心房顫動患者人成纖維細胞的單細胞RNA序列的生物信息學分析

周科 向杰 張長江 張莉

[摘要]?目的?篩選心房顫動（atrial?fibrillation，AF）促纖維化的關鍵基因及信號通路，探討AF誘導的人心房成纖維細胞的促纖維化重塑的分子機制。方法?從公共基因數據庫（gene?expression?omnibus，GEO）下載單細胞RNA序列表達譜GSE148506，通過主成分分析和T分布式隨機鄰接嵌入得到差異基因，利用SingleR軟件包進行細胞類型注釋和軌跡分析，使用clusterprofiler軟件包，對成纖維細胞的差異基因進行基因本體（gene?ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genome，KEGG）信號通路分析。利用在線STRING數據庫和Cytoscape軟件進行蛋白質相互作用網絡和模塊分析。利用插件cytoHubba篩選出關鍵基因。結果?共得到6個細胞類型注釋群，包括成纖維細胞、脂肪細胞、內皮細胞、單核細胞、成纖維細胞、骨骼肌細胞。共鑒定出367個成纖維細胞差異基因，包括37個下調基因和330個上調基因。GO功能富集分析結果顯示，成纖維細胞的差異基因生物過程主要富集于細胞外基質組織等；細胞組成主要富集于含膠原細胞外基質等；分子功能主要富集于細胞外基質結構成分等。KEGG信號通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細胞外基質-受體相互作用等。STRING分析從蛋白質網絡互作圖中鑒定出6個成纖維細胞關鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN。結論?利用生物信息學分析，鑒定出FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN在內的基因及黏著斑、細胞外基質-受體相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白酶信號通路和轉化生長因子-β信號通路可能是AF誘導的人心房成纖維細胞促纖維化重塑的重要分子機制。

[關鍵詞]?心房顫動；單細胞RNA序列；人心房成纖維細胞；生物信息學分析

[中圖分類號]?R541.7??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.09.001

Bioinformatics?analysis?of?single-cell?RNA-seq?of?atrial?human?fibroblasts?with?atrial?fibrillation

ZHOU?Ke，?XIANG?Jie，?ZHANG?Changjiang，?ZHANG?Li

Cardiology?Department，?Affiliated?Minda?Hospital?of?Hubei?Minzu?University，?Enshi?445000，?Hubei，?China

[Abstract]?Objective?To?screen?key?genes?and?signaling?pathways?for?pro-fibrosis?in?atrial?fibrillation?（AF）?and?explore?the?molecular?mechanisms?of?AF-induced?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts.?Methods?Single-cell?RNA-seq?（scRNA-seq）?expression?profile?GSE148506?（AF?and?SR?fibroblasts），?was?downloaded?from?the?gene?expression?omnibus?（GEO）?database.?The?marker?genes?were?obtained?by?quality?control?and?data?filtering，?principal?component?analysis?and?t-distributed?stochastic?neighbor?embedding.?SingleR?package?was?utilized?for?cell?type?annotation?and?trajectory?analysis.?By?using?the?clusterprofiler?package，?the?marker?genes?of?fibroblasts?were?performed?through?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes?（KEGG）?pathway?analysis.?Protein-protein?interaction?network?analysis?and?module?analysis?was?performed?using?the?STRING?database?and?Cytoscape?software.?The?hub?genes?were?screened?out?by?utilizing?the?plug-in?cytoHubba.?Results?6?clusters?of?cell?type?annotations?were?obtained，?included?fibroblasts，?adipocytes，?endothelialcells，?monocytes，?fibroblasts，?skeletal?muscle.?A?total?of?367?fibroblasts?marker?genes?were?identified，?included?37?down-regulated?and?330?up-regulated?genes.?GO?functional?enrichment?analysis?results?showed?that?the?marker?genes?for?fibroblasts?were?predominantly?enriched?for?extracellular?matrix?organization?for?biological?process;?collagen-containing?extracellular?matrix?for?cellular?component;?and?extracellular?matrix?structural?constituent?for?molecular?function.?KEGG?pathway?analyses?indicated?that?the?marker?genes?were?meaningfully?enriched?in?Focal?adhesion，?extracellular?matrix?（ECM）-receptor?interaction，?and?so?on.?Top?6?hub?genes?of?fibroblasts?included?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3，?VCAN.?Conclusion?Using?bioinformatics?analysis，?we?identified?genes?including?FN1，?TIMP1，?LAMB1，?FBN1，?C3?and?VCAN?and?Focal?adhesion，?ECM-receptor?interactions，?PI3K-AKT?signaling?pathway?and?transforming?growth?factor-β?signaling?pathway?as?possible?important?molecular?mechanisms?of?pro-fibrotic?remodeling?in?human?atrial?fibroblasts?in?AF.

