鷹嘴豆芽素A對LPS誘導的肺泡上皮細胞氧化應激損傷的影響*

唐敏強,黃 婕,陳佳娣

南通市海門區人民醫院/南通大學附屬海門醫院呼吸與危重醫學科,江蘇南通 226100

急性肺損傷(ALI)是肺部炎癥性綜合反應,其病理特征為嚴重的動脈低氧血癥、肺水腫和肺內中性粒細胞聚集,嚴重的ALI患者可轉為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),ALI/ARDS是導致急性呼吸衰竭的主要原因[1]。ALI的病理生理基礎包括免疫細胞過度激活、氧化應激、炎癥等,其發病率和死亡率均較高,嚴重威脅著人們的生命健康安全[2]。盡管目前對于ALI/ARDS的發生發展機制及治療方法研究有明顯的進展,但治療帶來的不良反應嚴重降低了患者的生存質量[3]。因此,積極深入探索ALI/ARDS的發病機制至關重要。鷹嘴豆芽素A(BCA)是從鷹嘴豆中提取出的異黃酮的主要成分,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌和神經保護等多種生物學活性[4],其可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路進而抑制炎癥反應,緩解脂多糖(LPS)誘導的小鼠ALI[5]。核因子E2相關因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)是調節氧化應激的重要通路,山姜素可通過激活PI3K/Nrf2/HO-1信號通路,減少炎癥和氧化應激反應來改善穿刺誘導的膿毒癥大鼠的ALI[6]。但BCA通過調節Nrf2/HO-1信號通路對LPS誘導肺泡上皮細胞氧化應激損傷的影響尚不清楚。本研究旨在探討BCA對LPS誘導肺泡上皮細胞氧化應激損傷的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺泡上皮細胞BEAS-2B購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA(純度:HPLC≥98%,貨號:PB3024)購自北京普非生物科技有限公司;LPS(貨號:YT1319)購自北京伊塔生物科技有限公司;Nrf2的抑制劑ML385(貨號:S86700)購自上海源葉生物科技有限公司;DCFH-DA活性氧ROS熒光探針(貨號:D6470)、SOD活性檢測試劑盒(貨號:BC0170)、MDA水平檢測試劑盒(貨號:BC0020)、IL-6的ELISA試劑盒(貨號:SEKR-0013)、TNF-α的ELISA試劑盒(貨號:SEKR-0047)均購自北京索萊寶科技有限公司;兔源一抗Nrf2(貨號:ab137500)、HO-1(貨號:ab13248)、PCNA(貨號:ab265585)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)(貨號:ab53154)、caspase-3(貨號:ab4051)、cleaved caspase-3(貨號:ab2302)以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(貨號:ab288151)均購自美國Abcam公司。

1.2細胞培養 將BEAS-2B細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素的RPMI 1640培養基中,在37 °C、5% CO2的穩定環境下常規培養,定期觀察,每1～2天更換一次培養基,當細胞融合度達到85%以上時,消化、傳代培養,收集對數期的細胞進行實驗。

1.3LPS誘導與分組 將對數生長期的BEAS-2B細胞分為ctrl組、LPS組、BCA低劑量組、BCA中劑量組、BCA高劑量組、抑制劑組,除ctrl組外,其余各組細胞給予10 μg/mL[7]的LPS刺激24 h,BCA低、中、高劑量組分別采用5、10、20 μmol/L[8]的BCA處理,抑制劑組[9]采用20 μmol/L BCA和5 μmol/L的Nrf2的抑制劑ML385共同處理。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖 各組細胞以1×104個/孔接種到96孔板中。分別將細胞培養24、48、72 h,棄去細胞上清液,在指定的時間點向每個孔中加入含有10 μL CCK-8溶液的100 μL完全培養基。孵育2 h后,使用酶標儀檢測其在450 nm處的吸光度(A450)。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集處理48 h的各組BEAS-2B細胞,以預冷的PBS洗滌2次,添加100 μL結合緩沖液懸浮各組BEAS-2B細胞,再分別添加Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染液5 μL,充分混勻,與室溫下避光染色15 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6熒光探針法檢測細胞內ROS水平 收集各組細胞,按照說明書以活性氧熒光探針(DCFH-DA)重懸細胞,37 ℃下孵育25 min后,以對照組的熒光強度為閾值,在流式細胞儀上檢測各組熒光強度。

1.7試劑盒檢測細胞上清液中SOD活性、MDA及TNF-α、IL-6水平 收集各組細胞上清液,按照SOD、MDA、TNF-α、IL-6試劑盒說明書檢測SOD活性、MDA及TNF-α、IL-6水平。

1.8免疫印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達 利用RIPA裂解緩沖液提取BEAS-2B細胞總蛋白。采用電泳分離蛋白,100 V恒壓轉移蛋白至PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶封閉2 h,將膜與一抗Nrf2、HO-1、PCNA、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、GAPDH在4 ℃孵育過夜,再將膜與HRP偶聯的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h,棄去液體,洗滌3次,加入ECL試劑顯影,采用Image J軟件評估蛋白的灰度值。

2 結 果

2.1各組BEAS-2B細胞增殖能力比較 與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的A450降低(P<0.05);與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞的A450升高(P<0.05);與BCA高劑量組比較,抑制劑組BEAS-2B細胞的A450降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組BEAS-2B細胞A450比較

2.2各組細胞凋亡情況比較 各組細胞凋亡率如下:ctrl組(5.64±2.13)%、LPS組(38.47±3.24)%、BCA低劑量組(31.72±3.12)%、BCA中劑量組(24.53±2.21)%、BCA高劑量組(11.86±2.15)%、抑制劑組(27.35±2.23)%。與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的凋亡率升高(P<0.05);與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞的凋亡率降低(P<0.05);與BCA高劑量組比較,抑制劑組BEAS-2B細胞的凋亡率升高(P<0.05)。

