黃芩苷對(duì)豬源腸外致病性大腸桿菌的體內(nèi)保護(hù)作用

任明星，肖 涌，付書林，宗冰冰，2，3，邱銀生

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，武漢 430023；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430064；3.畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

豬源腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC）是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要病原體之一，會(huì)導(dǎo)致較大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。豬源ExPEC 可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和敗血癥等致命性感染［2，3］。隨著中國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，豬Ex-PEC 的分離率逐年提高。抗生素在臨床上廣泛應(yīng)用于治療ExPEC 引起的感染。研究表明，動(dòng)物體內(nèi)多抗生素大腸桿菌的分離率顯著增加，95.2%的分離株對(duì)至少5 種抗生素具有耐藥性，60.3%的分離株對(duì)10 種以上抗生素具有耐藥性［4］。多重耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)，使預(yù)防和控制其臨床感染變得更困難。然而，目前還沒有能有效地預(yù)防和治療豬ExPEC 菌株感染的措施。

Let U be the signal subspace matrix of covariance matrixSimilarly,there is a unique non-singularmatrix T,which satisfies

黃芩苷是一種從黃芩等藥用植物中分離的黃酮類化合物［5］，具有抗菌、抗炎、抗微生物及抗氧化等藥理作用［6］。研究表明，黃芩苷具有強(qiáng)大的生物活性，并具有重要的生物學(xué)功能，如對(duì)肺、子宮和其他器官具有抗炎、抗氧化和抗癌作用［7，8］，還能夠降低副豬嗜血桿菌毒力，調(diào)控炎癥信號(hào)通路，減弱炎癥反應(yīng)達(dá)到抗菌效果［9，10］。黃芩苷可減輕金黃色葡萄球菌引起的人肺泡上皮A549 細(xì)胞損傷，降低其對(duì)A549 細(xì)胞的黏附，并顯著減弱小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的炎癥反應(yīng)［11］。黃芩苷能顯著降低雞的死亡率和減輕肺組織病理改變，達(dá)到對(duì)禽致病性大腸桿菌（APEC）誘導(dǎo)雞急性肺損傷的保護(hù)作用［12］。黃芩苷可通過干擾QS、生物膜的形成和毒力基因的表達(dá)來降低APEC 感染的雞Ⅱ型肺細(xì)胞的細(xì)胞損傷［13］。黃芩苷可以抑制生物膜的形成，減弱群體感應(yīng)控制的毒力，并增強(qiáng)小鼠模型中銅綠假單胞菌的清除［14］。豬源ExPEC 危害嚴(yán)重且無有效預(yù)防和治療措施，已證明黃芩苷對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和APEC 等多種細(xì)菌的毒力表型具有抑制作用［13-15］。因此，推測黃芩苷在豬源ExPEC 致病過程中發(fā)揮的作用。

本研究選用黃芩苷作為治療藥物，探討黃芩苷在豬源ExPEC 感染小鼠過程中發(fā)揮的作用，探究黃芩苷是否對(duì)豬源ExPEC 感染小鼠具有保護(hù)作用，以期為豬ExPEC 提供了一種新的潛在藥物治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 黃芩苷原料藥92%（生產(chǎn)批號(hào)：C031B180101），購自四川協(xié)力制藥股份有限公司。

菌株：試驗(yàn)用菌株P(guān)CN033，為血清型O11 的強(qiáng)毒株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)譚臣教授饋贈(zèng)，武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株 試驗(yàn)動(dòng)物：五周齡昆明小鼠45 只，雌性，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心，飼養(yǎng)3 d，期間按時(shí)更換墊料，保證充足的飼料和飲水。

