川芎揮發油組分及體外抗炎活性研究

周羿宇,孟德超,何永成,王 成,余 杰,張朝文,鄒元鋒

(四川農業大學動物醫學院天然藥物研究中心,成都 611130)

中藥材川芎為傘形科藁本屬植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖。夏季當莖上的節盤顯著突出并略帶紫色時采挖,除去泥沙,曬后烘干,再去須根。川芎入藥已有兩千年歷史,首載于《左傳》,入藥始于《神農本草經》上品,有“川芎味辛、溫,主治中風人腦頭痛、寒痹、筋攣緩急、婦人血閉無子”之稱。主產于四川省彭州、都江堰等地,為四川的道地藥材之一[1]。“個頭大飽滿、質地堅實,斷面色為黃白、油性大、香氣濃郁者”為優。《本草便讀》中記載“辛甘微苦,能解郁調經;溫宣之性,能疏血分寒”[2],為中醫中活血行氣,法風止疼之藥。川芎因其有效成分及藥用價值廣而備受關注,臨床上主要應用于治療心腦血管、呼吸、泌尿系統及婦科方面的疾病。現代研究表明其在抗炎、鎮痛、抗血栓形成、促血管舒張、抗哮喘、抗呼吸抑制、抗纖維化、抗阻塞性疾病及抗腫瘤等方面發揮顯著的藥理作用。

揮發油是川芎主要活性成分,約占化學成分總量的1%,主要包括苯酞類、萜烯類、脂類、有機酸類等化合物。錢敏[3]通過GC-MS法測定川芎揮發油中含有29種成分,其中以藁本內酯含量最多,其次是正丁烯基苯酞、丁基苯酞、α-萜品醇。另有學者[4]用GC-MS-DS方法分析,鑒定出40個化合物,占揮發油總組成93.64%,主要成分為藁本內酯(58.00%),3-丁基苯酞(5.29%),香松烯(6.08%)。其他研究[5-7]均表明藁本內酯為川芎揮發油的主要活性成分,可占揮發油總量的60%及以上。

炎癥是具有血管系統的活體組織對各種損傷因子的刺激所發生的以防御反應為主的基本病理生理過程,是損傷、抗損傷和修復的動態過程[8]。炎癥是機體重要的防御反應,適度的炎癥反應有益于機體健康,但是在一定情況下對機體有潛在的威脅性。如病毒性心肌炎可以影響心臟功能[9]、細菌性腦膜炎的膿性滲出物可以引起顱內壓增高[10]、結核性心包炎引發心包增厚[11]等。脂多糖(LPS)可刺激小鼠單核巨噬細胞(RAW267.4)產生急性炎癥反應,可在此基礎上建立體外炎癥細胞模型。炎癥反應的過程中會釋放多種炎癥因子,從而調控整個炎癥反應的進程,例如一氧化氮(Nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β (Interleukuin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6 (Interleukuin-6,IL-6)、白細胞介素-10 (Interleukuin-10,IL-10)等,這些炎癥因子的含量可以間接反應炎癥發生的程度,常常作為檢測炎癥反應的實驗依據。

研究利用水蒸氣蒸餾法分別對川芎非藥用部分和藥用部分中的揮發油進行提取,采用氣相色譜-質譜聯用法分析鑒定其化學成分,通過LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型,給予系列濃度梯度的川芎藥用部分和非藥用部分揮發油溶液,采用qRT-PCR對IL-6炎癥因子進行檢測,探究其抗炎作用。在同產地川芎原料基礎上,將藥用部分和非藥用部分中的揮發油的化學成分以及抗炎活性進行比對,為擴大川芎藥源提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

電熱鼓風干燥箱(DHG-9070B 上海瑯玕實驗設備有效公司);恒溫電熱套(ZDHW 中興偉業儀器有限公司);電子天平(BS-210S 北京賽多利斯天平有限公司);顯微分光光度計(NanoDrop One/OneC 美國賽默飛公司);CO2細胞培養箱(美國賽默飛公司);高速冷凍離心機(美國賽默飛公司);倒置生物顯微鏡(Nikon)等。

1.2 材料

川芎(LigusticumchuanxiongHort.),根莖及莖葉采自眉山市彭山區川芎種植基地,經四川農業大學鄒元鋒副教授鑒定為川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的塊根及莖葉。

