CD34 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

曾紅春，楊育生，鄭維喆，錢(qián)秀紅

1.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院超聲科，上海 201600；2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院病理科，上海 201600

甲狀腺癌具有較高的人群患病率，病理類型多為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。盡管PTC 具有良好的臨床預(yù)后和長(zhǎng)期伴癌生存期，仍有10%～15%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和與癌癥相關(guān)的死亡[2]。既往研究認(rèn)為血管因素參與了甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程，由于PTC 在不同的生長(zhǎng)階段，結(jié)節(jié)內(nèi)部可發(fā)生不同的纖維化和鈣化，微血管數(shù)量也會(huì)隨之發(fā)生變化。迄今，關(guān)于PTC 微血管化狀態(tài)與其臨床病理特征之間的關(guān)系尚存有爭(zhēng)議[3-5]。本研究收集2014年1月—2021年11月在上海市松江區(qū)中心醫(yī)院行甲狀腺手術(shù)患者169 例（176 個(gè)結(jié)節(jié)）的臨床病理資料，擬分析CD34 在PTC及甲狀腺良性結(jié)節(jié)中的表達(dá)，采用全景模式下計(jì)數(shù)單位面積的微血管密度（microvascular density，MVD），比較分析PTC 與甲狀腺良性結(jié)節(jié)間、PTC 侵犯組與無(wú)侵犯組間、PTC 伴或不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 的相關(guān)性，以期進(jìn)一步了解CD34 表達(dá)與其臨床病理特征的內(nèi)在聯(lián)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集在本院行甲狀腺手術(shù)患者169 例（176 個(gè)結(jié)節(jié)）的臨床病理資料，其中，男28 例，女141 例；年齡22～84 歲，平均（53.74±11.54）歲。良性組99個(gè)（結(jié)節(jié)性甲狀腺腫57 個(gè)、橋本氏甲狀腺炎24 個(gè)、濾泡狀腺瘤18 個(gè)），結(jié)節(jié)最大徑0.6～4.0 cm。惡性組77 個(gè)（均為甲狀腺乳頭狀癌），結(jié)節(jié)最大徑0.2～2.5 cm。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①資料完整；②術(shù)前未接受任何治療；③標(biāo)本滿足CD34 染色標(biāo)準(zhǔn)；④CD34 著色良好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①資料不完整者；②術(shù)前接受過(guò)治療者；③標(biāo)本不滿足CD34 染色標(biāo)準(zhǔn)者；④CD34 著色差者。

1.3 方法

①研究分組：病理結(jié)果和臨床資料中顯示有包膜侵犯、脈管或血管侵犯以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移任何一項(xiàng)者為侵犯組，無(wú)上述任何病理特征者為無(wú)侵犯組。按照腫瘤周圍組織是否伴有橋本氏甲狀腺炎，將患者分為橋本氏甲狀腺炎背景和非橋本氏甲狀腺炎背景。

②CD34 免疫組織化學(xué)染色：采用EnVision 二步法染色，石蠟切片4 μm，70℃烘箱不少于1.5 h，石蠟切片脫蠟，用EDTA（pH=8.0）98℃微波修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫，流水沖洗，PBS液（pH=8.0）清洗3次，1 min/次。用0.3%過(guò)氧化氫抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活10 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。CD34 工作液（鼠單抗，克隆號(hào)QBEnd/10）室溫孵育60 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution,PB）（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次。然后用Haopoly-HRP 鼠/兔通用二抗試劑盒室溫孵育15 min，PBS 液（pH=8.0）清洗3 次，1 min/次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色5 min，用流水反復(fù)沖洗，復(fù)染30 s，用1%鹽酸酒精分化，溫水進(jìn)行藍(lán)化、組織脫水透明、樹(shù)膠封片。鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色為CD34 陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo)

采用K-Viewer 病理圖像閱讀器進(jìn)行全景讀片，由兩位高年資醫(yī)生在低倍鏡下（×20）選擇熱點(diǎn)最高的區(qū)域，然后在高倍鏡（×40）下進(jìn)行單位面積下（50 000 μm2）的微血管計(jì)數(shù)（條/單位面積），計(jì)數(shù)3次取平均值；所有數(shù)據(jù)資料均存圖留檔，初次評(píng)估完成后1 周，采用雙盲法按照同樣方法復(fù)測(cè)1 次，兩次結(jié)果取平均值。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：①避開(kāi)壞死液化和纖維化區(qū)；②棕染的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢認(rèn)定為單個(gè)微血管；③獨(dú)立成條或分支結(jié)構(gòu)未中斷者按1 條計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)間MVD 比較