2.3各組細胞氧化損傷情況比較 與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞ROS、MDA水平升高,SOD活性減弱(P<0.05);與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞ROS、MDA水平明顯降低,SOD活性顯著增強(P<0.05);與BCA高劑量組比較,抑制劑組細胞ROS、MDA水平升高,SOD活性減弱(P<0.05)。見表3。

表3 各組BEAS-2B細胞ROS、SOD活性及MDA水平情況比較

2.4各組BEAS-2B細胞上清液TNF-α、IL-6水平比較 與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的TNF-α、IL-6表達水平明顯升高(P<0.05);與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞的TNF-α、IL-6表達顯著降低(P<0.05);與BCA高劑量組比較,抑制劑組BEAS-2B細胞的TNF-α、IL-6表達水平升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組BEAS-2B細胞上清液TNF-α、IL-6比較

2.5各組細胞蛋白表達水平比較 與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的Nrf2、HO-1、PCNA表達水平明顯降低(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達明顯升高(P<0.05);與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞的Nrf2、HO-1、PCNA表達水平顯著升高(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達水平明顯降低(P<0.05);與BCA高劑量組比較,抑制劑組BEAS-2B細胞的Nrf2、HO-1、PCNA表達水平降低(P<0.05),Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達水平升高(P<0.05)。見圖1和表5。

表5 各組BEAS-2B細胞蛋白表達水平比較

注:A為ctrl組;B為LPS組;C為BCA低劑量組;D為BCA中劑量組;E為BCA高劑量組;F為抑制劑組。

3 討 論

ALI/ARDS是由非心源性的因素引起的彌漫性的肺損傷,其是導致重癥監護室中急性呼吸衰竭的主要原因[10]。雖然近年來在呼吸生理學方面的研究進展較快,但治療帶來的過敏反應、呼吸機相關性肺損傷等不良反應和局限性,使患者的生存率和生活質量仍得不到顯著提高[11]。因此,探尋新方法治療ALI/ARDS具有重要的臨床意義。肺泡上皮細胞在發生肺組織損傷時,能夠參與到肺組織修復過程中,具有屏障保護作用[12],LPS是革蘭陰性細菌細胞外壁的成分之一,內毒素所引起的ALI較難以控制,其所導致的ARDS是常見的肺部炎癥綜合征[13]。本研究通過10 μg/mL的LPS刺激BEAS-2B細胞,結果發現,與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的A450、PCNA表達明顯降低,細胞凋亡率、TNF-α、IL-6、Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達明顯上升,提示LPS誘導可抑制肺泡上皮細胞增殖,促進其凋亡和炎癥反應。氧化應激是在機體受到有害刺激時,體內高活性分子如ROS等產生過多,引起脂質過氧化,氧化系統和抗氧化系統失衡,從而導致細胞損傷,引起呼吸系統疾病[14]。SOD是細胞內的抗氧化酶,可反映機體抗氧化損傷能力,而MDA是脂質過氧化產物,反映了ROS引起的破壞[15]。本研究發現,與ctrl組比較,LPS組BEAS-2B細胞的SOD活性明顯降低,ROS和MDA水平顯著上升,提示LPS誘導可引起肺泡上皮細胞的氧化應激損傷。

BCA別名雞豆黃素A,主要是從鷹嘴豆中提取出來的一種植物雌激素,屬黃酮類化合物,其具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等活性,還是天然的抗氧化劑[16]。有研究表明,BCA可逆轉異氟醚誘導的人神經母細胞瘤細胞SOD活性降低和MDA水平升高,增強細胞活力,抑制細胞凋亡,保護細胞免受異氟醚誘導的神經毒性[17]。本研究發現,與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組BEAS-2B細胞的A450、SOD活性、PCNA表達明顯升高,細胞凋亡率、ROS和MDA水平、TNF-α、IL-6、Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達明顯降低,提示BCA可增強LPS誘導的BEAS-2B細胞增殖能力,抑制其凋亡能力、炎癥反應和氧化應激。

Nrf2/HO-1信號通路存在于哺乳動物細胞中,并參與調節細胞增殖、凋亡等,其還能調控炎癥反應和氧化應激[18-19]。相關研究表明,丙內酯可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制人支氣管上皮細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達,抑制細胞凋亡和氧化應激[20]。本研究發現,與ctrl組比較,LPS組Nrf2、HO-1表達明顯降低,提示Nrf2/HO-1信號通路可能參與了LPS誘導的肺泡上皮細胞的氧化應激損傷。與LPS組比較,BCA低、中、高劑量組Nrf2、HO-1表達升高,推測BCA可能通過激活Nrf2/HO-1途徑抑制氧化應激損傷。為了驗證該推測,本研究利用Nrf2的抑制劑ML385進行干預,結果發現,與BCA高劑量組比較,抑制劑組BEAS-2B細胞A450、SOD活性、Nrf2、HO-1、PCNA表達明顯降低,細胞凋亡率、ROS和MDA水平、TNF-α、IL-6、Bax、cleaved caspase-3/caspase-3表達明顯上升,表明Nrf2的抑制劑ML385減弱了BCA對BEAS-2B細胞增殖的促進作用,增強了細胞凋亡能力、炎癥反應和氧化應激,提示BCA可以通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制BEAS-2B細胞氧化應激損傷。

綜上所述,BCA可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞的氧化應激損傷。該研究為開發新的治療ALI的藥物提供了理論基礎。然而,本研究尚存在一定不足之處,僅僅在細胞水平上驗證了BCA調控Nrf2/HO-1途徑對BEAS-2B細胞增殖、凋亡、炎癥和氧化應激反應的影響,后續將考慮在體內水平上進行進一步探索。