腎透明細胞癌中TIPE2、MMP7 的表達及臨床病理意義

齊建軍，王曉蘭，劉舒悅

山東省昌邑市人民醫院腎內科，山東昌邑 261300

腎細胞癌是臨床比較常見的腫瘤之一，腎癌中的主要亞型是腎透明細胞癌，有25%～30%的患者在最初診斷時會有轉移[1-3]。由于腎透明細胞癌的高發病率和高病死率，因此需要尋求影響腎透明細胞癌患者的具有預后價值的分子標記物，有利于其早期診斷、臨床預后的評估。

腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8（ tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like2, TNFAIP8）家族，也叫TIPE 家族，主要作用于維持免疫穩態[4-6]。TIPE2在不同腫瘤中出現表達異常的現象，譬如在胰腺癌、胃癌、乳腺癌中TIPE2 明顯低表達[7-9]，而在非小細胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤中明顯高表達[10-11]。前期研究發現在腎透明細胞癌中TIPE2mRNA 水平明顯增高，提示其可能參與腎透明細胞癌的發生發展[12]。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）是一個能降解細胞外基質的酶家族。能夠參與降解細胞外基質和基底膜，影響腫瘤細胞的進一步生長[13-14]。

本研究通過免疫組織化學方法檢測TIPE、MMP7 蛋白在腎透明細胞癌中的表達情況，并分析TIPE2、MMP7 的表達與常用臨床病理參數的關系及TIPE2 與MMP7 的 關系，收集2013年1月—2020年12月在昌邑市人民醫院病理科行腎透明細胞癌切除手術患者的60 例標本，研究其在腎透明細胞癌中的臨床病理意義，探討TIPE2 在腎臟透明細胞癌中的臨床預后價值。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集于本院行腎透明細胞癌切除手術患者的60 例標本作為實驗組，其中男32 例，女28 例；年齡32～78 歲，年齡≥60 歲34 例，＜60 歲26 例；腫物＞7 cm 14 例，≤7 cm 46 例；腫瘤分化程度：中低分化27 例，高分化33例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期49例，Ⅲ、Ⅳ期11例。隨機選取30 例癌旁正常腎組織（距離癌旁＞2 cm）標本作為對照組。對納入研究組患者通過電話、住院等方式隨訪患者的生存狀況。隨訪時間10～60 個月。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過，患者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：患者術前均未接受放化療；臨床病理資料相對完整；腎透明細胞癌組織均伴有正常腎組織。

排除標準：患者接受放化療；合并其他惡性腫瘤組織；腫瘤周圍無正常腎組織。

1.3 方法

免疫組織化學方法 手術切除標本在10%中性甲醛液固定＞12 h，規范取材后經過既定程序處理。免疫組化實驗組及對照組均采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase, SP）法。TIPE2、MMP7 兔抗人多克隆抗體作為一抗用于試驗組，陰性對照則使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）液替代一抗。一抗（TIPE2、MMP7∶1%BSA 稀釋1∶50），4℃過夜。第2 天，恢復至室溫，常溫加二抗，30 min。滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫，20 min，然后顯色，觀察、分析并拍照。

1.4 觀察指標

免疫組化評分標準：用改良的半定量計分方法，對TIPE2、MMP7 進行評估。TIPE2、MMP7 陽性：于細胞漿內見棕黃色顆粒。染色陽性的腫瘤細胞面積在所有腫瘤細胞中＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，計分0、1、2、3、4 分。根據著色強弱界定-、+、++、+++，計分0、1、2、3 分。根據兩評分的乘積分組，＜4 分列入低表達組，≥4 分列入高表達組，見圖1。

1.5 統計方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件處理，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗，計數資料以頻數及百分比表示，組間差異比較以χ2檢驗。用Pearson 相關性分析方法討論相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIPE2、MMP7 與臨床病理參數間的關系

