脂肪間充質干細胞對腦出血大鼠自噬的影響及機制探究

范語彤,白兆榮,張耀國,李鵬飛,高俊玲,周洪霞*

(1.華北理工大學基礎醫學院人體解剖學系,河北 唐山 063000;2.河北省慢性疾病基礎醫學重點實驗室暨唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室,河北 唐山 063000)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是由于多種原因(如高血壓、動靜脈血管畸形、腦淀粉樣變性、煙霧病等)誘發的腦實質內血管破裂出血的病理現象,占全部腦卒中患者總數的15%,患者1個月的病死率高達30%～50%,是導致我國居民殘疾和死亡的主要原因之一。雖然ICH在臨床上通過藥物或手術治療取得顯著進展,但預后較差,易導致其他器官功能障礙,需要進一步尋找治療腦出血的有效方法。近年來研究[1]發現間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自我繁殖力強、旁分泌、無免疫排異等生物特性備受關注,可用于治療中樞神經系統疾病的潛在療法。脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)是MSCs中的一種,Han等[2]通過體內外培養ADSCs發現其可分化為神經樣細胞及其他中胚層細胞,并擁有神經形態,其取材方便、分化能力均優于骨髓間充質干細胞。這提示ADSCs可用于治療神經系統疾病的理想干細胞,有廣泛的應用前景。但目前關于ADSCs移植在ICH治療中的應用和研究鮮少報道,其機制仍不清楚。ICH損傷的病理機制包括氧化應激、自噬、凋亡、炎癥反應等,其中自噬是目前關注度較高的機制之一[3]。在ICH大鼠模型中,通過透射電鏡通可觀察到血腫周邊組織細胞中存在大量自噬小體結構,細胞自噬參與調控腦組織的損傷與凋亡[4]。He等[5]研究發現骨髓間充質干細胞移植治療缺血再灌注損傷大鼠,可通過抑制自噬相關蛋白LC3和Beclin1的表達而達到腦保護作用。ADSCs作為與骨髓來源的干細胞有著相似生物特性的中胚層細胞,自噬是否可成為ADSCs發揮作用的潛在治療靶點?因此,本實驗將大鼠脂肪組織來源的干細胞作為治療細胞,通過右側紋狀體注射給腦出血模型,研究ADSCs移植對ICH大鼠治療作用并探討其對自噬的影響及可能作用機制,為臨床上治療腦出血提供新的治療靶點和方向。

1 材 料 與 方 法

1.1主要試劑與儀器 完全培養基12(dulbecco′s modified eagle media:nutrient mixture F-12,DMEM/F12)、Ⅳ型膠原酶均購自美國Hyclon公司;胰蛋白酶、青-鏈霉素購自美國GIBCO BRL公司;異硫氰酸熒光素-黏附分子29(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-29,FITC-CD29)抗體、異硫氰酸熒光素-黏附分子45(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-45,FITC-CD45)抗體、異硫氰酸熒光素-黏附分子90(fluorescein isothiocyanate-adhesion molecular-90,FITC-CD90)抗體均購自美國Biolegend公司,LC3抗體、Beclin1抗體購自日本MBL公司;PV-6000通用型二步法免疫組織化學檢測試劑盒、3,3′-二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物公司;蛋白質定量試劑盒自聯科生物;p-AKT抗體、p-mTOR抗體購自Cell Signaling Technology公司;山羊抗兔IgG HRP購自Biosharp公司;鼠腦立體定位儀購自美國Stoelting公司,微量進樣器購自上海醫學儀器廠,牙科鉆購自深圳瑞沃德公司,OLYMPUS光學顯微鏡、數碼醫學圖像分析系統、全自動顯微鏡掃描系統均購自日本Olympus公司,凝膠成像分析系統、生物分子成像儀購自美國Bio-rad有限公司,透射電子顯微鏡購自日本Hitachi公司,雙轉盤共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2實驗動物及分組 清潔級(specific pathogen free,SPF)雄Sprague-Dawley大鼠220只,8～11周齡,體重(220+80) g,購于北京阜康生物科技股份有限公司,飼養于在華北理工大學實驗動物中心動物房飼養,溫度22～25 ℃,濕度控制在(40±5)%,自由攝水攝食。適應飼養7～10 d后,將其隨機分為3組:Sham組、ICH組和ADSCs組。