1.3 試劑

DMEM培養基(美國Gibco公司);胎牛血清(FBS;美國Gibco公司);青霉素-鏈霉素(美國Gibco公司);Trizol試劑(RA101-02 北京博邁德基因技術有限公司);CCK-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies);胎牛血清(美國Gibco公司);脂多糖(LPS,Sigma,O55：B5);M-MLV4 First-Strand cDNA Synthesis Kit(Takara生物技術有限公司);SYBR premix Ex Taq II試劑盒(Takara生物技術有限公司)。

1.4 細胞株

小鼠RAW264.7單核-巨噬細胞(中國典型培養物保藏中心細胞庫)。

2 方法

2.1 提取方法

參照2020年版《中國藥典》四部通則2204《揮發油測定法》[1]進行揮發油提取。精密稱取干燥川芎塊根及莖葉100 g(根莖切塊為1cm3,莖葉切段為1cm長),置于3000mL圓底燒瓶中,加水2000mL,充分混勻后浸泡2 h,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸回流提取10 h,至測定器油量不再增加,分離油層,得川芎揮發油,計算提取得率,分裝于棕色瓶,置于-80℃備用。

2.2 成分分析

分別取川芎藥用部分揮發油和非藥用部分揮發油進行GC-MS檢測,并聯用NIST 17數據庫自動檢索。

2.2.1 氣相色譜柱 HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)。

2.2.2 GC條件 進樣口溫度280℃,氣質接口溫度280℃,載氣流速1.5mL/min;進樣量1μl;分流比100：1;升溫程序：初始50℃,保持0min;以5℃/min升溫到100℃保持5min;以4℃/min升溫到140℃保持5min;以4℃/min升溫到180℃保持5min;以5℃/min升溫到250℃保持5min;以10℃/min升溫到290℃保持10min。

2.2.3 MS條件 離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,EI電離70 eV,全掃描35～550 Da。

2.3 體外抗炎活性

2.3.1 細胞培養、傳代、凍存與復蘇 (1)細胞培養。在超凈臺臺中,將含有一定數量RAW267.4細胞的細胞懸液加入細胞培養皿內,并加入9mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基,放入37℃,5%CO2的培養箱中培養,每12h觀察細胞狀態及生長情況。

(2)細胞傳代。待RAW267.4細胞生長至培養皿80%左右傳代。將舊培養基移除,用提前在37℃水浴鍋預熱的0.1mol/L PBS沖洗2～3次,加入2mL0.25%的胰蛋白酶消化液,消化1min后移除所有胰酶,加入4mL的DMEM,用移液槍輕輕吹打貼壁的細胞使之脫落,收集細胞于10mL離心管,1000rpm/min,離心5min,棄上清,加入2mL的新培養液充分混勻,均勻添加至兩個裝有7mL完全培養基的培養皿中,放入培養箱中培養。約24h傳代1次,以保持細胞生長狀態,維持適宜的細胞密度。

(3)細胞復蘇。從液氮中取出凍存管,迅速放入提前準備的37℃水浴中,搖晃凍存管加速溶解(呈液態,1 min為宜)。在超凈臺將溶解好的細胞移入到裝有9mL完全培養基的離心管,2000 rpm/min離心3 min,棄去上清液,用1～2mL完全培養基重懸細胞,再將細胞懸液加入裝有7mL完全培養基的培養皿中,放入培養箱中培養,次日更換培養基,觀察細胞的生長狀況。

2.3.2 細胞毒性測定 根據CCK-8檢測法,檢測川芎藥用部分和非藥用部分揮發油對RAW 264.7細胞的細胞毒性。取川芎藥用部分和非藥用部分揮發油溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,配置成0.1 mg/mL的母液,之后取適量母液配置所需濃度。將RAW 264.7細胞在96孔板上培養并孵育24 h。更換培養基后,在96孔板中添加不同濃度LPS(1.25、2.5、5、10、20、40、60μg/mL)、川芎藥用部分揮發油和川芎非藥用部分揮發油溶液(1.25、2.5、5、10、20、40、60、80μg/mL),并孵育12 h。按照CCK-8試劑說明加入試劑,每孔加入10μL的CCK-8試劑,孵育1h,使用酶標儀,于450 nm波長出測量每孔吸光度并計算細胞毒性。

