酪氨酸激酶受體RON 和MET 在三陰性乳腺癌組織中的表達特征及臨床意義

王國平 張筱荻 壽春暉

三陰性乳腺癌作為一種常見惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的身心健康[1]。多種原癌基因的激活和抑癌基因的突變參與著三陰性乳腺癌發生發展的病理過程。酪氨酸激酶受體間質表皮轉化因子（MET）和巨噬細胞刺激蛋白受體（RON）同屬于MET 原癌基因家族[2]。已有研究表明，它們在包括大腸癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌等在內的多種癌癥組織中都有異常的表達和激活[3-5]，這些異常改變導致了癌細胞的增殖、侵襲性增強，促進細胞凋亡和轉移[6]。本研究探討RON 和MET 在三陰性乳腺癌組織中的表達特征，比較RON 和MET 表達與三陰性乳腺癌臨床病理關系，評價其作為三陰性乳腺癌患者病理診斷和預后判斷的新型生物標志物的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2011 年1 月至2018 年5 月在浙江中醫藥大學附屬第二醫院以及浙江大學醫學院附屬第一醫院經病理診斷為三陰性乳腺癌并行手術治療的130 例患者組織。臨床資料包括患者人口統計學、腫瘤淋巴結轉移（TNM）階段、腫瘤分化和腫塊大小等。將所有組織固定在10%甲醛緩沖液并包埋在石蠟中。該研究獲得醫院倫理審批（倫理審批編號：2017427-2）。

1.2主要試劑 抗RON 鼠單克隆抗體Zt/F2[7]由浙江大學傳染病診治國家重點實驗室研制和惠贈，抗MET 的兔單克隆抗體EP1454Y（Abcam 51067，Abcam，USA），EnVision System 免疫組織化學染色試劑（K3468，Dako，Carpentaria，CA，USA）。

1.3免疫組織化學染色 5 μm 石蠟厚組織切片于60 ℃烤片2 h 后，經二甲苯和梯度濃度乙醇（100%、95%、75%、50%）脫蠟水化后，用3%H2O2溶液滅活內源性過氧化物酶，1%BSA 封閉30 min。加抗RON 鼠單克隆抗體Zt/f2（1∶1000）或抗MET 兔單克隆抗體EP1454Y（1∶100），4 ℃反應過夜，PBS 洗4 次后，采用Envision System 二步法進行免疫組織化學染色和顯色。最后組織片用蘇木素復染，封片。

1.4結果評估 所有免疫組化染色切片，由兩名病理科醫師對切片進行檢查、評分和成像。使用半定量系統確定RON 和MET 表達水平。該方法結合了目標蛋白的染色強度（0～3）和染色細胞比例（0～4 分）的分數，綜合得分2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中度陽性（++），＞5 分確定為強陽性（+++），并且積分≥4 分為過表達。細胞比例評分如下：0 分（＜5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%）和4分（＞75%）。染色水平評分如下：0 分（無染色），1 分（弱染色，淺黃色），2 分（中度染色，黃褐色）和3 分（強染色，棕色）。總分是通過將陽性比例得分和染色程度得分相加而確定。RON 和MET 兩者都過表達的患者被認為共同過表達。

1.5統計學方法 應用GraphPad Prism 7 和SPSS 17.0 進行統計分析。使用χ2檢驗比較RON 和MET表達與臨床病理特征之間的關系。總生存期（OS）計算從診斷到死亡或最后一次隨訪日期的時間。生存數據通過Kaplan-Meier 方法和對數秩檢驗進行分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1MET 和RON 在三陰性乳腺癌組織中的表達免疫組化染色顯示，MET 和RON 主要表達在癌細胞的細胞質和細胞膜（見圖1）。在129 例三陰性乳腺癌樣本中，MET 陽性表達率為77.52%（100/129），其中弱陽性表達率為33.33%（43/129），中度陽性表達率為32.56%（42/129），強陽性表達率為11.63%（15/129），過表達率為44.19%（57/129）；RON 陽性表達率為72.87%（94/129），其中弱陽性表達率為34.89%（45/129），中度陽性表達率為24.03%（31/129），強陽性表達率為13.95%（18/129），過表達率為37.98%（49/129）。RON 和MET 共表達陽性率為59.69%（77/129），其中共同過表達為24.03%（31/129）。

