山柰酚體外促成骨分化作用研究

王文麗 李金諾 劉 陽 李友瑞

濱州醫學院附屬醫院口腔修復科，山東濱州 256603

牙列缺損和牙列缺失是口腔臨床中常見的疾病，隨著臨床治療技術及生物材料應用的發展，種植義齒已成為諸多缺牙患者首選的修復方式。植入位點充足的牙槽骨量是實現種植體骨結合、保證種植修復遠期療效的先決條件[1]。然而，臨床患者的缺牙區常伴有因外傷、根尖周炎、牙周炎等原因導致的骨缺損[2-3]。山柰酚是一種黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和草本植物中，如甘藍、山楂和山柰等，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、神經保護以及預防骨質疏松等功效[4]。近年來，山柰酚在防癌抗癌、預防骨質疏松等方面的研究較多，但在口腔領域中的應用研究較少。基于此，本研究通過體外細胞實驗探討不同濃度的山柰酚對大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖和成骨分化的影響，以期為種植體周圍骨缺損的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

BMSCs 購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。山柰酚、DMEM 培養基、青鏈霉素購于美國Sigma 公司；胎牛血清購于澳洲Clark 公司；CCK8 試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測試劑盒、茜素紅染色試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 山柰酚溶液配制

用電子天平稱量0.57 mg 山柰酚，溶解于10 μl的二甲基亞砜中，將完全溶解的山柰酚溶液移至50 ml離心管內，加入20 ml 的完全培養基混勻，配制成含有10-4mol/L 山柰酚的完全培養基，將其過濾除菌作為母液。其后分別取10-4mol/L 山柰酚母液加入一定量的完全培養基依次稀釋至10-5、10-6、10-7、10-8mol/L，避光放置4℃保存。

1.3 CCK8檢測細胞增殖

將BMSCs 以5000 個/孔接種于96 孔板，培養24 h 后 分 別 加 入 濃 度 為0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L 山柰酚的完全培養基，培養1、4、7 d 后，每孔加入100 μl CCK8 工作液，放入培養箱中孵育1 h，置于酶標儀內檢測450 nm 波長下的光密度（optical density，OD）值，測得不同濃度山柰酚對BMSCs 增殖的影響。

1.4 堿性磷酸酶活性檢測

將BMSCs 以104個/ 孔 接 種 于24 孔 板，培養24 h 后，更換含不同濃度山柰酚的成骨誘導液（DMEM 培養基+10% 胎 牛 血 清+1% 青鏈霉素+1 mmol/L β-甘油磷酸鈉+5 μmol/L 維生素C+100 nmol/L 地塞米松）。結合CCK8 實驗結果，共設4 個分組，實驗組分別加入1 ml 含10-8、10-7、10-6mol/L 山柰酚的成骨誘導液，對照組加入等量不含山柰酚的成骨誘導液。分別培養4、7、14 d 后，按試劑盒要求操作，于酶標儀中檢測405 nm 下的OD值，根據公式，計算每個樣品的堿性磷酸酶活性。

1.5 茜素紅染色

細胞培養與分組同1.4，鈣化誘導14 d 后，棄舊培養基，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定30 min 后，加入PBS 沖洗3 次，每孔加入1 ml 0.1%的茜素紅染色30 min，染色完成后吸棄茜素紅染液，PBS 充分沖洗，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.6 RT-qPCR

細胞培養與分組同1.4，鈣化誘導7 d 后，使用trizol 法提取RNA，并將其反轉錄為cDNA。其后取2 μl cDNA 進行PCR，PCR 引物序列見表1，反應條件為：95℃、30 s，1 個循環；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40 個循環。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（± s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度山柰酚對BMSCs增殖的影響

CCK8 實驗結果如圖1 所示，1 d 時，10-4mol/L山柰酚組的OD 值小于0 mol/L 山柰酚組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），對BMSCs 細胞增殖有抑制作用；10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 山柰酚組 的OD 值與0 mol/L 山柰酚組差異無統計學意義（P＞ 0.05），對BMSCs 增殖無明顯影響。4、7 d 時，10-4mol/L 山柰酚組OD 值仍明顯小于0 mol/L 山柰酚組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；10-8、10-5mol/L 山柰酚組的OD 值與0 mol/L 山柰酚組差異無統計學意義（P＞ 0.05）；10-7、10-6mol/L 山柰酚組的OD 值大于0 mol/L 山柰酚組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。結果表明，10-4mol/L 山柰酚明顯抑制BMSCs 增殖，10-7、10-6mol/L 山柰酚具有促進BMSCs 增殖的作用，且以10-6mol/L 山柰酚促進作用最明顯。