細胞活力(%)=(給藥組細胞OD值-空白OD/正常組的OD值-空白組OD值)×100%

2.3.3 qRT-PCR實驗 將RAW264.7細胞接種于6孔板中,培養24 h(2×105個細胞/孔)。使用不同濃度的川芎藥用部分揮發油(2.5、5、10μg/mL)和川芎非藥用部分揮發油(2.5、5、10μg/mL)給藥并培養12 h,更換培養基后添加500 ng/mL的LPS溶液,孵育12 h,以誘導細胞炎癥。用Trizol試劑提取RAW 264.7細胞的總RNA。用顯微分光光度計測量RNA濃度,并測定A260/280在1.6-2.0范圍內,用于定量測定炎癥細胞因子IL-6基因的相對表達。使用M-MLV4 First-Strand cDNA Synthesis Kit將分離的總RNA(5μg/μL)逆轉轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)嚴格使用SYBR premix Ex Taq II試劑盒。以β-actin(mouse)作為內參數,用△△Ct法計算,確定靶基因的相對表達量。RT-qPCR所用的引物見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

3 結果與分析

3.1 揮發油提取得率

采用水蒸氣蒸餾法分別對川芎藥用部分與非藥用部分進行提取,提取得率結果見表2,川芎非藥用部分揮發油得率平均值為0.2845%,藥用部分揮發油得率平均值為0.2267%。

表2 川芎藥用部分和非藥用部分揮發油提取得率

3.2 GC-MS分析

提取得揮發油樣品經氣相色譜—質譜聯用儀分析,聯用NIST 17數據庫進行自動檢索,并與相關文獻及標準圖譜分析對比,然后以色譜面積歸一化法計算各組分的相對百分含量,分析得到不同部位川芎揮發油化學組分。

經GC-MS分析,總共檢出112種揮發性成分,其中川芎藥用部分所得揮發油共中檢出87種,占總峰面積98.46%;從川芎非藥用部分所得揮發油中檢出65種,占總峰面積96.20%。經統計分析,川芎揮發油主要成分為3-丁基苯酞(Butyl Phthalide)、3-丁叉苯酞(3-butylidene-phthalid)、松油烯醇-4(4-Terpineol)、N,N'-Diacetyl-1,4-phenylenediamine、乙位水芹烯(β-phellandrene)。表3、表4分別整理出非藥用部分和藥用部分含量最高的前十種揮發性成分,經分析對比,相同成分共有兩種,分別為3-丁基苯酞(Butyl Phthalide)和3-丁叉苯酞(3-butylidene-phthalid),非藥用部分中含量分別為51.21%、1.78%,藥用部分中含量分別為55.08%、2.51%。實驗數據表明含量最高的成分均為3-丁基苯酞,非藥用部分和藥用部分分別含有51.21%、55.08%。

表3 川芎非藥用部分揮發油含量最高的前10種組分

表4 川芎藥用部分揮發油含量最高的前10種組分

川芎藥用部分揮發油和川芎非藥用部分揮發油的化學成分基本一致,但也存在部分差異。不同部分川芎揮發油具有40種共同化學成分,兩種揮發油各主要化學組分的百分含量存在差異,例如3-丁叉苯酞,其在川芎非藥用部分、藥用部分揮發油中的相對含量分別為1.78%、2.51%。不同部分川芎揮發油主要成分也具有一定差異,非藥用部分含有β-瑟林烯、α-瑟林烯、乙位石竹烯、大牛兒烯、反式-α-佛手甘油烯、β-欖香烯、α-畢橙茄醇等主要化學成分,具有一定的抗菌、抗真菌[12]、抗腫瘤、誘導細胞凋亡等作用。藥用部分含有松油烯醇-4、乙位水芹烯、異松油烯、γ-松油烯、α-蒎烯、N,N-二乙酰-1,4-苯二胺、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene等主要化學成分,具有抑制酶活性[13]、抗氧化[14]、清除自由基、殺蟲活性[15]等作用。實驗結果說明川芎藥用部分和非藥用部分都具有相同的功效,但兩者的不同成分存在特殊藥用價值的可能性,擁有廣闊的研究價值。