圖1 三陰性乳腺癌組織樣品中RON 和MET 表達水平（免疫組化染色，×40，×200）

2.2MET 和RON 蛋白表達與三陰性乳腺癌患者臨床病理的關系 結果顯示，MET 蛋白表達與組織學分級存在相關性（P＜0.05），與年齡、腫塊大小、臨床分期、淋巴結轉移無明顯相關性（P＞0.05）。RON 蛋白表達與患者臨床分期、組織學分級、遠端轉移、年齡、腫塊大小、淋巴結轉移均無明顯相關性（P＞0.05），見表1。

表1 三陰性乳腺癌組織中MET 和RON 蛋白表達與臨床病理參數間的關系（例）

2.3MET 和RON 在三陰性乳腺癌組織中的相關性結果顯示，乳腺癌組織中MET 蛋白的分級表達與RON 蛋白的分級表達之間具有顯著相關性（P＜0.05），見表2。

表2 MET 與RON 蛋白在三陰性乳腺癌中分級表達的相關性

2.4RON 及MET 的表達與三陰性乳腺癌患者總生存期的關系 對129 例患者進行生存分析，結果顯示，RON 或MET 強陽性表達的患者相較于RON 或MET 非強陽性表達的患者的生存期明顯縮短（P＜0.05），見圖2。

圖2 三陰性乳腺癌組織RON 或MET 表達水平與患者生存期的關系

3 討論

MET 和RON 蛋白屬于酪氨酸激酶受體家族，具有相似的結構[2，8]。MET 可以通過肝細胞生長因子被激活，使其自身磷酸化，然后將信號傳入細胞核，促使細胞增殖和分化，包括發生形態轉化、誘導細胞增殖、運動和侵襲等[9]。RON 屬于MET 家族，特異性配體為人巨噬細胞刺激蛋白[6-7，10]。有研究證實，經配體活化的RON 亦可引發MET 轉磷酸，反之亦然。并且，異常表達的RON 也可以與MET 形成異二聚體而活化，促進RON 的腫瘤生物學效應。由此可見，盡管配體不同，但它們在細胞信號通路中相互影響，具有協同作用[11]。我們研究結果也顯示，在這129 例臨床樣本中二者的表達水平具有顯著的相關性。

三陰性乳腺癌是一類復雜的、異質性的乳腺癌亞型，三陰即雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2 陰性。三陰性乳腺癌具有特殊的生物學行為，侵襲性強，且因為缺少靶向治療的特定靶點，其復發的概率很高[12]。有研究顯示，三陰性乳腺癌的發生發展過程中涉及多種原癌基因和信號通路，如P53、MYC基因、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）通路等的改變[13]。但其確切的發病機制仍在探索中。本文意在探索RON 和MET蛋白在三陰性乳腺癌病程進展中的作用。

免疫組化結果顯示，在三陰性乳腺癌組織中RON 和MET 表達增加，RON 陽性表達可達到72.87%，而MET 的陽性率則更高，可達到77.52%，它們共同過表達率可以達到24.03%，即在三陰性乳腺癌患者中RON 蛋白高表達者亦會伴隨著MET 蛋白的高表達。因而我們推測，在三陰性乳腺癌的發展過程中，RON 和MET 以異二聚體的形式對ERK、蘇氨酸蛋白激酶（AKT）等信號通路進行激活，從而導致腫瘤細胞增殖轉移、血管生成、化療耐藥等特性的改變。此外，經過統計，RON 或MET 強陽性表達患者的生存期明顯縮短，我們認為聯合檢測RON 和MET，具有一項或共同強陽性表達的患者具有不良預后。而RON 和MET 蛋白表達與患者年齡、腫塊大小、淋巴結轉移等臨床參數無明顯相關性，與前期研究結果相符[6，9]。

不止在預后評估方面，越來越多的研究關注于RON 和MET 能否作為潛在的腫瘤治療靶點[14-15]。我們也在另外一項研究中證實，利用小分子抑制劑共同抑制胰腺癌細胞系中RON 和MET 的表達，腫瘤細胞的遷移力和小鼠移植瘤模型的腫瘤體積均得到了很好的抑制，但僅針對MET 的抑制劑效果卻很弱[16]。這可能是因為RON 在腫瘤形成和惡性進展中具有更重要的生物作用[15]，因而有研究認為RON 作為未來腫瘤治療的靶點更具意義[13]。

綜上所述，癌組織中RON 和MET 的異常高表達，可能參與了三陰性乳腺癌的發生發展及惡性化進展的病理過程。異常表達的RON 和MET 不僅是三陰性乳腺癌病理診斷的新型生物標志，同時也是潛在的抗癌藥靶。