血清miRNA-210、miRNA-223預測新生兒缺血缺氧性腦病預后的臨床價值

趙 穎,馬彤輝,郝淑娟

(1.河北省保定市第二中心醫院新生兒科,河北 保定 072750;2.河北省保定市第二中心醫院兒科,河北 保定 072750)

新生兒缺血缺氧性腦病圍產期缺氧窒息導致的腦缺氧缺血損害,導致新生兒智力障礙、腦癱等,可引起一系列腦病,隨著疾病進展可導致新生兒死亡[1-2]。因此,及時發現并評估新生兒缺血缺氧性腦病嚴重程度對改善患兒預后具有重要意義。但目前可有效評估新生兒缺血缺氧性腦病嚴重程度的生物學指標較少,尋找可及時、準確評估新生兒缺血缺氧性腦病嚴重程度及預后的生物學指標是臨床研究重點[3-4]。微小核糖核酸(mircoRNA,miRNA)是一類非編碼小RNA分析,在中樞神經系統發育、信號通路調節等過程中起到重要作用,在心腦血管疾病診治中具有重要意義。血清微小RNA-210(mircoRNA-210,miRNA-210)在大腦缺氧缺血性腦水腫中的作用已有報道,微小RNA-223(mircoRNA-223,miRNA-210)水平在心肌損傷相關疾病的作用已被證實,但目前關于miRNA-210、miRNA-223與新生兒缺血缺氧性腦病病情嚴重程度及預后的關系的尚無報道[5-6]。基于此,本研究通過檢測不同疾病嚴重程度及不同預后患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達情況,了解其表達變化與患兒病情嚴重程度及預后的關系,旨在為新生兒缺血缺氧性腦病預后評估及臨床治療提供依據。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2019年8月—2021年8月本院新生兒缺血缺氧性腦病患兒124例作為觀察組進行回顧性分析,依據患兒病情嚴重程度將患兒分為輕度組51例、中度組40例、重度組33例,并選取同期60例健康新生兒作為對照組。隨訪兒出生后28 d內預后情況將患兒分為生存組81例與死亡組43例。

納入標準:①符合《新生兒缺氧缺血性腦病的診斷和治療》[7]中的相關診斷標準,出生24 h內經MRI確認存在腦損傷;②入院時間超過1周;③入院時采用新生兒阿氏評分[8](Apgar scores,Apgar)進行評估,出生5 min時Apgar評分不超過7分;④患兒家屬知曉并同意研究內容,并簽署相關協議。排除標準:①合并其他先天性疾病;②合并呼吸系統或感染性疾病;③腦膜炎或神經系統發育畸形患兒;④非生產或窒息導致的頭顱血腫。

本研究符合赫爾辛基宣言中關于醫學倫理的相關建議,并獲醫院倫理委員會批準(2019-KYLN-023)。

1.2方法

1.2.1病情嚴重程度 依據《新生兒缺氧缺血性腦病的MRI診斷》[9]中患兒病情嚴重程度判定標準:病灶范圍僅限于大腦半球1～5個腦葉為輕度;病灶累及3～5個腦葉,或雖未累及3個以上腦葉,但伴有腦出血或重要功能區受累為中度;病灶累及6～7個腦葉,或雖未累6個以上腦葉,但伴2個以上腦出血或重要功能區灰質受累為重度。

