lncRNA SNHG12促進宮頸癌SiHa細胞遷移、侵襲和抑制細胞凋亡

王 旭,徐 靜,滑 芳,王玉凈,都治香

(河北醫科大學第一醫院婦產科,河北 石家莊 050031)

宮頸癌(cervical cancer,CC)是常見的女性癌癥之一[1]。研究證實,在大多數宮頸癌病例中發現了人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染[2],雖然HPV疫苗的出現降低了感染發生率,宮頸癌早期診斷的治療效果有所提高,但在晚期和預防化療耐藥發展方面仍存在許多挑戰[3]。研究發現,包括非編碼RNA在內的其他輔助因子,已經證實與宮頸癌的發生發展相關,因此探究其他基因變異對于了解子宮頸癌的發病機制至關重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為一種非編碼RNA,與宮頸癌發生發展密切相關,隨著研究的深入發現lncRNA異常表達可誘發癌變,并與癌癥患者預后不良有關。易彬彬等[4]研究發現,HOTAIR與宮頸癌易感性相關;邵學成等[5]研究發現,HOTAIR,ANRIL,H19多種lncRNAs在宮頸癌中異常表達,并與其發病機制相關。lncRNA核仁小分子宿主基因12(small nucleolar host gene12,SNHG12)位在染色體1p35.3區域,抑制SNHG12通過阻斷G0/G1期細胞周期進程可抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力[6];在結直腸癌中,SNHG12可以充當miR-16的海綿促進結腸癌細胞的增殖、遷移[7];SNHG12還可以在肝癌、肺癌等多種癌癥中促進腫瘤生長[8-9]?，F階段SNHG12在宮頸癌中的作用上尚不明確。本研究旨在闡述體內外試驗中SNHG12對宮頸癌SiHa細胞的部分生物行為調控能力,參與宮頸癌的發生發展。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2018年6月—2021年5月于河北醫科大學第一醫院經病理確診的宮頸癌患者45例,年齡(48.82±13.26)歲,收集手術切除的腫瘤標本及癌旁正常組織。

本研究經醫院倫理委員會批準通過。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2宮頸癌細胞培養和轉染 本研究所用HaCaT,C33A,SiHa和CasKi細胞株,培養液:RPMI 1640并添加10%胎牛血清,抗生素100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。功能性試驗選取SiHa細胞,將SiHa細胞分為NC組,SNHG12組,siNC組和SNHG12 siRNA組,應用轉染試劑LipofectamineTM 2000試劑,SiHa細胞轉染SNHG12過表達質粒,SNHG12 siRNA以及對應的陰性對照。

1.3RNA提取及實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 使用Trizol從SiHa細胞系或河北醫科大學第一醫院收集的宮頸癌組織樣本中提取總RNA,采用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA,進行試驗。試驗結果以2-△△CT值形式表示。

1.4CCK8試驗 將NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細胞接種于96孔板,參照CCK-8試劑盒操作說明書指示進行細胞增殖試驗檢測,37 ℃孵育1～2 h,將其置于酶聯免疫檢測儀上,在450 nm下測量吸光。

1.5流式細胞法 將NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細胞收集于5 mL流式離心管中,4 ℃預冷的70%乙醇固定各組宮頸癌SiHa細胞1 h。流式細胞儀檢測細胞周期。

1.6Transwell試驗 SiHa細胞Matrigel膠對小室包被,將各組SiHa細胞懸液200 μL置于Transwell上室,下室加入600 μL10%胎牛血清培養基,恒溫培養箱培養24 h。取出腔室后,將小室用95%乙醇中固定10 min。0.5%結晶紫染色10 min,輕拭去Transwell小室上層細胞,顯微鏡觀察下層細胞。

1.7細胞劃痕試驗 NC組、SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組SiHa細胞置于6孔板上,當細胞匯合度達到80%～90%時,200 μL移液器槍頭在正中央位置劃一直線,形成單層細胞間劃痕,分別觀察SiHa細胞顯微鏡下切片。

