miR-138-5p調控CDC5L表達對膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響

王歐洋 朱鵬磊 林杰 童凌云

[摘要]?目的?探討微RNA（microRNA，miR）-138-5p對膠質瘤細胞增殖、侵襲的調控機制。方法?體外培養人膠質瘤U251細胞，采用隨機數字表法將其分為對照組（n=6）、miR-NC組（n=6）、miR-138-5p組（n=6）、miR-138-5p+pc-NC組（n=6）、miR-138-5p+pc-細胞分裂周期5樣（cell?division?cycle?5-like，CDC5L）組（n=6）。采用實時熒光定量PCR（real-time?quantitative?PCR，RT-qPCR）檢測細胞中miR-138-5p、CDC5L?mRNA水平，檢測細胞增殖活力、細胞周期和細胞凋亡以及細胞侵襲能力，檢測細胞中CDC5L和侵襲相關蛋白表達。結果?miR-138-5p的過表達可下調CDC5L?mRNA和蛋白水平，降低膠質瘤細胞增殖活力和侵襲能力，并誘導G2/M期細胞周期停滯，促進細胞凋亡，降低N-鈣粘蛋白、波形蛋白水平，升高E-鈣粘蛋白水平，差異均有統計學意義（P<0.05）；上調CDC5L表達可明顯逆轉過表達miR-138-5p對膠質瘤細胞惡性生物學行為的影響（P<0.05）；與miR-NC和CDC5L-WT質粒共轉染比較，miR-138-5p?mimic和CDC5L-WT質粒共轉染的細胞中熒光素酶活性降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論?過表達miR-138-5p可能通過靶向下調CDC5L，抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲。

[關鍵詞]?膠質瘤；微RNA-138-5p；細胞分裂周期5樣；增殖；侵襲

[中圖分類號]?R739.4??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.010

Influences?of?miR-138-5p?on?proliferation?and?invasion?of?glioma?cells?by?regulating?CDC5L?expression

WANG?Ouyang，?ZHU?Penglei，?LIN?Jie，?TONG?Lingyun

Department?of?Neurosurgery，?Wenzhou?People's?Hospital，?Wenzhou?325006，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?regulatory?mechanism?of?microRNA-138-5p?（miR-138-5p）?on?the?proliferation?and?invasion?of?glioma?cells.?Methods?Human?glioma?U251?cells?were?cultured?in?vitro?and?divided?into?control?group?（n=6），?miR-NC?group?（n=6），?miR-138-5p?group?（n=6），?miR-138-5p+pc-NC?group（n=6），?and?miR-138-5p+pc-cell?division?cycle?5-like?（CDC5L）?group?（n=6）?according?to?the?random?number?table?method.?Real-time?quantitative?PCR?（RT-qPCR）?was?performed?to?measure?the?levels?of?miR-138-5p?and?CDC5L?mRNA?in?cells，?to?measure?cell?proliferation?viability，?cell?cycle?and?apoptosis，?and?cell?invasion?ability，?and?to?measure?the?expression?of?CDC5L?and?invasion-related?proteins?in?cells.?Results?Overexpression?of?miR-138-5p?was?able?to?down-regulate?CDC5L?mRNA?and?protein?levels，?reduce?the?proliferative?viability?and?invasive?ability?of?glioma?cells，?induce?cell?cycle?arrest?in?G2/M?phase，?promote?cell?apoptosis，?and?reduce?N-cadherin?and?Vimentin?levels，?increased?E-cadherin?level，?and?the?differences?were?statistically?significant?（P<0.05）;?up-regulation?of?CDC5L?expression?was?able?to?significantly?reverse?the?effects?of?overexpression?of?miR-138-5p?on?the?malignant?biological?behavior?of?of?glioma?cell?（P<0.05）;?the?dual?luciferase?assay?showed?that?compared?with?co-transfection?of?miR-NC?and?CDC5L-WT?plasmids，?the?luciferase?activity?in?cells?co-transfected?with?miR-138-5p?mimic?and?CDC5L-WT?plasmids?was?significantly?decreased?（P<0.05）.?Conclusion?Overexpression?of?miR-138-5p?may?inhibit?the?proliferation?and?invasion?of?glioma?cells?by?targeting?down-regulation?of?CDC5L.