1.3方法

1.3.1大鼠ADSCs的分離與培養 隨機選取10只健康6～8周齡SD大鼠,通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)麻醉大鼠,斷頸處死后用75%酒精浸泡約5 min,無菌條件下,在超凈工作臺取大鼠腹股溝部周圍脂肪,將其表面附著的毛細血管剔除干凈后用含有2%雙抗的PBS沖洗三遍,加入1.5 mL完全培養基剪碎脂肪,直到組織變為液體狀,加入氨基酸和葡萄糖(dulbecco′s modified eagle media,DMEM)完全培養基,離心機1 500 r/min離心5 min,廢棄中間分離出的含各組DMEM的培養基,加入含有200 mg/L濃度的Ⅳ型膠原酶溶液,于37 ℃水浴箱中消化60 min,消化完成后,離心機1 000 r/min離心5 min,廢棄上清液,于細胞沉淀中加入DMEM完全培養基吹打重懸細胞并接種于培養瓶中。放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養,細胞穩定3 d后換液,細胞濃度鋪滿培養瓶底95%后進行傳代。

1.3.2鑒定ADSCs免疫表型 收集第4代生長良好的脂肪間充質干細胞制備細胞懸液,4 ℃保存備用,離心機1 000 r/min離心10 min,棄上清液,4支流式細胞管收集細胞,滴加磷酸鹽緩沖液(細胞密度為1×103個/μL),每支100 μL,其中3支分別滴加FITC標記的兔抗大鼠CD29、CD45和CD90(稀釋倍數為1∶30)各10 μL(細胞密度1×103個/μL),另1支作為空白對照,4 ℃避光孵育40 min,再次離心機1 000 r/min離心5 min,廢棄上清液,磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸細胞,流式細胞儀上檢測細胞的CD29、CD45和CD90陽性表達率。

1.3.3腦出血模型制備 制備ICH模型的大鼠需進行術前8 h禁食、禁水6 h,ICH組和ADSCs組采用大鼠自體尾動脈血注血法[6]。ICH組:大鼠稱重后,用3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)經腹腔注射,麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上,從大鼠尾動脈抽取55 μL自體血緩慢注入大鼠右側基底節(前囪后0.2 mm,旁開3.5 mm,深6 mm),以10 μL/min的速度注血,注射完成后留針5min后退針2 mm,再留針3 min,以1 mm/min的速度緩慢退針防止血液反流,隨后骨蠟密封,縫合頭皮,將大鼠放置恒溫室觀察至動物蘇醒。Sham組按同樣的方法但不注入自體血。ADSCs組:ICH模型造模成功2 h后,于大鼠右側紋狀體區域注射5 μL含有1×105個ADSCs,Sham組和ICH組相同位置給予同等劑量生理鹽水。

1.3.4大鼠神經功能評分 待術畢各組大鼠清醒后按照改良的Zea-Longa[7]由輕到重8級(0～7分)評分標準法對大鼠進行神經功能缺損評分:大鼠無任何不對稱神經缺損行為0分;提起尾倒掛時左前肢不能完全伸展為1分;于1分的基礎上左前肢活動出現明顯障礙為2分;大鼠左前肢緊貼胸壁為3分;大鼠自由活動行走時向左側轉圈為4分;行走時伴有明顯左前后爪后推動作為5分;圍繞原地旋轉為6分;左側完全不能行走,躺向左側為7分。