3.3 川芎揮發油對LPS誘導的RAW264.7細胞的影響

首先采用CCK-8試劑檢測川芎揮發油及LSP的細胞毒性(圖1),實驗結果表明三種溶液在實驗濃度下對RAW 264.7細胞均無毒性。

圖1 川芎藥用部分 (A)、非藥用部分揮發油 (B)和LPS (C)對RAW267.4細胞細胞存活率的影響

炎癥產生時,局部血管擴張,血漿及中性白細胞等血液成分滲出到組織內,細胞中的炎癥通路如LPS-TLR4/MD-2、Jak/Stat等被激活并釋放多種促炎細胞因子。IL-6是促炎癥細胞因子中的重要代表,其分泌水平可以反映炎癥反應的程度。而LPS已被證實并應用于誘導RAW 173.4細胞炎癥和氧化應激[16],與本實驗結果一致(圖2),LPS刺激RAW 264.7細胞后,IL-6的基因表達量顯著增加(P<0.001),進一步考察川芎藥用部分揮發油和非藥用部分揮發油對炎癥因子分泌的作用效果。

圖2 川芎揮發油對LPS誘導RAW 267.4細胞炎癥中IL-6表達的影響注：C為空白組,M為模型組,LL、LM和LH分別為川芎非藥用部分揮發油低劑量(2.5μg/mL)、中劑量(5μg/mL)和高劑量(10μg/mL)組,RL、RM和RH分別為川芎藥用部分揮發油低劑量(2.5μg/mL)、中劑量(5μg/mL)和高劑量(10μg/mL)組。與LPS模型組相比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與空白對照組相比#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;ns表示無顯著差異(P>0.05)。

與炎癥模型組相比(僅作LPS處理),LPS處理前經過不同濃度給藥,其中川芎藥用部分中劑量(P<0.01)和高劑量組(P<0.001)對IL-6基因表達抑制作用顯著,低劑量組抑制作用不明顯(P>0.05);而川芎非藥用部分低劑量(P<0.01)、中劑量(P<0.001)和高劑量(P<0.001)組對IL-6基因表達抑制作用顯著,呈現劑量依賴關系。結果說明,川芎藥用部分和非藥用部分揮發油對LPS誘導的RAW 267.4細胞炎癥反應均有不同程度的抑制作用,而高劑量時作用最顯著,表明兩種揮發油在體外具有良好的抗炎活性,并不同程度降低了炎癥因子(IL-6)的含量。在本實驗中,川芎藥用部分和非藥用部分揮發油有著相近的化學成分,表現出相似的抗炎效果,為進一步利用川芎浪費的非藥用部分作為抗炎物質的藥用來源奠定了基礎。

4 討論與結論

川芎入藥歷史悠久,具有良好的藥用價值,藥用部位為成熟的川芎根莖,花莖葉等非藥用部分在成熟前因摘除而無法利用,存在潛在的經濟價值。目前研究主要集中在不同提取揮發油的方法之間成分差異性的比較,還有不同產地川芎揮發油成分比較[17]。若加強對川芎莖葉,即非藥用部分的研究可以有效避免資源的浪費,提高全藥材的利用度。采用GC-MS分別對其藥用部分和非藥用部分揮發進行成分分析,比較其成分的差異性與相似性,探究藥源開發的可能。

川芎揮發油的化學成分主要為各種萜類化合物,此外還含有醇、酯、醛、酮以及其衍生物。雖然川芎非藥用部分和藥用部分成分存在些許差異,但其主要成分含量基本相同,其中含量最高的組分都為3-丁基苯酞,它們分別含有51.21%、55.08%,含量接近。故川芎非藥用部分揮發油與藥用部分揮發油具有相似的功效。川芎揮發油中均未檢測出藁本內酯成分,與文獻報道[5-7]有差異,說明川芎的主要成分發生了變化,可能與源產地、存放時間、采收期等原因以及藁本內酯的不穩定性有關,仍需進一步考察。

革蘭氏陰性致病菌產生的LPS可產生強烈的炎癥反應,本研究中RAW267.4細胞經過LPS誘導建立炎癥模型,炎癥因子IL-6顯著上調。經過揮發油處理過后,由LPS誘導產生的IL-6過度分泌被明顯抑制,且藥用部分和非藥用部分揮發油抗炎抑制作用相似,在體外均有良好的抗炎效果。研究表明,部分二萜類化合物存在優異的抗炎活性[18],而萜類作為川芎揮發油的主要成分,推測其是其臨床抗炎作用的物質基礎,存在進一步研究價值。本實驗對川芎藥用部分和非藥用部分揮發油總體物的抗炎活性進行對比,表明非藥用部分的抗炎效果與藥用部分同佳,為川芎全藥材利用提供實驗依據,其作用機制仍缺乏相關研究。