圖1 BMSCs 在不同濃度山柰酚培養基中的增殖情況

2.2 不同濃度山柰酚對BMSCs 堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶活性檢測結果如圖2 所示，4 d 時，各組間的堿性磷酸酶表達差異無統計學意義（P＞ 0.05）。7 d 和14 d 時，10-8mol/L 和10-7mol/L 山柰酚組的堿性磷酸酶表達水平與0 mol/L 山柰酚組差異無統計學意義（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚組的堿性磷酸酶表達水平明顯高于0 mol/L 山柰酚組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。結果表明，10-6mol/L 山柰酚對BMSCs 的堿性磷酸酶活性有明顯促進作用。

圖2 不同濃度的山柰酚對BMSCs 堿性磷酸酶活性的影響

2.3 不同濃度山柰酚對BMSCs 成骨礦化的影響

按照實驗分組礦化誘導BMSCs 14 d 后，茜素紅染色結果如圖3 所示，a、b、c、d 分別為0、10-8、10-7、10-6mol/L 山柰酚組。四組均可見不同程度的礦化結節形成，其中10-6mol/L 山柰酚組形成大面積深染的鈣化結節；與之相比，0、10-8、10-7mol/L 山柰酚組的鈣化結節數量較少。

圖3 倒置顯微鏡觀察茜素紅染色結果（40×）

2.4 不同濃度山柰酚對BMSCs成骨基因表達的影響

RT-qPCR 結果顯示，誘導培養7 d 時，與0 mol/L 山柰酚組相比，10-8mol/L 和10-7mol/L 山柰酚組Runx2 mRNA 的表達差異無統計學意義（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚組Runx2 mRNA 的表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖4。此外，與0 mol/L山柰酚組相比，10-8mol/L和10-7mol/L山柰酚組OCN mRNA的表達差異無統計學意義（P＞ 0.05）；10-6mol/L 山柰酚組OCN mRNA 的表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖5。

圖4 不同濃度的山柰酚對Runx2 mRNA 表達的影響

圖5 不同濃度的山柰酚對OCN mRNA 表達的影響

3 討論

在口腔種植修復中，植入位點常伴有因外傷、牙周炎等原因導致的骨缺損，傳統的自體骨移植和同種異體骨移植是臨床中骨缺損修復的常用方法[5-6]。然而，這些方法存在供骨量有限、需開辟第二術區及免疫原性問題[7]。近年來，基于天然產物的藥物被認為是預防和治療臨床疾病的新治療策略[8]，其中黃酮類化合物的研究最為廣泛[9-10]。山柰酚是一種黃酮類化合物，其具有多種功效，被認為是重要的天然抗炎化合物之一。Devi 等[11]研究表明，山柰酚可以通過調節炎癥相關基因的表達、抑制促炎細胞因子以及調控細胞黏附分子等途徑起到良好的抗炎效果。此外，山柰酚還可有效預防女性更年期骨質疏松。Prouillet 等[12]研究表明，山柰酚通過調節細胞外調節蛋白激酶和雌激素受體的途徑，增加MG-63 成骨樣細胞中堿性磷酸酶活性。Sharma等[13]研究發現山柰酚可通過上調小鼠脛骨骨缺損模型中Runx2 和β-catenin 基因的表達，并通過激活Wnt/β-catenin 信號通路促進人成骨肉瘤細胞的成骨向分化。

本研究使用不同濃度的山柰酚處理BMSCs，觀察細胞增殖、礦化及成骨相關基因表達情況。CCK8結果顯示，10-4mol/L 山柰酚對BMSCs 干預1 d 后，便對細胞增殖起到明顯的抑制作用，該結果與大量研究所表明的高濃度山柰酚具有細胞毒性[14-15]的結果相一致；10-8、10-5mol/L 山柰酚對BMSCs 增殖無明顯作用，10-7、10-6mol/L 山柰酚對BMSCs 增殖有明顯促進作用，其中以10-6mol/L 促進作用更明顯。堿性磷酸酶活性檢測結果顯示，10-8、10-7mol/L 山柰酚對BMSCs 的堿性磷酸酶表達無影響，10-6mol/L山柰酚可使BMSCs 的堿性磷酸酶表達升高，表明10-6mol/L 山柰酚可促進BMSCs 早期的成骨分化。茜素紅染色結果顯示，在10-6mol/L 山柰酚的作用下，細胞形成的鈣化結節較大，且顏色深、數量多，該結果更加直觀地表明10-6mol/L 山柰酚可促進BMSCs 的成骨礦化。此外，RT-qPCR 結果顯示，10-8、10-7mol/L 山柰酚對BMSCs 的Runx2、OCN mRNA 的表達無明顯作用，10-6mol/L 山柰酚可促進Runx2、OCN mRNA的表達，進一步證實了10-6mol/L 山柰酚對BMSCs成骨礦化的促進作用。

綜上所述，10-6mol/L 山柰酚可促進BMSCs 增殖及成骨向分化，這可能為山柰酚應用于種植體周圍骨缺損的修復治療提供一定理論依據。此外，關于山柰酚促進BMSCs 成骨分化的作用機制以及相關動物實驗有待后續進一步研究。