1.3.5腦組織取材及病理觀察 在各組大鼠術后對應的各時間點,將大鼠用3%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)深度麻醉后,打開大鼠胸腔,于心臟主動脈處先用至少40 mL的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)灌注后再用至少200 mL的4%多聚甲醛灌注20 min后剖取完整腦組織。于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24 h以上,用于以下實驗:蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)、尼氏染色及免疫組織化學檢測。

1.3.6腦組織HE染色 制備好的石蠟切片脫蠟至水后,蘇木素染核1 min,90%鹽酸酒精分化8 s,自來水中返藍8 min后,伊紅染色30 s,經乙醇低濃度到高濃度梯度迅速分化,再經二甲苯透明、中性樹膠封片,常溫晾干后用顯微鏡觀察腦組織病理變化并采圖。

1.3.7腦組織尼氏染色 將石蠟切片常規脫蠟至水后于37 ℃焦油紫染色液浸染1 h。由低濃度到高濃度梯度的乙醇迅速分化,后經二甲苯脫水、中性樹膠封片,常溫晾干后用顯微鏡觀察未受損神經元數量并采圖。

1.3.8腦組織含水量(brain water content,BWC)測定 將取得的前半部分立體定位注射周圍厚度為2 mm腦組織,用濾紙吸干腦組織表面的血液和水分,用電子分析天平稱出濕重記錄后放入恒溫箱內100 ℃烘至恒重后測干重。按Elliott公式計算腦組織含水量(BWC%)=[(腦濕重-腦干重)/腦濕重]×100%。

1.3.9免疫組織化學檢測 腦組織石蠟切片脫蠟至水,高壓鍋高壓抗原修復3 min充分暴露抗原決定簇后,加入3%內源性過氧化物酶阻斷劑溫室封閉15 min,分別滴加稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育箱中孵育30 min,再滴加DAB顯色劑濕盒中避光顯色3～5 min,于顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒,純水終止反應,蘇木素復染核,經梯度酒精脫水,二甲苯脫水、透明、干燥后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、記錄并分析。分別測定LC3、Beclin1、p-AKT、p-mTOR的表達水平。

1.3.10Western Blot檢測 每只稱取腦組織60～80 mg,少量液氮冷卻后使用組織研磨儀研磨至粉末狀,加入蛋白裂解液,離心后取上清,提取蛋白后用蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。凝膠電泳分離蛋白,轉至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,上樣完電泳1 h,恒流220 mA,5%的封閉液搖床上封閉2 h,Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,加入Ⅱ抗孵育2 h后,用電化學發光(enhanced chemiluminescent,ECL)顯影后分析蛋白條帶灰度值。分別測定LC3、Beclin1、p-AKT、p-mTOR的蛋白表達水平。

1.4統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗;大鼠術后不同時間點神經學檢查評分、腦組織未受損神經元計數和腦組織水含量采用重復測量方差分析。應用Graphad prism8.0和Image J繪制數據結果和圖片。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠ADSCs的鑒定 運用流式細胞術檢測ADSCs表面標記物,所培養的大鼠細胞中黏附分子CD29和CD90的陽性率分別為96.6%、96.7%,CD29、CD90呈陽性表達,CD45的陽性率為0.37%,CD45呈陰性表達。結果提示培養的細胞符合脂肪間充質干細胞純度的評價標準(圖1)。

圖1 ADSCs 表面標記物的流式細胞術檢測結果A.CD29;B.CD90;C.CD45Figure 1 Results of flow cytometry de-tection of surface markers of ADSCs

2.2ADSCs移植后可改善ICH大鼠神經功能障礙 實驗取各組術后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d對大鼠進行Zea Longa神經功能評分。Sham組大鼠在完全清醒后未出現行為學改變,反應靈敏,與假手術組大鼠相比較,ICH組大鼠神經功能評分顯著升高,于術后12 h逐漸升高,3 d達至高峰,之后逐漸下降(P<0.05);與ICH組相比較,ADSCs組對應的各時間點神經功能評分明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。結果提示脂肪間充質干細胞移植可改善腦出血大鼠神經功能障礙。

