TLR4/MyD88非依賴信號通路在強直性脊柱炎患者中的表達及臨床意義

楊大偉,臧歡歡,楊慧敏,孫 旭,李 瑩,袁伶俐

(1.蚌埠醫學院第二附屬醫院風濕免疫科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠醫學院第一附屬醫院兒科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠醫學院第二附屬醫院骨科,安徽 蚌埠 233000)

強直性脊柱炎(AS)是一種慢性自身炎癥性疾病,以中軸關節受累為主,主要累及骶髂關節、脊柱骨樣突、脊柱旁軟組織等,也可伴有關節外表現(如葡萄膜炎或虹膜炎),嚴重時可發生脊柱畸形和關節強直[1-2],對患者生活質量造成很大影響。但AS的病因和發病機制目前仍不十分明確。有研究表明,γ-干擾素(IFN-γ)與多種自身炎癥和免疫疾病相關,如免疫球蛋白A腎病、多發性硬化癥等[3-4]。也有研究表明,在中國漢族人群中IFN-γrs2069727基因多態性與AS起病顯著相關[5]。袁躍興等[6]發現,AS患者血清IFN-γ表達水平顯著升高,且與C 反應蛋白(CRP)呈正相關。提示IFN-γ可能作為致炎因子參與了AS的起病及病情活動。而IFN-γ為細胞Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)非依賴信號通路重要的末端炎癥因子[7],提示TLR4/MyD88非依賴信號通路也可能參與了AS的發生。本研究通過檢測AS患者血清及滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中重要上游節點分子——TLR4、Toll樣受體相關分子(TRAM)、TIR域含適配器誘導β-干擾素(TRIF)、核因子-κB(NF-κB)及末端炎癥因子——IFN-γ的表達,探討了TLR4/MyD88非依賴信號通路在AS起病及病情活動中所起的作用,旨在為治療AS提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)試驗1:選取2019年1月至2021年12月在蚌埠醫學院第二附屬醫院風濕免疫科就診的AS患者46 例作為AS組,其中男31 例,女15例;年齡15～61歲,平均(37.50±11.19)歲;平均身高(169.76±5.59)cm;平均體重指數(23.06±2.35)kg/m2。選取同期健康體檢者30例為健康對照組,其中男25例,女5例;年齡27～57 歲,平均(38.90±7.70)歲;平均身高(171.43±5.37)cm;平均體重指數(23.85±1.57)kg/m2。2組研究對象性別、年齡、身高、體重指數比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。(2)試驗2:選取13例行髖關節置換術AS患者滑膜組織作為AS手術組,其中男9例,女4例;年齡36～56歲,平均(47.53±7.16)歲;平均身高(169.15±5.79)cm,平均體重指數(23.85±1.83)kg/m2。選取10例同期髖關節創傷性骨折患者滑膜組織作為對照組,其中男7例,女3例;年齡28～56歲,平均(42.0±8.79);平均身高(168.8±4.59)cm;平均體重指數(24.22±1.85)kg/m2。2組患者性別、年齡、身高、體重指數比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。AS手術組及對照組滑膜組織均為患者手術時取得。本研究經醫院倫理委員會審批(倫理編號:蚌埠醫學院倫科批字[2021]第247號)。樣本收集均取得研究對象知情同意,均簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清紅細胞沉降率(ESR)、CRP、 IFN-γ檢測 ESR、CRP均于蚌埠醫學院第二附屬醫院檢驗科完成檢測。IFN-γ酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司(貨號:ZK-H1171),嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.2.2AS病情活動度評分(ASDAS)-CRP 采取ASDAS-CRP評價AS疾病活動度。ASDAS-CRP=0.12×腰背痛+0.06×晨僵持續時間+0.1×患者總體評價+0.07×外周關節疼痛/腫脹+0.58×Ln(CRP+1)。腰背痛、晨僵持續時間、患者總體評價、外周關節疼痛/腫脹均采用疼痛視覺模擬疼痛量表進行評價,0分為不存在不適感,10分為嚴重不適。ASDAS作為新型AS疾病活動度指標由國際脊柱關節炎評價工作組于2009年首先提出[8]。

1.2.3TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關分子mRNA表達水平測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法測定TLR4/MyD88非依賴信號通路相關分子mRNA表達水平。嚴格按RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,用TP800 PCR擴增儀按實時熒光定量PCR說明書采用探針法對cDNA進行PCR檢測、擴增,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,以95 ℃預變性30 s,然后進行循環擴增,95 ℃變性5 s,60 ℃退火加延伸30 s,共40個循環,反應結束后進行溶解曲線分析。RNA抽提試劑盒(Code No.9767)、反轉錄試劑盒(Code No.RR036A)、實時熒光定量PCR檢測試劑盒(Code No.RR391A)、熒光定量PCR擴增儀(TP800)均購自日本TaKaRa公司,TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ、內參GAPDH引物均由上海生物工程技術服務有限公司設計合成。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達水平。各信號分子引物見表1。

表1 各信號分子引物

2 結 果

2.12組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較 AS組患者血清ESR、CRP、IFN-γ水平均明顯高于健康對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較