1.8Tunel試驗 在4%多聚甲醛中固定NC組,SNHG12組、siNC組、SNHG12 siRNA組宮頸癌SiHa細胞30～60 min,0.3% H2O2孵育(37 ℃,20 min),50 μL生物素標記液孵育(37 ℃,60 min)。0.1～0.3 mL標記反應終止液,37 ℃孵育10 min,50 μL Streptavidin-HRP工作液,37 ℃,30 min,滴加0.2～0.5 mL DAB顯色液,用蘇木素染色液進行細胞核染色。95%乙醇脫水5 min,100%乙醇脫水2次(3 min/次),甲苯透明2次(5 min/次),顯微鏡下觀察切片。

1.9動物模型 BALB/c裸鼠24只,6～8周,體重13～19 g,隨機分為NC組,SNHG12組,siNC組,SNHG12 siRNA組,每組6只。SiHa細胞分別轉染轉染SNHG12過表達質粒,SNHG12 siRNA以及對應的陰性對照,1 mL注射器將轉染好的SiHa細胞懸液注射到各組裸鼠右后肢腋部皮下(1×106個/只),21 d建模成功。

1.10免疫組織化學 將小鼠宮頸癌組織切片脫蠟入水,加熱修復抗原,5%正常羊血清封閉(37 ℃,60 min)。1∶100比例稀釋的Ki67抗體,4 ℃過夜。加入兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37 ℃,30 min。DAB顯色,蘇木精染色2 min,脫水,封片。

1.11統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1SNHG12在宮頸癌組織和多種細胞株中表達 qRT-PCR檢測SNHG12在宮頸癌組織中的表達,宮頸癌組織中SNHG12mRNA相對表達顯著高于癌旁組織(2.58±0.21vs.1.01±0.10,t=45.280,P<0.001), 同時在相比正常細胞HaCaT,SNHG12在宮頸癌細胞株C33A、SiHa和CasKi中表達水平也均顯著升高,其中在SiHa細胞中表達量最高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。后續細胞試驗以SiHa為目標細胞。提示SNHG12異常表達的變化情況可能和宮頸癌有關。

表1 SNHG12在宮頸癌組織和細胞株中表達Table 1 Expression of SNHG12 in cervical cancer tissues and cell lines

2.2SNHG12調控SiHa細胞增殖和周期 將SNHG12或siSNHG12轉染SiHa細胞后,采用qRT-PCR檢測發現,相比NC組,SNHG12或siSNHG12的表達水平顯著升高或降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。證明轉染成功。采用CCK8法檢測SNHG12對SiHa細胞的增殖能力,結果發現,SNHG12組SiHa細胞的增殖顯著增加,而siSNHG12組SiHa細胞增殖能力降低。采用流式細胞法檢測發現,SNHG12組能促進S期阻滯,而siSNHG12組則產生了相反的結論,可抑制SiHa細胞的增殖以及S期阻滯,提示SNHG12能對SiHa細胞增殖和周期具有一定的調控能力。見表2,3。

2.3SNHG12調控SiHa細胞的侵襲、遷移及凋亡 Transwell試驗檢測SNHG12對SiHa細胞侵襲的能力,結果發現與正常組相比,SNHG12組能促進SiHa細胞侵襲的能力,細胞穿孔數明顯增加。而siSNHG12組,細胞穿孔數顯著降低,抑制了SiHa細胞的侵襲能力(圖1A)。Tunel細胞凋亡試驗結果顯示,SNHG12組的SiHa細胞凋亡率顯著減少,siSNHG12組促進了SiHa細胞凋亡(圖1B)。細胞劃痕試驗結果顯示,SNHG12組促進SiHa細胞的遷移率,siSNHG12組抑制SiHa細胞的遷移能力(圖1C)。提示SNHG12能調控SiHa細胞的部分生物行為。

表2 SNHG12對宮頸癌SiHa細胞增殖和周期影響Table 2 Effects of SNHG12 on proliferation and cycle of cervical cancer SiHa cells

表3 siSNHG12對宮頸癌SiHa細胞增殖和周期影響Table 3 Effects of siSNHG12 on proliferation and cycle of cervical cancer SiHa cells