表1 不同時間點大鼠神經學檢查評分比較Table 1 Comparison of neurological examination scores of rats at different time points 分)

2.3ADSCs移植可改善ICH大鼠腦損傷程度 光學顯微鏡下觀察腦組織HE染色結果顯示,假手術組腦組織完整,細胞排列整齊、間質無水腫、無炎性細胞浸潤。與Sham組比較,ICH組腦出血后第3天大鼠腦組織基底節周圍明顯占位效應,大鼠腦組織可見大量紅細胞,細胞間隙變大、水腫,炎細胞浸潤及大量神經細胞變性壞死,此現象至5 d后有所緩解。與模型組相比,ADSCs組對應的各時間點大鼠腦組織病理癥狀均明顯減輕,較少的紅細胞,水腫減少以及較少的神經細胞壞死(圖2)。結果提示脂肪間充質干細胞移植可改善腦出血大鼠腦損傷程度。

圖2 各組大鼠腦組織染色結果(HE染色)

2.4ADSCs移植治療ICH大鼠減少未受損神經元數量 假手術組神經元細胞尼氏小體形態完整,數量較多。與Sham組相比,ICH組神經細胞尼氏小體結構破壞嚴重,細胞皺縮,核碎裂,體積減小,12 h未受損的神經元數量開始減少,至3 d時受損的神經元數量達至高峰,5 d后逐漸增多,隨機選取5個高倍視野,對細胞核完整的神經元進行計數,差異有統計學意義(P<0.05)。與ICH組相比,ADSCs組相應的各時間點神經元細胞尼氏小體數量明顯增加,差異均有統計學意(P<0.05)。結果提示脂肪間充質干細胞移植治療腦出血大鼠可發揮神經保護作用見圖3,表2。

圖3 各組大鼠神經細胞尼氏染色結果

表2 各組大鼠腦組織未受損神經元計數Table 2 Counts of undamaged neurons in brain tissue of rats in each group 個)

2.5ADSCs移植改善ICH大鼠腦組織水腫 Sham組大鼠術后腦組織7 d前各時間點幾乎無明顯的變化。ICH組12 h后腦組織水含量開始升高,至3 d達高峰,隨后降低,ADSCs組的腦組織含水量變化趨勢與ICH組基本一致,與Sham組相比,ICH組各時間點差異有統計學意義(P<0.05)。與ICH組相比,ADSCs組各時間點腦組織水含量降低,差異有統計學意義(P<0.05),結果提示脂肪間充質干細胞移植可改善腦出血大鼠腦組織水腫情況,見表3。

表3 腦組織水含量變化Table 3 Changes of water content in brain tissue

2.6ADSCs移植抑制LC3、Beclin1陽性細胞表達 與Sham組相比,ICH組7 d內LC3、Beclin1陽性細胞的表達顯著增多;與模型組相比,ADSCs組各時間點LC3、Beclin1陽性細胞的表達顏色較淺,數量明顯降低;免疫組化法下,LC3、Beclin1陽性表達為棕褐色,LC3、Beclin1陽性表達情況與各蛋白表達水平相符。ADSCs移植后自噬相關蛋白LC3、Beclin1的陽性表達明顯降低(圖4,5),提示脂肪間充質干細胞移植后可能抑制自噬的過度激活。

圖4 Beclin1在大鼠腦組織的表達結果(免疫組織化學染色 ×400)

圖5 LC3在大鼠腦組織的表達結果(免疫組織化學染色 ×400)

2.7ADSCs移植增加p-AKT、p-mTOR的陽性細胞表達 與Sham組相比,ICH組7 d內p-AKT、p-mTOR陽性細胞的表達明顯增加;與模型組相比,ADSCs組各時間點p-AKT、p-mTOR陽性細胞的表達顏色較深,數量明顯增多;免疫組織化學法下,p-AKT、p-mTOR陽性表達為棕褐色,p-AKT、p-mTOR陽性表達情況與各蛋白表達水平相符。ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內p-AKT、p-mTOR陽性表達明顯增強(圖6,7)。結果提示脂肪間充質移植治療腦出血大鼠可能激活AKT/mTOR信號通路。

