DNAJB11基因在尤文氏肉瘤中的表達及預后價值*

李 鑫,劉震東,李 昂,王紅強△

1.河南大學人民醫院脊柱脊髓外科,河南鄭州 450003;2.河南省人民醫院脊柱脊髓外科,河南鄭州 450003

尤文氏肉瘤(ES)是一種侵襲性強、低度分化的骨或軟組織惡性腫瘤,其在兒童中的發病率僅次于骨肉瘤[1]。近年來隨著多學科診療模式的應用,部分ES患者預后有所改善,但對于早期轉移或復發的患者,其5年生存率僅有20%[2]。目前面臨的瓶頸問題是對ES的發病機制尚未闡明,缺乏有效的靶向藥物改善患者預后。DnaJ熱休克蛋白家族成員B11(DNAJB11)是一種人類蛋白編碼基因,在協調內質網和細胞外蛋白質穩態方面發揮多種功能[3-4]。已有研究證實,DNAJB11作為一種致病基因,可促進多種癌癥的病理進展[5-6],但是目前較少有DNAJB11對ES影響的報道。因此,本研究將探討DNAJB11在ES中的表達水平、預后價值、潛在功能及免疫細胞浸潤情況,旨在為ES的診斷和治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1數據收集 從UCSC Xena(the University of California Santa)數據庫中下載經標準化的泛癌數據集TCGA Pan-Cancer (PANCAN),提取DNAJB11基因在各個樣本中的表達數據,并對所有數據進行log2(TPM+1)處理,剔除單個樣本個數小于3個的癌癥病種,最終獲得了26種腫瘤表達數據。本研究從International Cancer Genome Consortium(ICGC)數據庫的BOCA-FR項目中下載56例ES患者的RNA測序(RNA-seq)數據和臨床相關信息進行生物信息學分析。從Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫中獲取GSE17674數據集,該數據集包含44例ES組織樣本和18例正常組織樣本?；谠摂祿容^ES組織和正常組織之間DNAJB11的表達差異。

1.2熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測 本研究所使用的人骨髓間充質干細胞(HBMSC)和人尤文氏肉瘤細胞株(TC-32和RD-ES)購自上海舜冉細胞庫,所有細胞均在含10%胎牛血清(美國Gibco公司)的DMEM培養基(美國HyClone公司)中培養,培養箱環境設定為37 ℃、5%CO2。使用Total RNA Kit Ⅰ(美國Omega Biotek公司)試劑盒從細胞中提取總RNA,并通過超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定RNA濃度,隨后使用NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(蘇州Novoprotein公司)逆轉錄獲得cDNA。采用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(蘇州Novoprotein公司)試劑盒進行PCR反應。內參GAPDH及DNAJB11的引物序列如下:GAPDH正向引物為5′-CAAGGTCATCCATGACAACT TTG-3′,GAPDH反向引物為5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′;DNAJB11正向引物為5′-TTTGGAGGAACCCCTCGTCA-3′,DNAJB11反向引物為5′-AATTGCACTTCCGTTTGCCA-3′?；虮磉_量采用2-ΔΔCt法分析。

1.3差異表達基因的篩選 本研究使用R軟件中的“limma”包篩選差異表達基因(DEGs),根據BOCA-FR數據集中DNAJB11表達水平的中位數,將ES患者分為高表達組和低表達組,以|log2FC|>1和P<0.05為臨界值篩選兩組間的DEGs。最終,本課題組篩選出1 230個DEGs。

1.4富集分析 富集分析是一種廣泛使用的高通量組學數據分析技術,用于探索基因集的生物學功能和作用[7]。基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫是基因富集分析中常用的兩種方法,GO分析主要用于目標基因的分類和功能注釋分析,包括3個層次,即生物過程、細胞成分和分子功能,KEGG分析則可用來分析目的基因的生物學途徑。使用“clusterprofiler”包對DEGs進行GO分析及KEGG分析。以P<0.05為入選標準。

1.5免疫細胞浸潤分析 獲取BOCA-FR數據集基因表達矩陣,使用“GSVA”包的單樣本基因集富集分析(ssGSEA)計算23種免疫細胞的浸潤分數,并使用“pheatmap”包繪制熱圖。使用“vioplot”包比較DNAJB11高表達組和低表達組的免疫細胞浸潤差異。

1.6藥物分析 Connectivity Map(CMap)數據庫是一個藥物研發工具,用于探索疾病、基因和藥物之間的潛在聯系[8]。將DEGs分為上調組和下調組,并上傳至CMap數據庫,根據富集指數<-0.75和P<0.005的標準,篩選出對ES有潛在治療價值的藥物。

1.7統計學處理 運用R軟件(v.4.0.3)進行統計分析和相關圖像繪制。采用Kaplan-Meier(K-M)生存曲線方法分析DNAJB11表達對ES患者生存的影響,單因素和多因素COX回歸模型分析與生存率相關的預后因素,受試者工作特征(ROC)曲線評估DNAJB11的診斷價值。兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗,不同DNAJB11表達水平患者臨床病理特征比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同DNAJB11表達水平患者臨床病理特征比較 根據BOCA-FR數據集中DNAJB11表達水平的中位數,將ES患者分為高表達組(28例)和低表達組(28例),兩組臨床病理特征比較,差異有統計學意義(P=0.01),提示DNAJB11表達與ES的轉移有關。見表1。