[Key?words]?Glioma;?MicroRNA-138-5p;?Cell?division?cycle?5-like;?Proliferation;?Invasion

膠質瘤是一種侵襲性極強的中樞神經系統惡性腫瘤，具有生長快、死亡率高、平均生存時間短的特點[1]，已成為對人類生命和健康造成極大危害的疾病之一。目前，傳統的手術切除、放療、化療結合的多模式治療并未明顯改善膠質瘤患者的預后[2]。微RNA（microRNA，miR）與特定靶mRNA結合以調節轉錄后基因表達，被認為是目前有希望用于神經膠質瘤診斷和預后的生物標志物和分子治療靶點[3-4]。miR-138-5p是一種腫瘤抑制miRNA，在黑色素瘤[5]、視網膜母細胞瘤[6]、膠質瘤[7-8]等惡性腫瘤中均下調。miR-138-5p的過表達對膠質瘤細胞的惡性生物學行為具有抑制作用[7]，但其潛在的分子機制仍未完全明確，需要進一步研究。細胞分裂周期5樣（cell?division?cycle?5-like，CDC5L）蛋白是細胞周期G2/M轉換的調節劑，在多種癌癥中充當癌基因作用，被認為是腫瘤治療的潛在靶點[9-10]。據報道，CDC5L在膠質瘤組織中高度表達，其表達與膠質瘤病理分級和Ki-67表達顯著相關，并且CDC5L是膠質瘤患者生存的獨立預后因素[11]。生物信息學網址預測發現，CDC5L是miR-138-5p的靶基因。因此，本研究對miR-138-5p通過調控CDC5L表達對膠質瘤進展的影響進行了探討。

1??材料與方法

1.1??細胞

從武漢普諾賽生命科技有限公司購入人膠質瘤細胞U251，貨號CL-0237。U251細胞在DMEM培養基（10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）中培養。

1.2??主要試劑與儀器

Lipofectamine?2000轉染試劑（美國Thermo?Fisher?Scientific公司，11668027）；miR-138-5p模擬物（miR-138-5p?mimic）及其陰性對照（miR-NC）、CDC5L過表達質粒（pcDNA3.1-CDC5L）和pcDNA陰性對照（pcDNA3.1-NC）購自RiboBio（中國）；CCK-8試劑盒（C00038）、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（C1052）購自碧云天生物科技有限公司；兔源一抗CDC5L、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）購自英國Abcam公司，貨號分別為ab129114、ab40772、ab76011、ab92547、ab181602。熒光定量PCR儀（ABI?Prism??7500型，美國Applied?Biosystems公司）；多功能酶標儀（iMark680，美國Bio-Rad公司）；流式細胞儀（FACScan，美國BD?Biosciences公司）。

1.3??方法

1.3.1??細胞分組與轉染??將U251細胞以每孔5×104個細胞的密度接種于6孔板中，培養24h后進行轉染。使用Lipofectamine?2000將miR-138-5p?mimic、pcDNA3.1-CDC5L及其陰性對照瞬時轉染到U251細胞中。實驗采用隨機數字表法，將細胞分為對照組（不轉染，n=6）、miR-NC組（n=6）、miR-138-5p組（n=6）、miR-138-5p+pc-NC組（共轉染miR-138-5p?mimics和pcDNA3.1-CDC5L陰性對照pcDNA3.1-?NC，n=6）、miR-138-5p+pc-CDC5L組（共轉染miR-?138-5p?mimic和pcDNA3.1-CDC5L，n=6）。6h后更換培養液，然后在37℃、5%CO2下常規培養48h。

1.3.2??RT-qPCR檢測miR-138-5p、CDC5L表達??提取U251細胞中的總RNA，然后將總RNA逆轉錄為cDNA。使用SYBR??Premix?Ex?Taq??Ⅱ試劑盒在熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件：95℃?10min，然后95℃?10s、60℃?20s、72℃?30s的40個循環。GAPDH或U6分別用作mRNA或miRNA的內源性對照。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達，引物序列見表1。

1.3.3??細胞增殖活力檢測??將各組細胞接種到96孔板中（每孔2000個細胞），分別在培養24h、48h和72h后，加入CCK-8試劑（10μl/孔），然后在37℃下繼續培養4h。使用酶標儀測定450nm處的各孔吸光度。

1.3.4??細胞周期檢測??轉染48h后，收集U251細胞用于細胞周期分析。將細胞在預冷的75%乙醇中固定過夜，然后除去乙醇，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered?saline，PBS）將細胞洗滌2次，在37℃的黑暗環境中用碘化丙啶（propidium?iodide，PI）溶液染色30min后，使用流式細胞儀分析細胞周期。