PTC 組CD34 表達(dá)量顯著高于良性組，見(jiàn)圖1、圖2。PTC 組MVD（30.610±11.513）條/單位面積高于良性組（23.160±10.362）條/單位面積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.506，P＜0.001)。

圖1 PTC 組織CD34 表達(dá)，EnVision 法(×200)

圖2 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫CD34 表達(dá)，EnVision 法(×200)

2.2 MVD 與PTC 最大徑的相關(guān)性分析

不同大小PTC 結(jié)節(jié)間MVD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.580，P=0.630），見(jiàn)表1。采用Spearman 相關(guān)性分析PTC 最大徑與MVD 的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PTC 最 大 徑 與MVD 間 無(wú) 相 關(guān) 性（r=-0.052，P=0.651）。

表1 不同大小PTC 結(jié)節(jié)MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

表1 不同大小PTC 結(jié)節(jié)MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

最大徑（mm）≤5（n=33）6～10（n=31）11～15（n=9）＞15（n=4）MVD 24.550±9.757 25.550±9.212 21.440±7.970 21.750±6.238 F 值0.580 P 值0.630

2.3 MVD 與PTC 侵襲性的相關(guān)性分析

PTC 侵犯組與無(wú)侵犯組間MVD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（t=-0.484，P=0.630），見(jiàn)表2。兩組 間Spearman 相關(guān)性分析顯示，MVD 與PTC 侵襲性無(wú)相關(guān)性（r=0.157，P=0.172）。

表2 甲狀腺乳頭狀癌侵犯組與無(wú)侵犯組間MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

表2 甲狀腺乳頭狀癌侵犯組與無(wú)侵犯組間MVD 的比較[(±s),條/單位面積]

組別侵犯組（n=17）無(wú)侵犯組（n=60）MVD 29.410±10.932 30.950±11.739 t 值-0.484 P 值0.630

2.4 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 的比較

PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.651，P=0.517），見(jiàn)表3。橋本背景與非橋本背景PTC 患者發(fā)生侵犯的概率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.085，P=0.771），見(jiàn)表4。

表3 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較[(±s),條/單位面積]

表3 PTC 伴橋本氏甲狀腺炎與不伴橋本氏甲狀腺炎間MVD 比較[(±s),條/單位面積]

不同背景橋本背景（n=14）非橋本背景（n=63）MVD 32.430±13.993 30.210±10.978 t 值0.651 P 值0.517

表4 橋本氏甲狀腺炎背景和非橋本氏甲狀腺炎背景下PTC 侵犯組和非侵犯組間比較

3 討論

新生血管是惡性腫瘤賴以生存的基礎(chǔ)[6]。PTC 結(jié)節(jié)內(nèi)部的微血管狀態(tài)在不同生長(zhǎng)階段呈動(dòng)態(tài)性變化[7-8]。不同的生長(zhǎng)周期，PTC 結(jié)節(jié)可發(fā)生不同程度的纖維化和鈣化，致使微血管結(jié)構(gòu)遭到破壞，PTC 結(jié)節(jié)MVD（38.0±6.1）條/高倍視野低于良性結(jié)節(jié)（62.5±13.5）條/高倍視野（P＜0.05），同時(shí)導(dǎo)致結(jié)節(jié)內(nèi)部微血管分布不均勻，結(jié)節(jié)內(nèi)部的MVD 低于周圍正常甲狀腺組織，PTC 與甲狀腺組織交界處MVD 高于中央?yún)^(qū)[4]。李剛等[9]研究表明超聲造影后PTC 結(jié)節(jié)實(shí)測(cè)值小于灰階超聲模式下的測(cè)量值，而良性結(jié)節(jié)超聲造影測(cè)值與灰階超聲模式下測(cè)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這一征象也間接表明PTC 結(jié)節(jié)的微血管分布狀態(tài)不均衡，周邊的新生血管較中央豐富。因此，既往的研究結(jié)果普遍認(rèn)為PTC 是乏血供的腫瘤。隨著對(duì)PTC 的深入研究，有學(xué)者在超聲造影過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，部分PTC 出現(xiàn)“造影劑滯后”的現(xiàn)象，這部分PTC內(nèi)部MVD 的集成光密度值（integrated optical density value, IOD）明顯高于不出現(xiàn)“造影劑滯后”的結(jié)節(jié)[10]。溫群等[5]研究也顯示PTC 的MVD（51.77±36.50）條/高倍視野高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)（38.48±26.21）條/高倍視野（P＜0.05）,本研究結(jié)果顯示，PTC 組MVD（30.610±11.513）條/單位面積高于良性組（23.160±10.362）條/單 位 面 積（P＜0.05），表 明PTC 也可以具有富血管化的特征。