圖6 p-AKT在大鼠腦組織的表達結果(免疫組織化學染色 ×400)

圖7 p-mTOR在大鼠腦組織的表達結果(免疫組織化學染色 ×400)

2.8ADSCs移植通過激活AKT/mTOR通路抑制ICH大鼠自噬活性 為了進一步探討脂肪間充質干細胞移植治療腦出血的作用機制,本次實驗用Western Blot檢測3組大鼠1 d、3 d腦組織中自噬相關蛋白LC3、Beclin1及自噬相關通路蛋白p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達情況。與Sham組相比,ICH組LC3、Beclin1的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與ICH組相比,ADSCs組LC3、Beclin1的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內LC3、Beclin1蛋白表達水平明顯降低(圖8,表4,5);與Sham組相比,ICH組AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白的表達水平明顯下降(P<0.05);與ICH組相比,ADSCs組AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白的表達水平明顯升高;ADSCs移植后腦出血大鼠腦組織內AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白的表達水平明顯增強(P<0.05);結果提示脂肪間充質干細胞可能通過激活AKT/mTOR信號通路抑制自噬而達到神經保護作用(圖9,表6,7)。

圖8 免疫印跡法檢測LC3、Beclin1蛋白的表達結果

表4 免疫印跡法檢測各組LC3、Beclin1蛋白1 d的表達結果Table 4 Expression results of LC3 and Beclin1 proteins detected by Western blot in each group at 1 d

表5 免疫印跡法檢測各組LC3、Beclin1蛋白3 d的表達結果Table 5 Expression results of LC3 and Beclin1 proteins detected by Western Blot in each group at 3 d

圖9 免疫印跡法檢測AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白的表達結果

表6 免疫印跡法檢測各組AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白1 d的表達結果Table 6 The expression of phosphorylated protein of AKT/mTOR signaling pathway detected by Western Blot in each group at 1 d

表7 免疫印跡法檢測各組AKT/mTOR信號通路磷酸化蛋白3 d的表達結果Table 7 The expression of phosphorylated protein of AKT/ mTOR signaling pathway detected by Western blot in each group at 3 d

3 討 論

ICH的致殘率和致死率均較高,目前臨床上主要運用手術和藥物治療方案,但腦出血患者預后極差,仍不可避免的長期遭受由于血腫周圍繼發性損傷帶來的嚴重殘疾障礙,給其家庭和社會帶來沉重的精神和經濟負擔[8]。因此進一步研究ICH的發病機制和發現安全有效的治療方案對于ICH患者至關重要。ICH后神經損傷不可再生是導致患者預后較差的主要原因之一[9],MSCs移植是目前再生醫學研究的熱門,MSCs多向分化潛能在一定條件下,可分化為多種組織細胞,一定程度上可修復受損的組織[10]。隨著對不同來源的MSCs研究的深入,因ADSCs來源豐富、取材方便且免疫排斥小等特點,受到越來越多研究者們的青睞。人體脂肪中含有充足的ADSCs,每毫升脂劑中干細胞比骨髓中干細胞數高約8倍。即使老齡患者來源的ADSCs也具有取材方便且抗衰老能力強等優點[11]。ADSCs可分化為神經樣細胞及其他中胚層細胞,并擁有神經形態[12]。Gómez-Pinedo等[13]研究發現ADSCs移植腦卒中小鼠,修復受損腦組織內的膠質細胞源性神經營養因子和腦源性神經營養因子分泌,促進血管生成,從而恢復大鼠神經功能?？梢?ADSCs有望成為治療ICH的良好種子,但目前關于ADSCs移植治療ICH的研究鮮少報道。為探究ADSCs移植對ICH后引起的繼發性損傷的影響,本實驗采用右側紋狀體的注射方式將ADSCs移植到大鼠腦內,結果顯示與ICH組相比,ADSCs移植后的7 d內明顯改善了ICH大鼠神經功能障礙、減少神經細胞的壞死以及減輕腦組織水腫情況。提示ADSCs移植有效改善腦出血大鼠的神經功能,但具體機制尚未完全明確。