與正常的腎組織中表達（1/30，3.33%）比較，TIPE2 在腎透明細胞癌中高表達所占比例（19/60，31.67%）對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常的腎組織中表達（2/30，6.66%）比較，MMP7 在腎透明細胞癌中高表達所占比例（21/60，35.00%）對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。TIPE2 高表達在腫瘤不同TNM 分期、不同腫瘤分化程度中對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。但在不同腫瘤大小、患者性別、年齡中對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。MMP7 高表達在腫瘤TNM 分期、不同腫瘤分化程度中對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。但在不同腫瘤大小、患者性別、年齡中對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。TIPE2 高表達的腎透明細胞癌患者顯示預后不良，見圖1。

圖1 TIPE2 表達患者生存曲線

2.2 TIPE2 與MMP7 的相關性分析

TIPE2 的表達與MMP7 的表達呈正相關（r=0.251，P=0.028）。見圖2。

圖2 TIPE2 表達與MMP7 表達相關性

3 討論

腎細胞癌是發生于腎小管上皮的惡性腫瘤，占腎臟腫瘤的大部分，而腎透明細胞癌是腎細胞癌的主要亞型，在腎細胞癌中占比達80%～90%[3]。隨著近幾年分子和精準治療的發展。腎細胞癌的治療和臨床評估也越來越精細。TNM 分期和Fuhrman分級是臨床常用的評估指標，但具有相同病理分期的患者，其預后也會截然不同。因此尋找新的用于預防和評估預后的生物學標記物意義重大。

TIPE2（腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8 樣2，或TNFAIP8L2）是TIPE 家族的成員，最先發現由白細胞表達[15]。它通過作為局部增強子和信號轉導的抑制劑來控制白細胞遷移過程[16]。TIPE2 是炎癥和免疫穩態的重要調節因子，TIPE2 可直接作用于腫瘤細胞或通過免疫細胞間接調節腫瘤的發生發展[17]。有文獻報道，TIPE2 在胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中出現異常表達[7-11]。

Liu QQ 等[18]在實驗中檢測了TIPE2 在肺鱗癌、小細胞肺癌和肺腺癌組織中的表達，實驗揭示與正常肺組織對比，TIPE2 的表達在肺鱗狀細胞癌和小細胞癌中明顯降低。在細胞增殖能力方面，轉染TIPE2 能夠顯著阻礙肺癌細胞的生長，進一步影響腫瘤的形成。但Bordoloi D 等[10]在研究中發現，TIPE2 在非小細胞肺癌和小細胞肺癌組織中表達增高，尤其是在非小細胞肺癌中顯著增高，參與調節肺癌細胞的多種過程。

表1 腎透明細胞癌中TIPE2 表達與臨床病理參數的關系[n(%)]

順鉑作為一種經典的腫瘤化療策略，已被應用于非小細胞肺癌的臨床治療，但存在化療耐藥的缺點。在Guo H 等[19]的研究中發現，與敏感對照組相比，在順鉑耐藥的非小細胞肺癌組織和順鉑耐藥的非小細胞肺癌細胞中TIPE2 表達下調。減少TIPE2的表達有助于細胞對順鉑的抵抗，而TIPE2 的過度表達增強了細胞對順鉑的敏感性，并促進其自噬的過程。異常的TIPE2 表達可能通過以mTOR 依賴的方式干擾非小細胞肺癌中的自噬而導致化療耐藥的發生。TIPE2 可作為克服順鉑耐藥非小細胞肺癌的新治療靶點。以上關于TIPE2 在肺癌組織中的研究結果的不同，可能跟研究者納入的實驗標本、實驗條件、操作方法等有關，也提示TIPE2 在不同的癌癥或者癌癥的不同發展階段起著不同的作用，TIPE2 調控不同的信號通路可能會影響癌癥發生發展的各個方面。

細胞外基質是所有組織和器官的基本核心成分，對多細胞生物的存在至關重要。從有機體發育的最早階段到死亡，它能夠調節和微調身體中的每個細胞過程。在癌癥中，細胞外基質在生化、生物力學、結構和地形水平上發生改變，近年來，對基質在實體瘤中重要性的研究和認識呈指數級增長。隨著研究基質和細胞-基質相互作用各種元素的新技術的進步，眾多研究開始以基質為中心的基質靶向癌癥治療的部署[20]。MMPs 是一組鋅結合內肽酶，負責調節細胞外基質微環境的成分。MMP 的激活與各種其他蛋白酶相互作用，共同調節癌細胞的行為，包括生存能力、細胞分化、程序性細胞死亡、血管生成、免疫監測、侵襲性和遷移能力[21]。最小的MMP 成員MMP7 負責廣泛底物的代謝，包括纖維連接蛋白、卵黃連蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型膠原、聚集蛋白聚糖和蛋白多糖。MMP7 是上皮-間充質轉化（EMT）過程的關鍵蛋白，此外MMP7 通過其促進細胞表面處理細胞因子（如腫瘤壞死因子α）的能力參與炎癥反應及癌癥的發生[22]。