2.2DNAJB11在不同腫瘤中的表達水平差異 TCGA PANCAN數據集用于分析DNAJB11在不同腫瘤中的表達差異,最終納入26種腫瘤。結果顯示,DNAJB11在膠質母細胞瘤(GBM)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、肺腺癌(LUAD)、結腸癌(COAD)、結直腸癌(COADREAD)、乳腺浸潤癌(BRCA)、食管癌(ESCA)、胃和食管癌(STES)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、混合腎癌(KIPAN)、胃癌(STAD)、前列腺癌(PRAD)、子宮內膜癌(UCEC)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、腎透明細胞癌(KIRC)、肺鱗癌(LUSC)、肝細胞肝癌(LIHC)、直腸腺癌(READ)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、膽管癌(CHOL)中表達水平顯著升高(P<0.05),見圖1A。在GSE17674數據集中,ES組織中的DNAJB11表達水平高于正常組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1B。

2.3RT-qPCR驗證DNAJB11在ES中高表達 為了進一步明確DNAJB11在ES表達水平,本研究采用RT-qPCR檢測DNAJB11在人骨髓間充質干細胞(HBMSC)和ES細胞系(TC-32和RD-ES)中的表達水平。結果顯示,TC-32、RD-ES和HBMSC細胞中DNAJB11的相對表達水平分別為19.12±1.45、10.15±1.56和1.00±0.11,與HBMSC細胞比較,TC-32(t=24.97,P<0.001)和RD-ES細胞(t=10.15,P=0.009)中DNAJB11表達水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1C。

2.4DNAJB11對ES的預后和診斷價值 采用K-M生存曲線評估DNAJB11對患者生存期的影響,結果顯示,DNAJB11高表達可明顯縮短ES患者的生存時間(P=0.029),見圖2A。通過ROC曲線及曲線下面積(AUC)來評估DNAJB11的價值,結果顯示,DNAJB11預測3年生存的AUC為0.709,預測5年生存的AUC為0.634,提示DNAJB11對ES患者的預后具有一定的診斷價值,見圖2B。

2.5DNAJB11表達對ES患者預后的影響 單因素分析結果顯示,DNAJB11高表達(P=0.020,HR=1.036,95%CI:1.006～1.067)和復發(P<0.001,HR=2.348,95%CI:1.637～3.367)與ES患者的生存率有關(圖3A)。多因素分析結果顯示,DNAJB11高表達(P=0.002,HR=1.055,95%CI:1.020～1.091)和復發(P<0.001,HR=2.701,95%CI:1.801～4.052)是ES患者預后的獨立危險因素(圖3B)。

2.6GO分析和KEGG分析 GO分析結果顯示,DNAJB11可能參與了內質網應激反應、抗原加工及呈遞、內質網膜的組成和主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類蛋白復合物結合等方面(圖4A);而KEGG分析顯示,DNAJB11與單純皰疹病毒1型感染、抗原的加工和呈遞、內質網中的蛋白質加工和肌萎縮等相關(圖4B)。

注:A為K-M曲線;B為ROC曲線。

注:A為單因素分析;B為多因素分析。

注:A為GO富集分析;B為KEGG富集分析。

2.7免疫細胞浸潤比較 通過ssGSEA計算免疫浸潤評分并繪制熱圖,使每個樣本中23種免疫細胞的浸潤情況可視化(圖5)。進一步分析DNAJB11高、低表達組的免疫細胞浸潤情況,箱線圖顯示了兩組間免疫細胞浸潤差異(圖6),DNAJB11高表達組的巨噬細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、髓源性抑制細胞、調節性T細胞、肥大細胞等22種免疫細胞浸潤豐度高于低表達組(P<0.05)。

圖5 免疫細胞浸潤熱圖

注:***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05。

2.8CMap分析 CMap用于預測可能逆轉DNAJB11基因表達增高的治療藥物,最終篩選出3種對ES有潛在治療價值藥物:粗糠柴毒素、甲氟喹和依米丁,見表2。

表2 CMap分析結果

3 討 論

作為一種高侵襲性的惡性腫瘤,ES的病死率長期處于較高水平,探索有效的生物標志物對ES的診斷和治療具有重要意義。由于腫瘤微環境的復雜性,腫瘤的進展往往伴隨蛋白質穩態的變化,蛋白質錯誤折疊已被認為是導致癌癥進展的因素之一[9-10]。DNAJB11可編碼一種參與內質網中蛋白加工的伴侶蛋白,對蛋白質正確折疊、運輸和降解發揮著重要作用[11]。目前,關于DNAJB11對惡性腫瘤病理生理學的調控作用已有多篇報道,例如:DNAJB11可通過抑制Alpha-1-antitrypsin mutant Z的降解來促進肝癌的進展[5];相較于口腔鱗癌癌旁組織,DNAJB11在口腔鱗癌組織中的表達顯著升高[6]。在本研究中,通過UCSC Xena數據庫納入的泛癌數據進行分析,最終納入的26種腫瘤中,DNAJB11在20種腫瘤中呈高表達。闡明DNAJB11在ES中的表達水平及臨床意義,將有助于建立一個新的治療靶點,改進治療策略。然而,DNAJB11與ES的相關性尚未被揭示。