腦出血的病理機制主要包括原發性腦損傷和繼發性腦損傷,原發性腦損傷是腦出血后血腫對鄰近腦組織的占位效應。繼發性腦損傷是在原發性腦損傷的基礎上引起周圍腦組織發生連鎖的病理生理反應如炎癥、細胞凋亡、自噬、脂質過氧化等[14]。其中自噬過度激活會導致多種疾病繼發性損傷,甚至導致細胞死亡[15]。研究發現抑制自噬活性可減輕ICH后引起的繼發性腦損傷[16]。因此,尋找有效的治療藥物抑制細胞自噬,對治療腦出血疾病有重要意義。Mazen等[17]研究發現ADSCs移植對大鼠小腦損傷有一定修復作用。自噬的調節作為MSCs治療應用中的潛在治療靶點[18]。為探究ADSCs移植是否通過抑制自噬活性減輕ICH后引起的繼發性損傷。本實驗采用免疫組織化學和Western Blot法對自噬重要的蛋白標記物LC3和自噬啟動的標志Beclin1進行了檢測,結果顯示,與ICH組相比,ADSCs移植后,損傷的腦組織中自噬相關蛋白LC3、Beclin1的表達及表達量明顯降低,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化能力被降低,抑制了自噬水平,提示ADSCs移植治療ICH改善大鼠神經功能的障礙、減少神經細胞的壞死以及減輕腦組織水腫情況與抑制自噬活性有關。如何實現自噬抑制需要進一步探討。

近年來,AKT/mTOR信號通路在腦出血中的作用成為研究熱點,在細胞的增殖、凋亡、自噬以及生長等過程中發揮著重要的作用[19]。該通路已被證實在誘導細胞自噬的發生發展方面發揮了最直接的調控作用[20],該通路中mTOR即是大分子底物復合物,又是哺乳動物中雷帕霉素的分子靶標如ULJ1、atg13等因子。mTOR的活化可對自噬產生負調節作用,磷酸化的AKT可激活mTOR,mTOR將ULK1激酶充分激活后會抑制下游分子ULK1復合物從而有效抑制自噬。在神經疾病動物模型中通過PI3K/AKT/mTOR信號通路能減少神經元損傷、促進新生血管生成等[21-22]。Yan等[23]研究發現加巴噴丁通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制神經細胞自噬和活性氧的水平,進而對腦缺血再灌注損傷發揮神經保護作用。Xu等[24]研究發現ADSCs通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路減少細胞凋亡,改善二氯化二丁基錫誘導的慢性胰腺炎。在本研究中,ADSCs移植后,Western Blot檢測結果顯示,與ICH模型組相比,腦組織中AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達增加,LC3、Beclin1的蛋白表達隨之降低,與免疫組織化學結果一致。提示ADSCs移植治療ICH可能激活AKT/mTOR信號通路抑制細胞自噬,發揮神經功能保護性作用。

綜上所述,ICH后及時進行ADSCs的移植對修復出血周圍繼發性腦組織損傷,恢復神經功能有積極的促進作用,也為臨床治療腦出血提供新的方向和治療靶點。本實驗中ADSCs移植后未進行透射電鏡觀察自噬小體的變化,且ADSCs移植治療ICH的具體作用機制尚不能完全明確以及缺少移植后進行長期療效的研究。ADSCs在體內分化機制、旁分泌、免疫調節等良好的生物特性,其最佳的移植時間窗、治療劑量及植入途徑等都需作進一步的研究和探索。