存活率試驗(yàn)感染后，稱量并記錄感染后小鼠的體重變化。感染初期（0~24 h），各組小鼠的體重均急劇下降，而黃芩苷治療組體重下降程度相對(duì)于感染組要緩慢；感染中期（24~36 h），各組小鼠的體重基本保持不變；感染中后期（36 h 后），各組小鼠的體重維穩(wěn)，且有一定程度回升（圖1）。黃芩苷在豬源腸外致病性大腸桿菌感染早期，可以減緩小鼠體重下降，但是后期感染組小鼠和治療組小鼠的體重均開始回升。因此，體重變化僅能反映黃芩苷在感染初期對(duì)豬源腸外致病性大腸桿菌感染小鼠的體重下降程度有一定的減緩作用，但是否能達(dá)到最終的保護(hù)效果仍需進(jìn)一步研究。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 存活率試驗(yàn)：隨機(jī)將30 只小鼠分為3 組，每組10 只小鼠，分別為空白對(duì)照組、感染對(duì)照組和50 mg/kg 黃芩苷治療組。組織載菌量試驗(yàn)：隨機(jī)將15 只小鼠分為3 組，每組5 只小鼠，分別為空白對(duì)照組（不感染不給藥）、感染模型組（感染后不給藥）、藥物治療組（感染后給藥）。

1.2.2 存活率試驗(yàn) 飼養(yǎng)3 d 觀察無異常后，進(jìn)行攻毒和藥物處理。采用腹腔感染，細(xì)菌以106CFU 的劑量腹腔接種感染組和治療組小鼠（治療組皮下多點(diǎn)注射黃芩苷），接種同樣劑量PBS 溶液的小鼠作為空白對(duì)照組。觀察并記錄感染后小鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化、采食量變化及存活情況等。

1.2.3 組織載菌量試驗(yàn) 組織載菌量試驗(yàn)（剖檢病變觀察、組織載菌量計(jì)數(shù)、病理切片），感染組和治療組小鼠接種107CFU 的菌液（治療組皮下多點(diǎn)注射黃芩苷），空白組小鼠注射等量PBS 溶液作為對(duì)照。感染6 h 后麻醉小鼠采血（EP 管中提前放入肝素鈉防止凝血），打開其胸腔，進(jìn)行心臟灌流后分離臟器（EP 管中放有1 mL PBS 溶液和滅菌鋼珠），包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟。觀察組織解剖病變后，將取出的臟器部分用于組織載菌量計(jì)數(shù)。經(jīng)稱重、研磨后，取合適稀釋度均勻涂布于LB 固體平板上計(jì)數(shù)，計(jì)算出各菌株在臟器中的含菌量（CFU/g）。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察 取灌流后各臟器的部分組織制備病理切片，將組織浸泡于4%多聚甲醛固定，切片、包埋、染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病變。

歐陽鋒確實(shí)難受。難受得要命。他很想將上半夜發(fā)生的糗事原原本本地告訴妻子，好幾次話到嘴邊又給咽了回去。結(jié)婚兩年，七百多個(gè)日日夜夜，他與呂凌子互尊互愛相敬如賓，連臉都沒紅過一次。現(xiàn)在可好，自己闖了禍，犯了錯(cuò)，木已成舟，鐵證如山，他不知道妻子一旦了解真相會(huì)有什么樣的反應(yīng)，能否原諒自己。就算妻子呂凌子原諒自己，樓下兩口子又豈能善罷甘休？歐陽鋒感覺頭疼得厲害，像是要爆炸了一般。他后悔自己不該去赴約，如果不去赴約，這樣的事情無論如何也不會(huì)落在自己頭上；他更后悔自己不該講那個(gè)黃段子，如果不講那個(gè)黃段子，自己就不會(huì)喝那么多酒，如果不喝那么多酒，自己決不會(huì)進(jìn)錯(cuò)房門上錯(cuò)床，胯下那根該死的玩意也不可能惹事生非……

黃芩苷治療組小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的細(xì)菌計(jì)數(shù)與感染PCN033 的小鼠相比降低。黃芩苷治療后，菌體在小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的定殖能力極顯著下降（P＜0.01）（圖3）。組織載菌量試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷抑制了豬源腸外致病性大腸桿菌在小鼠組織中的定殖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重變化