圖1 SNHG12調控SiHa細胞的侵襲、遷移及凋亡

2.4構建宮頸癌裸鼠通過體內試驗檢測增殖情況 利用SiHa細胞構建了宮頸癌小鼠模型,21 d后剝離瘤體稱重并選取組織進行切片,結果顯示,SNHG12組腫瘤重量高于NC對照組,而SiSNHG12組腫瘤重量低于SiNC對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),說明表達SNHG12促進了裸鼠腫瘤生長,而干擾SNHG12則相反抑制了腫瘤生長,見表4,5。Ki67試驗檢測皮下宮頸癌細胞核中陽性染色細胞所占的百分比,結果顯示,上調SNHG12的陽性信號顯著高于正常對照組,下調SNHG12則結論相反(圖2),提示SNHG12能在體內試驗中加強增殖能力,促進腫瘤生長,而通過RNA干擾技術,則能產生則能抑制宮頸癌細胞增殖。

表4 SNHG12組腫瘤重量Table 4 Tumor weights of SNHG12 group

表5 siSNHG12組腫瘤重量Table 5 Tumor weights of siSNHG12 group

圖2 Ki67檢測小鼠腫瘤增殖(蘇木精染色,Scale bar=50 μm,×200)

3 討 論

本研究結果顯示,在宮頸癌組織和細胞中,SNHG12異常高表達,過表達SNHG12能促進宮頸癌SiHa惡性生物學行為,而干擾SNHG12則出現了相反的結論,隨后構建動物模型進行驗證,發現在體內試驗中SNHG12能加強增殖能力,促進腫瘤生長,而通過RNA干擾技術,沉默SNHG12后則能產生抗宮頸癌的調控機制,充分說明SNHG12促進宮頸癌細胞SiHa細胞增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,參與宮頸癌的發生發展。

宮頸癌相關研究發現,lncRNA UCA1在宮頸癌組織中表達升高,UCA1水平高的患者生存時間短,并通過細胞試驗發現Lnc-RNA UCA1通過靶向miR-155調控宮頸癌細胞EMT的發生[10]。LncRNA TP73-AS1宮頸癌細胞中上調,并能促進宮頸癌細胞的增殖和遷移能力,進一步的挽救試驗證實TP73-AS1通過miR-329-3p/ARF1調控宮頸細胞的增殖和遷移,TP73-AS1可能成為一種新的宮頸癌調控因子[11]。LncRNA SOX2OT通過調控SOX2影響宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲[12]。有多種lncRNAs與宮頸癌發病機制相關,但現階段SNHG12在宮頸癌中的相關作用機制暫未發現。

SNHG12作為一種新型lncRNA,近年來已發現在多種癌癥中呈現異常高表達[13],比如SNHG12在卵巢癌組織中表達高于正常組織,同時高水平SNHG12卵巢癌患者的5年生存率明顯低于低水平組[14]。Chen等[15]研究發現,lncRNA SNHG12通過海綿細胞miR-133b調控前列腺癌的預后并促進腫瘤的發生。Zhang等[16]研究發現SNHG12通過激活PI3K/AKT通路誘導胃癌發生。本研究中,發現SNHG12在宮頸癌組織和C33A、SiHa和CasKi等多種細胞株均高表達,說明SNHG12異常表達的變化情況可能和宮頸癌有密切關系。

相比較宮頸癌細胞C33A和CasKi,SNHG12在SiHa細胞表達最高,因此后續細胞試驗以SiHa為目標細胞進行功能性試驗,發現lncRNA SNHG12促進宮頸癌SiHa細胞的增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,而干擾SNHG12則出現了相反的結論,可以抑制宮頸癌細胞的增殖、周期、侵襲、遷移并促進凋亡。說明SNHG12能夠調控宮頸癌SiHa細胞的部分生物行為,參與宮頸癌的發生發展[17-19]。為了驗證細胞試驗的結論,利用SiHa細胞構建宮頸癌裸鼠移植瘤模型,發現過表達SNHG12促進了裸鼠腫瘤生長,干擾SNHG12則抑制了腫瘤生長。上調SNHG12的陽性信號顯著高于正常對照組,而下調SNHG12則結論相反,提示SNHG12能加強增殖能力,促進腫瘤生長,而通過RNA干擾技術,沉默SNHG12后則能產生抗宮頸癌的調控機制。

綜上所述,SNHG12促進SiHa細胞增殖、周期、侵襲、遷移及抑制凋亡,參與宮頸癌的發生發展。因此SNHG12可能成為宮頸癌診斷及治療的新靶點。