2.2AS患者血清IFN-γ水平與CRP、ESR、ASDAS-CRP 的相關性 AS患者血清IFN-γ水平與ESR、CRP、ASDAS-CRP水平均呈正相關(r=0.762、0.776、0.405,P<0.001、<0.001、0.005)。

2.32組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達水平比較 與對照組滑膜組織比較,AS手術組患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路重要節點分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA 表達水平均明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

3 討 論

TLR4是膜蛋白家族中的一員,可識別不同病原體的病原相關分子模式(包括格蘭陰性菌脂多糖、熱休克蛋白、磷壁酸等),激活體內胞內信號通路,并誘發免疫相關基因和促炎基因的表達,引起炎性反應。根據是否需要MyD88分子介導分為MyD88依賴和MyD88非依賴兩種信號通路。TLR4經MyD88依賴通路誘發腫瘤壞死因子-α的釋放,引起早期炎性反應,而經Myd88非依賴通路則激活晚期NF-κB和干擾素調節因子3(IRF-3)的轉錄。有研究表明,TRAM特異性介導了TLR4/MyD88非依賴信號通路,是激活TRIF,活化IRF3、NF-κB信號蛋白必不可少的重要銜接分子,而對TLRs中的其他受體無作用[9]。NF-κB是調控細胞增殖、凋亡、惡性轉化及浸潤的重要的核轉錄因子,當細胞受到炎性細胞因子刺激后激活κB抑制因子激酶(IKK)復合體等特定的蛋白激酶,κB抑制因子磷酸化、泛素化后立即被蛋白酶體降解,導致NF-κB釋放,核易位進入細胞核,啟動相關基因的轉錄[10]。在TLR4/MyD88非依賴信號通路中TLR4通過TRAM激活TRIF,TRIF與接頭蛋白募集腫瘤壞死因子受體相關因子6綁定,使下游TRNK結合激酶1分子磷酸化,TRNK結合激酶1緊接著激活絲裂原激活的蛋白激酶和NF-κB,而NF-κB 可激活IRF3[7,9,11],釋放大量IFN-γ,而IFN-γ作為TLR4/MyD88非依賴信號通路重要的末端炎癥因子具有多種生物學作用:(1)可激活巨噬細胞、內皮細胞、淋巴細胞等一系列具有免疫活性的細胞,并促進其功能。(2)也可促進包括抗原呈遞細胞在內的多種細胞表達主要組織相容性復合體Ⅰ類分子和Ⅱ類分子[12]。(3)促進輔助性T淋巴細胞0分化為輔助性T淋巴細胞1,并抑止輔助性T淋巴細胞2增殖。(4)促進細胞毒性T淋巴細胞成熟及活化。(5)促進B淋巴細胞分化,產生抗體及免疫球蛋白類型轉化;此外,其還可通過上調某些趨化因子和自身受體的表達,降低上皮細胞屏障功能,促進中性粒細胞遷移,引發炎性反應[13]。

欽丹萍等[14]研究表明,在三硝基苯磺酸/乙醇聯合灌腸的方法建立三硝基苯磺酸 /乙醇潰瘍性結腸炎大鼠模型的腸黏膜中TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB、IFN-γ無論在mRNA 還是蛋白表達水平均明顯高于健康對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示MyD88非依賴信號通路參與了潰瘍性結腸炎大鼠炎癥活動的調控。同時,也有研究表明,IFN-γ在炎癥性腸病患者腸黏膜上的表達也明顯增加[15]。DOLHAIN等[16]發現,類風濕關節炎(RA)患者血清及滑膜組織IFN-γ水平明顯高于骨性關節炎患者,差異有統計學意義(P<0.05)。MANOURY-SCHWARTZ等[17]對RA小鼠模型研究發現,IFN-γ可損傷關節,引起關節炎癥,RA小鼠注射IFN-γ單抗后不僅能減輕關節炎程度,還能降低關節炎發生率。付曉敏等[18]應用免疫組織化學方法對AS 患者滑膜組織TLR4及其信號通路中主要分子,如MyD88、NF-κB-p65 進行檢測發現,AS患者滑膜組織TLR4、NF-κB-p65表達陽性,MyD88表達陰性,提示經由TLR4/MyD88非依賴信號通路引起免疫炎性反應,從而參與了AS發病及病情活動。

本研究結果顯示,AS患者血清IFN-γ水平明顯高于健康對照組,差異有統計學意義(P<0.05),且IFN-γ與CRP、ASDAS-CRP均呈正相關,提示IFN-γ可能作為促炎性細胞因子參與了AS發病及病情活動。本研究進一步對AS患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中的重要上游節點分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65及末端炎癥因子——IFN-γ檢測結果顯示,與對照組比較,AS手術組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達水平均明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述,TLR4/MyD88非依賴信號通路可能在AS起病及病情活動中起到重要作用。后期將進一步通過免疫組織化學及Western blot等方法檢測AS患者治療前后TLR4/MyD88非依賴信號通路相關分子表達情況,為TLR4/MyD88非依賴信號通路參與AS起病及病情活動提供更充分的證據,從而為治療AS提供新思路。