及烏藥組小鼠血清AST、ALT 活性明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠血清AST、ALT 活性的影響（U/L，）

表3 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠血清AST、ALT 活性的影響（U/L，）

注：正常對照組予正常飼料喂養(yǎng)+灌胃純水；模型對照組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃純水；易善復(fù)組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃易善復(fù)；烏藥組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃LREE；LREE 為烏藥醇提物；AST 為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

2.3LREE 對酒精性脂肪肝小鼠血脂水平的影響與正常對照組比較，造模第2 周開始，模型對照組小鼠TC 水平顯著增加（P＜0.01），TG 水平呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型對照組比較，易善復(fù)組及烏藥組小鼠血清TC 水平有增加趨勢，其中在實驗第4 周差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；實驗第6 周易善復(fù)及烏藥組小鼠血清TG 水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠血脂水平的影響（μmol/L，）

表4 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠血脂水平的影響（μmol/L，）

注：正常對照組予正常飼料喂養(yǎng)+灌胃純水；模型對照組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃純水；易善復(fù)組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃易善復(fù)；烏藥組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃LREE；LREE 為烏藥醇提物；TC 為總膽固醇；TG 為三酰甘油；與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

2.4LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝脂質(zhì)沉積的影響 肝臟形態(tài)觀察結(jié)果顯示（見圖1A），正常對照組小鼠肝臟顏色鮮紅，形狀規(guī)則且大小正常；與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟顏色呈黃褐色，肝臟指數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，易善復(fù)組及烏藥組小鼠肝臟色澤較紅潤，烏藥組小鼠肝指數(shù)下降顯著（P＜0.05）（見表5）。HE 染色（見圖1B）及油紅O 染色（見圖1C）結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肝細胞核藍染，細胞質(zhì)未見橘紅色脂滴；與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝細胞有較多空泡出現(xiàn)，細胞質(zhì)橘紅色脂滴明顯增多。與模型對照組比較，易善復(fù)組及烏藥組小鼠肝細胞空泡及脂滴數(shù)量明顯減少。

圖1 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝脂質(zhì)沉積的影響

表5 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響（）

表5 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響（）

注：正常對照組予正常飼料喂養(yǎng)+灌胃純水；模型對照組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃純水；易善復(fù)組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃易善復(fù)；烏藥組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃LREE；LREE 為烏藥醇提物；與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.05

2.5LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟TC 攝取及合成調(diào)控相關(guān)基因mRNA 表達水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝組織LDLR 和PPAR-α mRNA 水平顯著降低（P＜0.01），膽固醇合成相關(guān)調(diào)控基因Insig1、SCAP、SREBP-1 mRNA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，易善復(fù)組及烏藥組小鼠肝組織LDLR、PPAR-α mRNA 水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），Insig1、SCAP、SREBP-1 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表6。

表6 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝組織TC 攝取及合成調(diào)控相關(guān)基因mRNA 表達水平的影響（2-ΔΔCt，）

表6 LREE 對酒精性脂肪肝模型小鼠肝組織TC 攝取及合成調(diào)控相關(guān)基因mRNA 表達水平的影響（2-ΔΔCt，）

注：正常對照組予正常飼料喂養(yǎng)+灌胃純水；模型對照組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃純水；易善復(fù)組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃易善復(fù)；烏藥組予高脂飼料+灌胃白酒+灌胃LREE；LREE 為烏藥醇提物；LDLR 為低密度脂蛋白受體；PPAR-α 為過氧化物酶體增殖物激活受體；Insig1 為胰島素誘導(dǎo)基因1；SCAP 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白；SREBP-1 為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1；與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3 討論