ICGC數據庫納入了全球多個國家的測序數據,已經成為分子生物研究最常用的數據庫之一。通過GEO數據庫分析發現,DNAJB11在ES樣本中的表達水平明顯高于正常樣本,為驗證這一結果,本研究進一步采用RT-qPCR進行分析,結果顯示,相較于正常細胞株,DNAJB11在ES細胞株中的表達顯著升高。K-M曲線結果表明,DNAJB11高表達組患者預后明顯較差;單因素及多因素COX回歸分析顯示,DNAJB11高表達可作為ES患者總生存期的獨立危險因素;ROC曲線分析顯示,DNAJB11對ES具有一定的診斷價值。以上研究結果表明,DNAJB11可能是診斷ES的潛在靶點。

為進一步探究DNAJB11促進ES病理進展的可能機制,本研究對DANJB11高、低表達組的差異表達基因進行GO和KEGG分析。值得提到的是,內質網應激反應是GO分析主要富集結果之一,內質網應激作為癌癥的多重調節因子和效應因子,可促進腫瘤細胞的存活,增強化療的耐藥性,目前,內質網應激已被認為是癌癥進展和維持惡性細胞的關鍵驅動因素[12-13]。DNAJB11的高表達可能會通過促進內質網應激及相關信號通路異常激活,進而推動ES的病理進展。因此,靶向內質網應激可能是治療ES的新方向,但這需要更進一步的研究來證明。另外,KEGG分析結果顯示,DNAJB11參與了通過MHC Ⅰ類的抗原加工和呈遞及MHC Ⅱ類蛋白復合物的結合。研究表明,MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子可分別將抗原呈遞給CD8+T細胞和CD4+T細胞,在適應性免疫系統中發揮關鍵作用[14-15]。因此,抗原加工和呈遞作為癌癥的免疫逃避的關鍵,DNAJB11可能會影響MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子介導的抗原呈遞以幫助ES細胞逃避免疫監視。以上富集分析結果表明,DNAJB11可通過多種途徑促進ES的發生和發展,進而影響患者預后,這些分子機制可為ES的治療提供有價值的參考。

腫瘤浸潤性免疫細胞是腫瘤微環境中的重要部分,與腫瘤惡性生物學行為和患者預后密切相關[16]。本研究應用ssGSEA分析了DNAJB11表達水平與ES免疫細胞浸潤的關系,結果顯示,在DNAJB11高表達組發現較高的免疫細胞浸潤豐度,其中包括巨噬細胞、髓源性抑制細胞和調節性T細胞等免疫抑制性細胞,提示DNAJB11高表達介導更活躍的腫瘤免疫反應。巨噬細胞可通過PI3Kγ信號通路抑制細胞毒性T細胞的激活,誘導腫瘤免疫抑制[17]。一項研究發現,在人類ES樣本中,較高水平的CD68+巨噬細胞(包括M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞)浸潤與患者預后不良相關[18]。本研究發現,DNAJB11高表達組的巨噬細胞浸潤顯著增加,抑制DNAJB11表達可能會減少巨噬細胞浸潤,增強T細胞抗腫瘤免疫活性,進而改善ES免疫抑制性微環境。

CMap數據庫用于獲取可能下調DNAJB11表達水平的藥物,根據篩選標準,最終確定3種對ES具有潛在治療作用的藥物:粗糠柴毒素、甲氟喹和依米丁。這些藥物已被證實在其他癌癥中具有不同程度的抗癌活性:粗糠柴毒素通過抑制細胞生長、觸發細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡等機制在多種癌癥中表現出顯著的抗腫瘤特性[19-21];甲氟喹通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有效靶向胃癌細胞,還可通過破壞溶酶體功能作為膠質母細胞瘤進展的抑制劑[22-23];依米丁可以通過激活與細胞凋亡密切相關的p38通路,抑制細胞外信號調節激酶、c-Jun N-末端激酶和β-連環蛋白這3個信號通路,進而對骨肉瘤細胞發揮抗癌作用[24]。但是,這僅為ES的藥物治療提出一個方向,后續可能需要更多的藥物實驗來驗證。

本研究結果表明,DNAJB11在ES中呈高表達,并且DNAJB11高表達與ES患者預后不良和免疫細胞浸潤豐度相關。此外,DNAJB11可能通過內質網應激反應、MHC Ⅰ類的抗原加工和呈遞和MHC Ⅱ類蛋白復合物的結合等方面來影響ES的病理進展。本研究結果顯示,DNAJB11具有作為ES生物靶點的潛力,并為ES的治療提供新的研究方向。