[Key?words]?Atrial?fibrillation;?Single-cell?RNA-seq;?Atrial?human?fibroblasts;?Bioinformatics?analysis

心房顫動（atrial?fibrillation，AF）是臨床上常見的心律失常類型之一，其發病率的增加與許多因素有關，如高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等，導致心房結構和組織病理學的改變，從而增加對AF的易感性[1]。目前觀點認為，心房纖維化會刺激心房結構的重塑，從而導致AF的發生和維持[2]。研究表明，AF患者纖維組織的含量和分布與AF發生的機制、并發癥和治療失敗的風險有關[3]。成纖維細胞被認為是心肌中豐富的非肌細胞群，它控制著細胞外基質的組成和結構[4]。成纖維細胞占心臟細胞數量的75%，但僅占其質量的10%～15%[5]。因此，通過成纖維細胞可更好地了解AF發生、發展的分子機制并發現抗心律失常干預的新靶點。單細胞RNA測序（single-cell?RNA-seq，scRNA-seq）可在細胞分子水平上全面分析AF的發生機制，AF的遺傳學非常復雜，罕見和常見的突變均會增加對AF的易感性[6]。盡管許多研究已通過微陣列分析獲得與AF相關的潛在基因和通路，但目前對AF患者成纖維細胞scRNA-seq的研究較少。本研究通過成纖維細胞的scRNA-seq數據分析，利用AF和竇性心律（sinus?rhythm，SR）樣本的成纖維細胞以評估AF中的差異基因和潛在信號通路，現報道如下。

1??材料與方法

1.1??scRNA-seq數據

篩選公共基因數據庫（gene?expression?omnibus，geo）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中所有AF成纖維細胞的scRNA-seq表達數據集后，選擇GSE148506進行分析，它來自GPL18573平臺Illumina?NextSeq?500（Homo?sapiens），包括4個AF和4個SR的384個樣本的表達譜。

1.2??PCA和T-SNE分析

主成分分析（principal?component?analysis，PCA）和T分布式隨機鄰接嵌入（t-distributed?stochastic?neighbor?embedding，T-SNE）被用于數據的降維處理。由于原理和機制不同，T-SNE保留的屬性信息更具代表性，反映樣本間差異，但T-SNE速度較慢，PCA速度相對較快。

1.3??差異基因

經T-SNE分析后得到不同聚類，將|log?（fold?change）|>2和P<0.05作為篩選標準尋找每個聚類的差異基因。

1.4??細胞類型注釋和軌跡分析

SingleR是一種計算方法，將單細胞轉錄組與參考轉錄組數據集相關聯，并迭代改進其推斷，可用于改進scRNA-seq中的細胞類型注釋。Monocle工具被用于分析細胞分化軌跡，以轉錄數據為基礎，使用模型預測細胞進化/分化過程。

1.5??GO和KEGG通路富集分析

使用R軟件包Clusterprofler比較基因簇之間的生物學特性，利用其進行基因本體（gene?ontology，?GO）分析探討差異基因的生物學功能，并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?encyclopedia?of?genes?and?genomes，KEGG）通路分析以確定差異基因富集的信號通路。

1.6??蛋白互作網絡分析

使用在線STRING數據庫（https：//string-db.org/）預測差異基因的蛋白互作網絡信息，相互作用論證的最高置信度設定>0.7。利用Cytoscape（3.7.1版）軟件對蛋白互作網絡進行可視化分析。通過使用cytoHubba插件最大克里爾中心度和度識別關鍵基因，包括利用Cytoscape軟件的分子復合體檢測（molecular?complex?detection，MCODE）插件尋找整個網絡的模塊，參數設置：度值=2，節點得分值=0.2，k-core=2，最大深度=100。

2??結果

2.1??PCA和T-SNE分析

經PCA分析得到一系列主成分（principal?component，PC），見圖1。實際PC關鍵基因與理論基因的差異顯示見圖2。選擇前20個PC進行T-SNE分析，得到6個聚類。不同細胞群中基因的表達情況見圖3。各聚類中6個關鍵基因表達水平的小提琴圖見圖4A；T-SNE中6個關鍵基因表達水平的散點圖見圖4B；各聚類中6個關鍵基因表達水平的氣泡圖見圖4C。關鍵基因的表達主要集中在聚類0和4，選擇聚類0和4（成纖維細胞群）的差異基因進行分析。

2.2??細胞類型注釋和軌跡分析

共得到6個聚類的細胞類型。聚類0，成纖維細胞；聚類1，脂肪細胞；聚類2，內皮細胞；聚類3，單核細胞；聚類4，成纖維細胞；聚類5，骨骼肌細胞。6個聚類細胞類型的軌跡分析見圖5。

2.3??差異基因

聚類0中共鑒定出242個標記基因，包括205個上調的差異基因和37個下調的差異基因；聚類4中共鑒定出125個上調的差異基因，聚類4中未篩選出下調的差異基因。

2.4??GO和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結果顯示，成纖維細胞的差異基因生物過程主要富集于細胞外基質組織、細胞外結構組織、結締組織；細胞組成主要富集于含膠原細胞外基質、基底膜、內質網腔；分子功能主要富集于細胞外基質結構成分、糖胺聚糖結合、肝素結合。GO富集度前5位的基因及其相關基因見圖6A、6B。KEGG信號通路分析表明，差異基因主要富集于黏著斑、細胞外基質-受體相互作用、血管平滑肌收縮、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide?3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein?kinase?B，AKT）信號通路（PI3K-AKT）、蛋白質消化吸收等，前5個KEGG信號通路及其相關基因見圖6C、6D。