1.2.2血清指標檢測 采集入組新生兒出生24 h內空腹靜脈血,以3 000 r/min,離心10 min,取上層血清,置于-80 ℃冰箱保存待測。使用QuantoBioRNA提取總RNA,使用RTaseM-LAV逆轉為cDNA,采用實時熒光定量PCR進行檢測血清miRNA-210、miRNA-223水平。miRNA-210上游引物5′-ATGGTTCGTGGGAGCCCCTGCCC-ACCGCA-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCC-GAGGT-3′。miRNA-223正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3′,反向引物:5′-TGGTGTCGTGGATTCG-3′。反應條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,59 ℃ 20 s,共40個循環。以U6為內參,上游引物:5′-CATCCGATAAAATTGGAACGA-3′,下游引物:5′-TTTGTGCGTGTCATCCTTGCG-3′,采用2-△△Ct計算miRNA-210、miRNA-223相對表達量。使用美國BEP2000型全自動酶標儀,使用中國深圳依諾金生物科技有限公司試劑盒,采用酶聯免疫吸附法檢測血清C反應蛋白、白細胞介素6水平。

1.3觀察指標 ①搜集所有入組新生兒分娩孕周、性別、出生時體重、平均日齡等臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223表達量并進行分析比較;②檢測不同病情嚴重程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達,分析其表達與與患兒病情嚴重程度的關系;③根據患兒出生后28 d內預后情況將患兒分為存活組和死亡組,搜集患兒孕周、分娩方式、性別、出生時體重、日齡、體溫、心率、Apgar評分、孕母親貧血、孕母親合并糖尿病、孕母親合并高血壓、臍帶異常、孕母親分娩時使用催產素、開始治療日齡、病情嚴重程度、白細胞介素6、C反應蛋白、miRNA-210表達量、miRNA-223表達量等資料并進行分析比較,找出影響患兒預后的相關因素,然后進一步進行多因素Logistic回歸分析,篩選出影響患兒預后的獨立危險因素。④根據血清miRNA-210、miRNA-223表達繪制ROC曲線,以曲線下面積評估其對新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的預測價值,曲線下面積越大,預測價值越高。

1.4統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料組內比較采用配對樣本t檢驗,組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗;計數資料采用χ2檢驗;多因素分析采用Logistic回歸分析,以ROC曲線下面積評估其對患兒預后的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12組臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223水平比較 觀察組患兒與健康對照組新生兒分娩孕周、性別、出生時體重、平均日齡等臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05);而觀察組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達量均高于健康對照組(P<0.05),見表1。

表1 2組研究對象臨床資料及血清miRNA-210、miRNA-223水平比較Table 1 Comparison of clinical data and serum miRNA-210 and miRNA-223 levels between two groups

2.2不同病情程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平比較 重度組患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平高于輕度組和中度組患兒,且組間比較差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 不同病情程度患兒血清miRNA-210、miRNA-223水平比較Table 2 Comparison of serum miRNA-210 and miRNA-223 levels in children with different disease severity

2.3不同預后患兒臨床資料比較 單因素分析結果顯示,開始治療日齡、Apgar評分、缺血缺氧性腦病病情嚴重程度、白細胞介素6、C反應蛋白、血清miRNA-210表達量、血清miRNA-223表達量與新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后有關(P<0.05),見表3。

表3 不同預后患兒臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data of children with different prognosis

2.4影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的多因素Logistic回歸分析 多因素分析結果顯示,開始治療日齡高于2.25 d(OR=3.554,95%CI:1.300～9.713)、病情嚴重程度未重度(OR=4.450,95%CI:2.189～9.048)、血清miRNA-210升高(OR=3.117,95%CI:1.598～6.082)、血清miRNA-223升高(OR=3.384,95%CI:1.790～6.398)是影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of factors affecting the prognosis of newborns with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy

2.5血清miRNA-210、miRNA-223對新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的預測價值 血清miRNA-210最佳分界值為1.71時,預測新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的曲線下面積為0.76,此時敏感度為78.62%,特異度為76.35%;miRNA-223最佳分界值為1.48時,預測新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的曲線下面積為0.79,此時敏感度為81.54%,特異度為76.18%;二者聯合檢測預測新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的曲線下面積為0.85,此時敏感度為86.73%,特異度為75.49%,見圖1。

圖1 血清miRNA-210、miRNA-223預測新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的ROC曲線