在癌癥治療過程中，腫瘤轉移是治療的難點，發生轉移的基礎是癌細胞亞群具有遷移能力。因此，發現與腫瘤轉移相關的生物標記物是現在亟待解決的重要問題。陳珠峰等[23]研究中，通過免疫組化方法檢測65 例腎細胞癌患者組織及60 例正常腎組織的表達，同時通過ELISA 方法檢測65例腎細胞癌患者與對照組健康人群血清中TIPE2的表達，結果表明TIPE2 蛋白在透明細胞腎細胞癌腫瘤組織高表達[18.46%（12/65）中度陽性，81.54%（21/60）強 陽 性]，癌 旁 組 織 中 弱 表 達[35.00%（21/60）不表達，58.33%（35/60）幾乎不表達]（P＜0.01）。TIPE2 蛋白水平在透明細胞腎癌患者組血清中（均值：4.69 ng/mL；25%～75%區間：2.22～14.03 ng/mL）也高于正常對照組（均值：2.27 ng/mL；25%～75%區間：1.17～5.28 ng/mL）（P＜0.05）。TIPE2在透明細胞腎細胞癌腫瘤及血清中明顯高表達。張冠軍等[24]通過免疫組織化學SP 法檢測78 例腎細胞癌組織及相對應的癌旁腎臟組織中MMP-7的表達情況，證實MMP7 蛋白水平在腎癌組織中也顯著增高（腎細胞癌組織中陽性表達率55.1%，而癌旁正常腎組織基本無表達）（P＜0.05），并與腎細胞癌的浸潤、轉移對比，差異有統計學意義（P＜0.05），與臨床分期有關（r=0.392，P＜0.05），說明TIPE2 、MMP7 表達異常與腎癌的發生有關。在本研究中，通過免疫組化方法檢測TIPE2 、MMP7 在60 例腎癌組織和30 例正常腎組織的表達情況，結果表明TIPE2 在正常的腎組織中表達（1/30，3.33%）和腎透明細胞癌中高表達（19/60，31.67%）對比，差異有統計學意義（P＜0.05），與正常的腎組織中表達（2/30，6.67%）比較，MMP7 在腎透明細胞癌中高表達（21/60，35.00%）對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。TIPE2 高表達在不同腫瘤TNM 分期、腫瘤分化程度中對比，差異有統計學意義（P＜0.05），但與腫瘤大小、患者性別、年齡對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。MMP7 高表達在不同腫瘤TNM 分期、腫瘤分化程度中對比，差異有統計學意義（P＜0.05），但與腫瘤大小、患者性別、年齡對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。并且TIPE2 高表達的腎透明細胞癌患者顯示預后不良（P＜0.05）。這與前期研究結果相符。并且本研究發現TIPE2 在腎透明細胞癌中的表達與MMP7 的表達呈正相關（r=0.251，P=0.028），MMP7 作為EMT調控的關鍵蛋白，提示TIPE2 在腎透明細胞癌中的作用與EMT 過程相關，但是它是如何影響EMT的，將會是進一步研究的重點。

以上實驗結果提示，TIPE2 在腎透明細胞癌組織中明顯高表達，并與腎透明細胞癌的分化低、高TNM 分期高侵襲性因素有一定關聯，高TIPE2 表達的腎透明細胞癌患者明顯預后不良。前述報道，TIPE2 作用于非小細胞肺癌順鉑的耐藥過程，研究TIPE2 在癌癥的發生發展過程其臨床意義重大、有遠大的前景。本研究的實驗數據也為以后更好的研究TIPE2 和腎透明細胞癌的預防、早期診斷、預 測轉移、治療提供一定的理論基礎。