1.1.3 儀器 全自動(dòng)樣品快速研磨儀購自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LDZX-75L 型立式高壓蒸汽滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-103B 型迷你型多振幅軌道搖床購自上海智城分析儀器制造有限公司；PX224ZH 型電子天平購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；ZRQSVP500 型Millipore-Q 超純水機(jī)購自美國默克有限公司。

2.2 小鼠臨床癥狀及存活率

組織載菌量剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)感染PCN033 的小鼠組織器官有不同程度的病變，且黃芩苷治療后有一定程度好轉(zhuǎn)。感染PCN033 后，心肌纖維溶解甚至消失，炎性細(xì)胞滲出；肝細(xì)胞腫大變形；脾臟炎性細(xì)胞浸潤增多；腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤；與感染PCN033 的小鼠相比，黃芩苷治療組小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟中的病理變化均明顯減少。黃芩苷治療后，小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟的病理變化均明顯減弱，表明黃芩苷治療后，PCN033 感染小鼠后各組織器官產(chǎn)生的病變明顯減弱（圖4）。

在跨文化商務(wù)溝通中，人們總是試圖成功而愉快地進(jìn)行商務(wù)交流。不管買賣交易是否達(dá)成，中國文化中歷來講究買賣不成仁義在，所以在交易時(shí)與對(duì)方意見產(chǎn)生矛盾時(shí)，模糊限制語的使用使得交流能夠和諧進(jìn)行。

圖2 感染組與治療組小鼠存活率

2.3 組織載菌量試驗(yàn)結(jié)果

深度學(xué)習(xí)的本質(zhì)是構(gòu)建一種具有多種隱藏層的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，通過進(jìn)行海量的數(shù)據(jù)訓(xùn)練，獲取具有價(jià)值的特征，最終實(shí)現(xiàn)正確的分類或準(zhǔn)確的預(yù)測[12]。深度學(xué)習(xí)[13]正是通過應(yīng)用基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[14]的學(xué)習(xí)機(jī)器設(shè)備，以日臻智能化的教學(xué)輔助手段，幫助學(xué)習(xí)者在掌握一定認(rèn)知規(guī)律的基礎(chǔ)上進(jìn)行高效度的知識(shí)強(qiáng)化訓(xùn)練，使學(xué)習(xí)者的認(rèn)知能力與學(xué)習(xí)成效得到更為有效的提升。

2.4 組織病理切片試驗(yàn)結(jié)果

感染組和治療組小鼠相對(duì)于對(duì)照組均表現(xiàn)出一定程度的癥狀，如精神萎靡、蜷縮無力、食欲不振等，而治療組小鼠在感染初期與感染組癥狀程度相當(dāng)，24 h 后治療組小鼠相對(duì)于感染組小鼠癥狀有一定程度好轉(zhuǎn)，與體重變化結(jié)果基本一致。感染組小鼠在24 h 出現(xiàn)死亡病例，而黃芩苷治療組小鼠全部存活。黃芩苷治療組小鼠存活率相對(duì)于感染組高10 個(gè)百分點(diǎn)（圖2）。雖然黃芩苷對(duì)豬源腸外致病性大腸桿菌感染的小鼠具有一定的保護(hù)作用，但是單獨(dú)使用黃芩苷治療豬源腸外致病性大腸桿菌并不能達(dá)到很好的治療效果。

其次，這部小說的結(jié)構(gòu)也具有一定的象征意義。福斯特在寫作這部小說時(shí)，將隱喻和轉(zhuǎn)喻兩種修辭手法糅合于整部小說的結(jié)構(gòu)中，因此，《印度之行》這部小說就具有了雙重結(jié)構(gòu)。《印度之行》這部小說結(jié)構(gòu)包括表層結(jié)構(gòu)和深層結(jié)構(gòu)，小說的表層結(jié)構(gòu)是直線型的，這種結(jié)構(gòu)形式能夠促使小說情節(jié)按照時(shí)間順序發(fā)展；小說的深層結(jié)構(gòu)是循環(huán)型的，這種結(jié)構(gòu)形式能夠深化小說的主題，揭示其主題思想。