2.5??蛋白互作網絡、關鍵基因和模塊分析

使用STRING數據庫，創建一個蛋白互作網絡探討這些差異基因的生物學特性，包含343個節點和786條邊。使用Cytoscape-cytoHubba插件，通過最大克里爾中心度和度值的方法篩選出6個關鍵基因，即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN。

3??討論

AF是一種日趨嚴重的臨床疾病，遺傳學特征復雜，罕見和常見的基因突變均可極大地增加AF的易感性。近年來生物信息學取得較大進步，隨著基因芯片技術的快速發展，基因芯片技術在心血管臨床和研究中得到廣泛應用。因此，應用生物信息學方法進一步探討AF的發病機制非常重要，有助于在遺傳水平上發現預防和治療AF的新靶點。本研究中，被鑒定出的關鍵基因和信號通路在AF的研究中已有少量報道，表明綜合生物信息學分析的結果具有重要作用。

結構重塑、電重塑和收縮性重塑在AF的發展和維持中起著關鍵作用。結構重塑取決于兩個部分：一是細胞結構變化，二是細胞外基質分布不平衡[7-8]。大量研究表明，AF的存在與細胞外基質沉積和降解平衡關系的破壞與心房重塑之間存在著極大的相關性[8]。本研究發現，這些差異基因主要富集在與細胞外基質有關的生物過程中。心肌成纖維細胞主要參與心肌重塑，單核細胞在心肌梗死誘發的炎癥期間的心臟重塑中也發揮重要作用[9]。此外，在炎癥和傷口愈合期間，誘發的心臟纖維化與單核細胞亞群有關，這些證據表明，單核細胞與AF密切相關[10]。根據細胞軌跡分析結果顯示，單核細胞和成纖維細胞相互毗鄰。金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue?inhibitor?of?metalloproteinases-1，TIMP-1）基因通過控制基質金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinases，MMPs）的活性在細胞外基質重塑中發揮重要作用。研究表明，血漿和組織中TIMP-1水平的升高與心肌纖維化和舒張功能障礙有著密切的聯系[11]。同時，TIMP-1對AF的病理生理學有重大影響，而這種影響是由MMPs和TIMPs間的不平衡所致[12]。Nakano等[13]發現MMP-9在AF患者的心房組織中高度表達，可能導致AF期間心房結構重塑和心房擴張，因此，本研究結果進一步表明，TIMP-1/MMPs信號通路是治療AF心房重塑和纖維化的潛在目標。

纖連蛋白1（fibronectin?1，FN1）屬于細胞外基質的糖蛋白家族，廣泛存在于各種類型的細胞中，與細胞的黏附和遷移過程密切相關，通過整合素跨膜受體參與病理生理過程變化[14-15]。Dong等[16]發現在心肌纖維化重塑和衰竭過程中，成纖維細胞的FN1表達顯著增加。本研究發現，FN1主要富集在黏著斑、細胞外基質-受體相互作用和PI3K-AKT信號通路上，FN1通過影響PI3K/AKT信號傳導調節細胞的生物學特性，通過阻斷PI3K-AKT的激活抑制FN1基因的表達，抑制細胞增殖，促進細胞衰老和凋亡，并減少細胞遷移和侵襲[17]。

通過KEGG信號通路分析，發現肌原纖維蛋白-1（fibrillin-1，FBN-1）明顯富集于轉化生長因子-β（transforming?growth?factor-β，TGF-β）信號通路中。TGF-β被認為是心房纖維化的一個主要介質，而TGF-β過度表達模型在體外或體內研究心房纖維化和AF的發病機制已被廣泛認可[18-19]。

總之，利用AF和SR患者成纖維細胞的scRNA-seq數據，確定與AF相關的差異表達基因，從而在基因水平上探討AF發生的機制。FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3和VCAN在內的基因及黏著斑、細胞外基質-受體相互作用、PI3K-AKT信號通路和TGF-β信號通路有可能成為AF的新生標志物，并可能成為AF的潛在治療目標。

[參考文獻][1] STAERK?L，?SHERER?J?A，?KO?D，?et?al.?Atrial?fibrillation：?Epidemiology，?pathophysiology，?and?clinical?outcomes[J].?Circulation?Research，?2017，?120（9）：?1501.

[3] ZAHID?S，?COCHET?H，?BOYLE?P?M，?et?al.?Patient-?derived?models?link?re-entrant?driver?localization?in?atrial?fibrillation?to?fibrosis?spatial?pattern[J].?Cardiovascular?Research，?2016，?110：?443–454.