1.3.5??細胞凋亡率檢測??收集細胞，用冷PBS洗滌兩次，然后將細胞重新懸浮在含有5μl膜聯蛋白（Annexin）V-異硫氰酸熒光素（fluorescein?isothiocyanate，FITC）和10μl?PI的300μl結合緩沖液中。在室溫下避光孵育15min后，在流式細胞儀上檢測，通過流式細胞術定量細胞凋亡率。

1.3.6??細胞侵襲能力檢測??將細胞以5×104個細胞/ml的密度重懸于200μl無血清培養基中，并接種于上室（預涂有Matrigel基質膠）；下室加入500 μl?DMEM培養基（含10%胎牛血清）。培養48h后，取出上室，棉簽擦去上表面殘留的細胞，將下表面侵入的細胞固定15min（4%多聚甲醛），然后以結晶紫染色15min。于光學顯微鏡下觀察并計數侵入細胞數。

1.3.7??CDC5L和侵襲相關蛋白表達檢測??用RIPA裂解液裂解各組U251細胞30min，離心20min，取上清液。二辛可寧酸（bicinchoninic?acid，BCA）法檢測上清液中總蛋白濃度。將等量蛋白質樣品（20?μg）在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium?dodecyl?sulfate?polyacrylamide?gel?electrophoresis，SDS-PAGE）上進行電泳分離，并轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene?fluoride，PVDF）膜。將膜用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1h。與一抗CDC5L（1：1000）、E-鈣粘蛋白（1：1000）、N-鈣粘蛋白（1：1000）、波形蛋白（1：1000）和GAPDH（1：3000）在4℃下孵育過夜；而后在室溫下，將膜與辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgG二抗（1：5000）孵育1h。最后，通過增強化學發光法檢測蛋白質，使用ImageJ軟件觀察并量化蛋白質條帶。

1.3.8??生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因檢測??使用TargetScan?7.2預測miR-138-5p和CDC5L之間的靶向結合序列。然后將含有推定的miR-138-?5p結合位點的CDC5L序列及其突變體克隆到pmirGLO雙熒光素酶載體以構建報告載體CDC5L-野生型（CDC5L-WT）和CDC5L-突變型（CDC5L-?MUT）。使用Lipofectamine?2000試劑將miR-138-5p?mimic或miR-NC和CDC5L-WT或CDC5L-MUT共轉染到U251細胞。轉染48h后，獲得細胞裂解物，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統評估細胞裂解物中螢火蟲熒光素酶活性，并將其標準化為海腎熒光素酶活性。

1.4??統計學方法

采用GraphPad?Prism?8.0軟件對數據進行處理分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，兩組間比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??miR-138-5p、CDC5L?mRNA水平比較

miR-138-5p組細胞的miR-138-5p水平顯著高于對照組和miR-NC組（P<0.05），而CDC5L?mRNA水平顯著低于對照組和miR-NC組（P<0.05）。miR-?138-5p+pc-CDC5L組CDC5L?mRNA水平顯著高于miR-138-5p組和miR-138-5p+pc-NC組（P<0.05），見表2。

2.2??細胞增殖活力比較

在48h和72h時，miR-138-5p組的細胞增殖活力均顯著低于對照組和miR-NC組（P<0.05）；miR-138-5p+pc-CDC5L組細胞增殖活力顯著高于miR-138-5p組和miR-138-5p+pc-NC組（P<0.05），見表3。

2.3??細胞周期分布比較

與對照組和miR-NC組相比，miR-138-5p組G0/G1期細胞比例顯著降低（P<0.05），S期（q=8.636、9.264）和G2/M期細胞比例顯著升高（P<0.05）；與miR-138-5p組、miR-138-5p+pc-NC組相比，miR-?138-5p+pc-CDC5L組G0/G1期細胞比例顯著升高（P<0.05），S期和G2/M期細胞比例顯著降低（P<0.05），見圖1、表4。

2.4??細胞凋亡率比較

與對照組、miR-NC組相比，miR-138-5p組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與miR-138-5p組、miR-?138-5p+pc-NC組相比，miR-138-5p+pc-CDC5L組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見圖2、表5。

2.5??細胞侵襲能力比較

與對照組、miR-NC組相比，miR-138-5p組侵襲細胞數顯著降低（P<0.05）；與miR-138-5p組、miR-138-5p+pc-NC組相比，miR-138-5p+pc-CDC5L組侵襲細胞數顯著增多（P<0.05），見圖3、表5。