3 小結(jié)與討論

ExPEC 由于其特殊的毒力因子而區(qū)別于腸內(nèi)致病性大腸桿菌，在腸道定殖卻不致病，而是能夠引起腸外多種組織器官病變［1］。豬源ExPEC 在養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失［1，2］。中國養(yǎng)殖場中豬源Ex-PEC 的分離率逐漸提高，且大多分離株為多重耐藥菌株［4］。因此，迫切需要找尋新的治療方法來解決該問題。

黃芩苷是提取自中藥黃芩的一類黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性。研究表明，黃芩苷在抗炎、抗氧化、抗癌等過程中發(fā)揮重要的作用［7，8］，影響多種細(xì)菌的致病性［16，17］。黃芩苷通過抑制大腸桿菌1 型鞭毛系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，降低黏附能力與遷移能力，抑制生物被膜的形成，使大腸桿菌侵襲能力下降［16］。黃芩苷能夠抑制副豬嗜血桿菌多種毒力基因的表達(dá)，降低其致病性［17］。目前，黃芩苷對(duì)動(dòng)物源ExPEC 致病性的作用研究多集中在APEC，豬源ExPEC 的研究少有報(bào)道。因此，選用黃芩苷為研究對(duì)象，探究黃芩苷對(duì)豬源ExPEC感染小鼠是否具有保護(hù)作用。

豬源ExPEC PCN033 已在豬和小鼠中成功建立感染模型［2，18，19］。小鼠存活率試驗(yàn)結(jié)果表明，在豬源ExPEC 感染小鼠后，可引起明顯的病變。黃芩苷治療后減弱小鼠的臨床病變，減緩小鼠的體重下降趨勢，減弱組織病理損傷，并一定程度上提高了小鼠的存活率，與黃芩苷在APEC 中的研究結(jié)果趨勢一致［12，13］。豬源ExPEC PCN033 已被報(bào)道在感染豬和小鼠后會(huì)引起多組織器官的炎癥病變［2，18，19］。研究表明，黃芩苷能抑制LPS 誘導(dǎo)上皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)來降低炎癥反應(yīng)［20，21］。黃芩苷能夠調(diào)控炎性信號(hào)通路的表達(dá)來控制腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷、抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠空腸炎癥損傷及人單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)［21-24］。為進(jìn)一步探究黃芩苷減弱豬源ExPEC 致病性的機(jī)制，比較黃芩苷治療組和感染組的組織載菌量試驗(yàn)以及組織病理切片。組織載菌量試驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩苷治療后，豬源ExPEC 在小鼠各組織中的定殖能力顯著減弱，病理切片結(jié)果顯示黃芩苷治療后，豬源ExPEC 在小鼠不同器官組織中產(chǎn)生的病理損傷顯著減弱，炎性病變顯著減弱，與之前的研究結(jié)果基本一致［12，21，22］。因此，黃芩苷對(duì)組織損傷的保護(hù)以及最終對(duì)小鼠的保護(hù)作用可能是黃芩苷影響了菌體在組織細(xì)胞中定殖能力，減弱了細(xì)菌的侵襲力。考慮到黃芩苷可通過抑制毒力基因的表達(dá)，減弱大腸桿菌的侵襲力［16］，推測黃芩苷可能通過抑制豬源的毒力因子從而減弱其致病性。結(jié)合黃芩苷在多種細(xì)菌中的抗炎作用［7，8，16］，推測黃芩苷可能是通過抑制相關(guān)炎性信號(hào)通路來降低豬源ExPEC感染后的炎癥反應(yīng)，減輕組織細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到對(duì)組織器官的保護(hù)作用，降低小鼠死亡率。

本研究初步證實(shí)黃芩苷對(duì)豬源ExPEC 的體內(nèi)感染具有保護(hù)作用，黃芩苷抑制豬源ExPEC 致病性的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。