飲酒過量會干擾肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝，促進酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[10-11]。本文采用高脂飲食和灌胃酒精模擬酒精性脂肪肝模型小鼠，通過評價小鼠肝臟指數(shù)、病理學(xué)染色以及油紅O 染色證實酒精性脂肪肝模型的可靠性，貼近酒精性脂肪肝臨床發(fā)病實際。研究結(jié)果表明，攝入高脂同時灌胃酒精可導(dǎo)致小鼠肝臟指數(shù)顯著增加，肝臟顏色呈黃褐色，小鼠血清ALT、AST 活性明顯增加，TC 水平顯著增加，肝組織油紅O 染色結(jié)果顯示模型小鼠肝組織脂質(zhì)沉積明顯，這與臨床酒精性脂肪肝發(fā)病表現(xiàn)一致，提示模型復(fù)制成功。灌胃給予LREE 干預(yù)，能顯著降低模型小鼠ALT、AST 活性，改善模型小鼠肝細胞脂質(zhì)沉積，提示LREE 對酒精和高脂飲食誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝具有良好的保護作用。

基于小鼠血清中TC 水平的變化，本研究進一步對小鼠肝臟TC 攝取及合成調(diào)控相關(guān)基因的表達水平進行了檢測。研究表明，飲酒過量可激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）蛋白活性，誘導(dǎo)脂質(zhì)積累，上調(diào)脂肪酸合酶、乙酰輔酶A 等SREBP 調(diào)節(jié)酶的基因及其蛋白表達[12-14]。SREBPs 為參與細胞內(nèi)膽固醇代謝的重要調(diào)控因子。SREBPs 是無活性的前體蛋白，必須通過SREBPs 裂解激活蛋白（SCAP）攜帶才能轉(zhuǎn)化為具有活性的轉(zhuǎn)錄因子——核SREBPs（nSREBPs），而此過程受細胞內(nèi)游離TC 含量和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胰島素誘導(dǎo)基因（Insig）水平影響。Insig 與SCAP、SREBPs 共同組成了Insig1-SCAP-SERBP1 轉(zhuǎn)運體系，與細胞內(nèi)TC 的含量共同調(diào)控nSERBP 的活化，影響低密度脂蛋白受體（LDLR）的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)外源性TC 的攝取[15]。本實驗結(jié)果表明，酒精性脂肪肝模型組小鼠肝組織LDLR 和PPAR-α mRNA 水平顯著降低，膽固醇合成相關(guān)調(diào)控基因Insig1、SCAP、SREBP-1 mRNA 水平顯著升高，而灌胃給予LREE 則可顯著逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。提示LREE 對酒精和高脂飲食誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝的保護作用，可能與干預(yù)Insig1-SCAP-SERBP1 信號通路介導(dǎo)的肝細胞對外源性TC的攝入有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，酒精性脂肪肝模型小鼠肝臟PPAR-α mRNA 水平顯著降低。研究表明，PPAR 參與糖及脂質(zhì)代謝的調(diào)控過程[16]。PPAR-α 為PPAR 家族的重要成員，參與脂質(zhì)代謝。長期飲酒可使肝中PPAR-α 的表達下調(diào)，進而減少PPAR-α 與維A 酸X 受體（RXR）結(jié)合，降低PPAR-α/RXR 異二聚體與DNA 結(jié)合能力[17-18]和肝脂質(zhì)氧化代謝能力，促進酒精性脂肪肝的發(fā)展。同時，乙醛也可抑制PPAR-α 表達，降低脂肪酸β 氧化能力，引起脂肪酸積累[19-20]，加劇酒精性脂肪肝的形成。在本研究中，灌胃給予LREE，可以顯著增加酒精性脂肪肝模型組小鼠肝臟組織PPAR-α mRNA 水平，提示LREE 可能通過增加線粒體脂肪酸代謝減少脂質(zhì)在肝細胞中的沉積。

綜上，本研究結(jié)果表明LREE 對酒精聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝具有良好的防治作用，該作用可能與抑制Insig1-SCAP-SERBP1 通路活化，參與肝臟外源性TC 攝入以及線粒體脂肪酸代謝相關(guān)。