2.6??CDC5L、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白水平比較

與對照組、miR-NC組相比，miR-138-5p組CDC5L、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達均顯著降低（P<0.05），E-鈣粘蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與miR-138-5p組、miR-138-5p+pc-NC組相比，miR-?138-5p+pc-CDC5L組CDC5L、N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達均顯著升高（P<0.05），E-鈣粘蛋白表達顯著降低（P<0.05），見圖4、表6。

2.7??雙熒光素酶報告基因檢測結果

生物信息學分析顯示，CDC5L的3'UTR含有miR-138-5p的結合位點，見圖5A。與轉染miR-NC相比，轉染miR-138-5p?mimic后，含有CDC5L-WT的熒光素酶報告基因的活性顯著降低（t=22.862，P<0.05），而CDC5L-MUT的熒光素酶活性未受顯著影響（t=0.645，P＞0.05），見圖5B。

3??討論

細胞周期調節在腫瘤惡性轉化中起關鍵作用。因此，靶向細胞周期對于癌癥治療的研究越來越被關注[12-13]。CDC5L是有絲分裂進程的調節劑，參與了癌癥進展，研究顯示CDC5L的敲低誘導細胞周期停滯在G2/M期并減少肝細胞癌的細胞生長[14-15]；還可抑制膀胱癌[16]、結直腸癌[9]細胞的遷移和侵襲。CDC5L在膠質瘤中具有類似的作用。CDC5L的下調可抑制膠質瘤細胞的增殖，并誘導膠質瘤細胞凋亡[11]。

研究顯示，膠質瘤組織中miR-138-5p的表達低于正常腦組織，其過表達會損害膠質瘤細胞的轉移潛能[7]。因此，miR-138-5p在膠質瘤中主要充當腫瘤抑制因子。在本研究中采用miR-138-5p模擬物轉染U251細胞上調miR-138-5p，結果顯示，miR-138-5p

過表達降低了U251細胞的增殖活力，誘導細胞凋亡，且miR-138-5p過表達降低了U251細胞的侵襲能力，使用蛋白印跡法檢測上皮間充質轉化相關分子的蛋白水平，其中波形蛋白和N-鈣粘蛋白顯著減少，E-鈣粘蛋白增加，表明miR-138-5p在膠質瘤的發展中起抑制作用。

miRNA通過直接與mRNA的3'-非翻譯區結合來降解其靶mRNA或抑制蛋白質翻譯[17-18]，其參與多種生物過程的控制，包括細胞增殖、分化、凋亡和細胞周期進程[19-20]。有研究報道miR-138-5p可通過靶向端粒酶反轉錄酶抑制黑色素瘤中的細胞生長和侵襲[5]。通過在線生物信息學數據庫（miRWalk、TargetScan、miRDB）預測發現，CDCL5是miR-138-5p的靶基因?？紤]到CDC5L在細胞分裂周期中的作用及以往關于CDC5L在癌癥中的報道，本研究選擇CDC5L進行進一步研究，預測miR-138-5p和CDC5L的結合位點。本研究結果顯示，采用RT-qPCR和蛋白印跡法測量CDC5L?mRNA和蛋白水平，miR-138-5p過表達顯著降低了CDC5L表達。流式細胞術結果顯示，轉染miR-138-5p模擬物后，U251細胞中CDC5L的抑制使細胞周期停滯在G2/M期。為了驗證CDC5L是否為miR-138-5p的靶標，在U251細胞中進行了雙熒光素酶報告基因測定，結果顯示，用miR-138-5p模擬物和CDC5L-WT質粒共轉染的細胞中熒光素酶活性降低。此外，本研究在miR-138-5p過表達的基礎上，轉染pcDNA3.1-CDC5L質粒以上調CDC5L表達，結果顯示CDC5L的過表達反轉了miR-138-5p對膠質瘤細胞增殖和侵襲以及誘導凋亡的抑制作用，且消除了G2/M期停滯，表明CDC5L是miR-138-5p在膠質瘤細胞中的下游功能效應物，miR-138-5p可通過CDC5L調節膠質瘤的進展。

綜上所述，過表達miR-138-5p可能通過靶向下調CDC5L，誘導細胞周期停滯在G2/M期，從而抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲。本研究不僅闡明了miR-?138-5p對膠質瘤的調節機制，而且為膠質瘤的診斷和治療提供了新的推定生物標志物和治療靶點，但miR-138-5p在臨床實踐中的應用價值仍需要深入研究。同時本研究尚存在幾個局限性，如未在體內研究miR-138-5p的潛在機制等，因此后續將進行動物實驗以進一步探索miR-138-5p在膠質瘤中的作用。

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（收稿日期：2022–09–08）

（修回日期：2023–02–06）