3 討 論

新生兒缺血缺氧性腦病是缺血、缺氧引起腦水腫、腦壞死,進而導致的腦組織病理改變,腦微血管缺氧及血流減少,引起腦缺血,血管通透性增高,進而導致腦水腫和神經元壞死,加劇腦缺血,形成惡性循環[10-11]。血清miRNA-210表達上調可通過調節血管生成,參與腦組織缺氧、缺血及神經元損傷過程,血清miRNA-223表達上調可通過調控機體炎癥反應,加劇腦水腫,進而參與新生兒缺血缺氧性腦病疾病進展過程,對患兒病情及預后評估具有重要價值。

本研究結果顯示,觀察組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達水平較高,且其水平隨患兒病情嚴重程度的增加而升高,其水平異常升高對評估,新生兒缺血缺氧性腦病病情嚴重程度具有重要指導意義。這主要是因為miRNA-210在調控血管生成、細胞遷移、細胞分化等方面發揮重要作用,已被廣泛應用于多種神經疾病、腦卒中、心力衰竭等疾病診斷中[12-13]。miRNA-210表達上調可促進腦神經營養因子、原肌球蛋白相關激酶異構體B表達降低,進而導致腦組織缺血、缺氧[14-15]。并通過調節內皮細胞遷移、分化及毛細血管網形成,誘導血管再生,導致腦組織缺血缺氧、神經元損傷,進而參與新生兒缺血缺氧性腦病發生、發展過程,提示miRNA-210可作為評估病情嚴重程度的重要生物標志物之一[16-17]。miRNA-223表達上調,可通過調節炎癥細胞發育、活化,影響機體炎癥反應,進而參與缺血、缺氧引起的腦組織水腫過程,并通過刺激血管平滑肌細胞增殖,引起腦組織微血管損傷,加劇腦組織缺血、缺氧,導致腦損傷[18-19]。因此,miRNA-223可通過了解腦組織水腫程度,評估患兒腦損傷程度。因此,可通過靶向調控miRNA-210、miRNA-223表達,改善腦組織缺血缺氧情況,進而緩解病情,推測miRNA-210、miRNA-223可作為治療新生兒缺血缺氧性腦病的潛在靶點。

并且,比較不同預后患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達水平發現,死亡組患兒血清miRNA-210、miRNA-223表達高于存活組,且Logistic回歸分析結果顯示,血清miRNA-210、miRNA-223是影響新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后的獨立危險因素。說明血清miRNA-210、miRNA-223表達與新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后密切相關,其表達上調對于預測患兒不良預后具有重要提示作用。這主要是因為血清miRNA-210表達水平變化可評估患兒腦組織損傷程度,進而幫助評估新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情嚴重程度,其表達上調,患兒腦損傷越嚴重,預后越差[20-21]。血清miRNA-223表達水平變化可評估腦水腫程度,進而有助于新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情評估,其表達上調,腦組織水腫程度越嚴重,腦損傷越嚴重,進而導致預后不良。血清miRNA-210、miRNA-223表達與患兒病情變化程度及損傷程度保持一致,提示其對評估新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后具有重要指導意義[22-23]。ROC曲線證實,血清miRNA-210最佳分界值為1.71時、miRNA-223最佳分界值為1.48時對預測新生兒缺血缺氧性腦病患兒預后具有較好預測價值,且聯合檢測預測價值更高。這可能是因為聯合檢測通過優勢補互補可更全面評估患兒腦損傷程度,進而幫助病情及預后評估[24]。但由于本研究樣本有限,且miRNAs是一個復雜的過程,還需擴大樣本,證實其可行性,進而為臨床治療及干預提供可靠依據。

綜上所述,新生兒缺血缺氧性腦病患兒血清miRNA-210、miRNA-223上調,其表達上調是影響患兒預后不良的獨立危險因素,對新生兒缺血缺氧性腦病患兒病情嚴重程度及預后評估具有重要參考意義。