結(jié)節(jié)大小被認(rèn)為是PTC 的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素，隨PTC 體積增大，BRAFV600E 突變率增加，PTC 體積增大與被膜侵犯、CAF 增生密切相關(guān)[11]。然而，各項(xiàng)研究得出的PTC 最大徑的預(yù)測(cè)診斷界值差別較大，從6.5～40 mm 不等，很難將PTC 的大小直接作為量化的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)[12-14]。導(dǎo)致研究結(jié)果差異性較大的原因可能與PTC 的組織生物學(xué)特性有關(guān)。腫瘤的大小由腫瘤的生長(zhǎng)速度決定，而生長(zhǎng)速度的快慢又與新生血管有著直接關(guān)系。當(dāng)腫瘤快速生長(zhǎng)時(shí)，在多種促血管生成因子的作用下，新生血管大量增生，以滿足快速生長(zhǎng)的需要，此時(shí)PTC 擁有較為豐富的血管網(wǎng)。隨著腫瘤的繼續(xù)增大，腫瘤異質(zhì)性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)可引起新生血管損傷，結(jié)節(jié)內(nèi)部出現(xiàn)纖維化和鈣化，導(dǎo)致PTC 新生血管數(shù)量減少和分布不均衡。因此，不同生長(zhǎng)階段PTC 結(jié)節(jié)的大小與MVD 并非總是呈現(xiàn)為正相關(guān)，本研究結(jié)果顯示不同大小PTC 結(jié)節(jié)與MVD 間無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），這一研究結(jié)果符合PTC 的動(dòng)態(tài)性病理變化。

有研究認(rèn)為MVD 與PTC 的侵襲性相關(guān)，高危組PTC 患者以及有甲狀腺外和局部血管侵犯患者的MVD 顯著高于非侵犯組PTC（P＜0.05）[15]。MVD 除了與血管侵犯有關(guān)外，還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切的相關(guān)性[16]。但在另外一項(xiàng)研究中，MVD 在PTC 伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MVD 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有相關(guān)性[17]。本研究結(jié)果顯示，侵犯組與非侵犯組間MVD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MVD 與PTC 的侵襲性之間無(wú)顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。從PTC 的組織生物學(xué)特性考慮，PTC 在進(jìn)展過(guò)程中新生血管會(huì)遭到動(dòng)態(tài)性破壞，使得血管化的進(jìn)程受到阻遏。橋本氏甲狀腺炎背景與PTC 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性日益受到關(guān)注，有研究顯示，罹患橋本氏甲狀腺炎的患者，甲狀腺惡性腫瘤的發(fā)生率將會(huì)提高，尤其是PTC、甲狀腺髓樣癌和淋巴瘤[18-19]。這部分患者發(fā)生BRAFVE600基因突變的概率明顯高于未合并橋本氏甲狀腺炎的患者[20]。一項(xiàng)關(guān)于PTC 侵襲性風(fēng)險(xiǎn)因素的回歸性研究表明，只有多灶性PTC 合并橋本氏甲狀腺炎是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，而橋本氏甲狀腺炎尚不構(gòu)成獨(dú)立危險(xiǎn)因素[21]。本研究顯示，PTC伴有橋本背景與不伴橋本背景的MVD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PTC 伴有橋本氏甲狀腺炎和不伴有橋本氏甲狀腺炎發(fā)生侵襲性的概率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由于納入研究的橋本氏甲狀腺炎患者的例數(shù)較少，橋本氏甲狀腺炎背景是否是PTC 侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)因素，仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，PTC 的MVD 高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)，這一研究結(jié)果符合惡性腫瘤的組織生物學(xué)特性。而PTC 的血管化狀態(tài)與PTC 的大小、侵襲性及橋本氏甲狀腺炎背景無(wú)明顯相關(guān)性。